Obtention et décellularisation de membres postérieurs de rat à l’aide d’un bioréacteur ex vivo basé sur la perfusion pour l’allotransplantation composite vascularisée

Nous avons établi un modèle de petit animal pour la décellularisation d’un membre. Ceci est utile pour faciliter la recherche de preuve de concept sur le dé et la recellularisation des tissus composites vascularisés. Les schémas d’immunosuppression sont l’une des principales limites de l’allotransplantation composite vascularisée.

L’immunogénicité tissulaire peut être réduite par la décellularisation. Pour commencer, faites une incision cutanée à l’aide d’une lame chirurgicale numéro 10 le long du ligament inguinal, en passant d’une direction latérale à une direction médiale, tout en tenant la peau environnante avec une pince Adson. Lorsque la graisse sous-jacente est exposée, utilisez une dissection contondante pour disséquer soigneusement la graisse et localiser les vaisseaux épigastriques supérieurs.

À l’aide de micro-ciseaux, disséquez proximale et exposez le nerf fémoral sous-jacent, l’artère et la veine au niveau du ligament inguinal. Au microscope à dissection, identifier les vaisseaux fémoraux et disséquer l’artère et la veine à proximité à l’aide de pinces fines pour obtenir une longueur suffisante à partir des points de bifurcation du réseau artériel. Ensuite, ligaturez la veine fémorale et l’artère séparément en utilisant des sutures 6-0.

Ensuite, effectuez une dissection circonférentielle autour du reste du membre postérieur sans perturber les vaisseaux fémoraux ligaturés et transectez l’os fémoral à mi-longueur à l’aide d’un coupe-os. Pour isoler complètement le membre postérieur, transecter les vaisseaux fémoraux ligaturés distaux aux ligatures à l’aide de micro-ciseaux et canuler l’artère fémorale à l’aide d’un angiocathéter de calibre 24 sous le microscope à dissection. Ensuite, rincer avec une solution saline héparinée jusqu’à ce que l’écoulement clair soit observé de la veine fémorale.

Fixez la canule en attachant une suture autour du récipient canulé dans une autre suture distalement autour de la canule elle-même, en veillant à ce que la canule soit placée à proximité pour éviter de bloquer les points de bifurcation. Ensuite, submerger les membres postérieurs procurés et PBS jusqu’à la décellularisation. Pour construire le bioréacteur, placez la chambre stérilisée et vissez trois robinets d’arrêt à trois voies à usage unique aux lignes d’entrée, de sortie et de réapprovisionnement, en veillant à ce que le robinet d’arrêt de l’orifice de réapprovisionnement soit plafonné à ses deux orifices restants pour éviter les fuites.

Fixez les tubes en silicone préalablement fabriqués aux robinets d’arrêt aux lignes d’entrée et de sortie. Ensuite, connectez le tube péristaltique aux tubes en silicone. Après avoir fixé la cassette sur le tube péristaltique, placez-la sur la pompe péristaltique.

Ensuite, connectez l’un des tubes en silicone à l’extrémité du tube péristaltique de la ligne de sortie à partir de l’étape ci-dessus. À l’autre extrémité, brancher une pipette sérologique d’un millilitre et remettre en suspension l’extrémité fixée avec une pipette sérologique dans le flacon du réservoir de déchets. Ensuite, suspendez l’extrémité du tube fixé à la pipette sérologique dans le réservoir de détergent et scellez immédiatement l’ouverture du réservoir de détergent avec un parafilm.

Ajoutez 0,25% de FDS du pot en verre d’un litre dans la chambre du bioréacteur à mi-chemin. Ensuite, prenez le membre postérieur procuré à l’aide de forceps Adson et suspendez-le soigneusement dans la chambre du bioréacteur. À l’aide de deux paires de forceps Adson, guider la partie canulée du membre postérieur jusqu’à la ligne d’entrée tout en tenant la canule avec une paire de pinces.

Utilisez l’autre paire de pinces pour tordre et fixer la conduite d’entrée à la canule. Une fois fixé, ajoutez plus de FDS 0,25% à partir du pot en verre d’un litre pour submerger complètement le membre au besoin, en veillant à ce que l’orifice de sortie soit également immergé dans le réservoir du bioréacteur et que le débit sortant constant soit maintenu. Ensuite, fixez un filtre à seringue à usage unique à l’orifice de ventilation sur le couvercle de la chambre du bioréacteur et fixez le couvercle sur le bioréacteur, en veillant à ce que la chambre soit scellée de tous les côtés.

Pour éliminer l’air du tube et amorcer le circuit de perfusion, utilisez une nouvelle seringue à usage unique de 10 millilitres pour aspirer le détergent du réservoir de détergent à l’aide d’un robinet d’arrêt à trois voies à la conduite d’entrée. Une fois tiré, utilisez le même fluide à insérer dans le robinet d’arrêt à trois voies à la ligne de sortie. Ensuite, appuyez et fixez les cassettes avec le tube dans la pompe péristaltique.

Ensuite, allumez la pompe péristaltique à l’aide du bouton d’alimentation. Sur l’écran de la pompe péristaltique, passez au deuxième onglet en utilisant la touche fléchée pour régler le taux de perfusion pour le premier canal avec le débit d’entrée comme mode de livraison, et réglez le taux de perfusion à un millilitre par minute, en vous assurant que la direction de l’écoulement est correcte selon la configuration de l’appareil. Calibrer la pompe péristaltique pour s’assurer que la quantité de liquide délivrée par la conduite d’entrée et/ou prélevée dans la conduite de sortie s’écoule de manière constante entre les deux, en veillant à ce que l’ID du tube soit réglé à 1,85 millimètre.

Commencez la décellularisation par perfusion de la machine à raison d’un millilitre par minute pour les lignes d’entrée et de sortie en appuyant sur le bouton d’alimentation du clavier. Surveiller et s’assurer que le débit est continu aux lignes d’entrée et de sortie. En utilisant 1 litre de 0,25% STS, reconstituer le réservoir du bioréacteur par le port de réapprovisionnement au besoin.

Ensuite, recherchez un aspect translucide blanc du tissu, qui apparaîtra au cinquième jour, indiquant une décellularisation des membres postérieurs du rat. Après la confirmation de la décellularisation, remplacer le réservoir de détergent par le PBS et le réservoir antibiotique-antimycotique à 1%, et sceller l’ouverture du flacon avec un parafilm. Commencez PBS et 1% de perfusion antibiotique-antimycotique à un millilitre par minute, et continuez pendant deux jours.

Remplacez le PBS et le réservoir antibiotique-antimycotique à 1% par 200 millilitres d’acide parasite à 0,1%, réservoir d’éthanol à 4% et commencez la perfusion à un millilitre par minute pendant deux heures. Sous une enceinte de biosécurité, débranchez le membre postérieur de la conduite d’entrée à l’aide de deux paires de pinces Adson stériles avec une paire de pinces pour tordre la conduite d’entrée, et l’autre tenant la canule, en veillant à ce que la canule ne soit pas tirée pour empêcher la décanulation. Conservez le membre dans un bocal en verre de 500 millilitres contenant du PBS et 1% d’antibiotique-antimycotique à 4 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure.

L’artère fémorale et la veine décellularisées ont montré une perte de contenu nucléaire dans toutes les couches et le tissu conjonctif environnant, étant donné l’absence de noyaux colorés en bleu autrement présents dans les vaisseaux natifs. La tunique intima media et l’adventice de la veine fémorale et des artères ont été maintenues dans les vaisseaux décellularisés. Le nerf fémoral a montré la préservation de la structure des tissus, y compris l’endoneurium.

L’os a montré une rétention structurelle globale avec perte de noyaux colorés d’ostéocytes et des couches environnantes d’endosteum et de périoste après la décellularisation. La peau a montré une perte de cellules de l’épiderme et du derme. Le derme présentait des fibres de collagène retenues similaires aux tissus cutanés natifs.

Enfin, la vue transversale du muscle squelettique a montré la perte de noyaux autrement situés dans les périphéries de l’endomysium. La teneur en myofibrilles est restée conservée dans les fascicules respectifs après la décellularisation. La quantification de l’ADN à l’aide de PicoGreen a également été effectuée, où la teneur en ADN a été considérablement réduite dans les vaisseaux fémoraux, les nerfs, la peau, les muscles et les os.

En suivant ce protocole, le membre décellularisé peut être caractérisé davantage. Cela implique d’examiner la matrice extracellulaire à l’aide de méthodes histologiques et biochimiques, et d’évaluer vasculaire à l’aide de l’imagerie. La tige décellularisée peut également être recellularisée à l’aide de cellules spécifiques aux tissus.