Name: Obtention et décellularisation de membres postérieurs de rat à l’aide d’un bioréacteur ex vivo basé sur la perfusion pour l’allotransplantation composite vascularisée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Découvrez la décellularisation de membres postérieurs de rat par perfusion ex vivo au SDS pour l'ingénierie tissulaire vasculaire. Cette méthode réduit l'immunogénicité et améliore les perspectives de transplantation composite.

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La figure 3A a été créée en BioRender.com.

Des rats Lewis mâles cadavériques (300 à 430 g) obtenus de l’Institut de recherche de l’Hôpital général de Toronto ont été utilisés pour toutes les expériences. Pour toutes les interventions chirurgicales, des instruments et des fournitures stériles ont été utilisés pour maintenir la technique aseptique (voir le tableau des matériaux). Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux lignes directrices du Comité de protection des animaux de l’Institut de recherche de l’Hôpital général de Toronto, Réseau universitaire de santé (Toronto, ON, Canada). Au total, quatre membres postérieurs ont été décellularisés.
1. Préparation préchirurgicale
<ol><li>Préparer 50 ml de solution saline héparinée à 5 %. Dans un sac de solution saline de 50 mL, prélever 2,5 mL de solution saline à l’aide d’une seringue de 5 ml et jeter. À l’aide d’une seringue de 5 mL, ajouter 2,5 mL d’héparine dans le sac salin. Retourner le sac salin pour mélanger son contenu.</li>
	<li>Placez un rat cadavérique en décubitus dorsal sous un coussin bleu. Rasez circonférentiellement le membre postérieur et l’aine à l’aide d’un rasoir électrique et enlevez les poils.</li>
	<li>Amenez le rat au poste chirurgical et appliquez la solution de gommage à l’iode de povidone à l’aide d’une gaze sur le membre postérieur et la région de l’aine. Par la suite, appliquez de l’alcool isopropylique à 70% pour essuyer la solution de gommage à l’aide de gaze.</li>
	<li>Jetez le tampon bleu de l’étape 1.2 et changez-le en nouveaux gants stériles.</li>
</ol>2. Obtention de membres postérieurs de rat
<ol><li>Faites une incision cutanée à l’aide d’une lame chirurgicale #10 et d’un glisseur de lame #3 le long du ligament inguinal, en passant d’une direction latérale à une direction médiale (Figure 1A). Utilisez des pinces Adson pour maintenir la peau environnante afin d’assurer une incision en douceur.</li>
	<li>Lorsque la graisse sous-jacente est exposée, utilisez une dissection émoussée pour disséquer soigneusement la graisse. Localisez les vaisseaux épigastriques supérieurs.</li>
	<li>Utilisez des microciseaux pour disséquer proximally et exposer le nerf fémoral sous-jacent, l’artère et la veine au niveau du ligament inguinal.</li>
	<li>Au microscope à dissection, identifier les vaisseaux fémoraux et disséquer l’artère et la veine de façon proximale à l’aide de pinces fines pour obtenir une longueur suffisante à partir des points de bifurcation du réseau artériel (figure 1B).</li>
	<li>Litruer l’artère fémorale et la veine séparément à l’aide de sutures 6-0.</li>
	<li>Effectuer une dissection circonférentielle autour du reste du membre postérieur sans perturber les vaisseaux fémoraux ligaturés.</li>
	<li>Transecter l’os fémoral à mi-longueur à l’aide d’un coupe-os.</li>
	<li>Pour isoler complètement le membre postérieur, transectez les vaisseaux fémoraux ligaturés sous les ligatures à l’aide de microciseaux.</li>
	<li>Canuler l’artère fémorale à l’aide d’un angiocathéter de 24 G au microscope à dissection. Utilisez une pince fine pour insérer la canule avec précaution. Rincer avec une solution saline héparinée jusqu’à ce que l’écoulement de la veine fémorale soit clair.</li>
	<li>Fixez la canule en attachant une suture autour du récipient canulé et une autre suture distalement autour de la canule elle-même. Assurez-vous que la canule est placée à proximité pour éviter de bloquer les points de bifurcation.</li>
	<li>Immerger les membres postérieurs obtenus dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) jusqu’à la décellularisation.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64069/64069fig01.jpg"> Figure 1 : Prélèvement d’un membre postérieur de rat. (A) Marquage de l’incision cutanée au niveau du ligament inguinal du latéral au médial. (B) Vue de la veine fémorale et de l’artère fémorale, qui ont été disséquées proximale vers le ligament inguinal, indiquée par la ligne pointillée. Abréviations : L = latéral; M = médiane; FV = veine fémorale; FA = artère fémorale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64069/64069fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
3. Préparation des solutions
<ol><li>Dans une fiole en verre de 6 L, préparer un réservoir de détergent de 5 L de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,25 % en dissolvant 12,5 g de poudre de SDS dans 5 L d’eau distillée ultrapure. Couvrir l’ouverture de la fiole avec un parafilm pour la sceller.</li>
	<li>Dans un bocal en verre de 1 L, préparer 1 L de solution de SDS à 0,25% séparément en dissolvant 2,5 g de SDS dans 1 L d’eau distillée ultrapure. Ajouter une barre d’agitation pour mélanger la solution sur un agitateur magnétique jusqu’à ce que toute la FDS soit dissoute.</li>
	<li>Préparer 1 L de 1x solution de lavage PBS avec 1% Solution Antimycotique (AA) antibiotique. Dans une fiole de 1 L, ajouter 990 mL de 1x solution de PBS et 10 mL d’AA.</li>
	<li>Séparément, dans un bocal en verre de 500 mL, préparer à nouveau 1x PBS + 1% de solution AA en utilisant 495 mL de 1x solution de PBS et 5 mL d’AA.</li>
	<li>Préparer 200 mL de solution d’acide peracétique (AAP) à 1 % et d’éthanol à 4 % (EtOH). Préparez cette solution sous une hotte.</li>
</ol>4. Construction de bioréacteurs et de circuits de perfusion
REMARQUE : Reportez-vous à la figure 2 pour connaître la configuration du bioréacteur et du circuit de perfusion tout au long des étapes indiquées.
<ol><li>Dans une chambre de 500 ml (contenant en plastique), percez trois trous (1/4 po) aux emplacements indiqués à la figure 2 : Le port A est la ligne d’entrée, le port B est la ligne de réapprovisionnement et le port C est la ligne de sortie. Retirez et jetez l’excès de plastique. Vaporiser et essuyer la chambre avec de l’éthanol à 70%.</li>
	<li>Coupez trois tubes en silicone de 5 cm de long et insérez-en un à mi-chemin dans chaque orifice de la chambre. Connectez un connecteur Luer mâle sur l’ouverture du port A face à l’intérieur de la chambre et un connecteur Luer femelle à l’autre extrémité du tube à l’extérieur de la chambre.</li>
	<li>Connectez un connecteur Luer femelle aux ports B et C aux extrémités des tubes orientés vers l’extérieur de la chambre.</li>
	<li>Dans un couvercle hermétique pour le récipient en plastique, percez un trou sur la surface du couvercle.</li>
	<li>Coupez un tube en silicone de 3 cm et insérez-le dans le trou du couvercle. Assurez-vous qu’environ 2 cm du tube sont situés hors du couvercle, comme le montre la figure 2.</li>
	<li>Stérilisez la chambre et le couvercle avec le tube.</li>
	<li>Couper deux tubes en silicone de 30 cm à l’aide de ciseaux. Connectez un 1/16 in à un connecteur 1/8 in à une extrémité de chaque tube.</li>
	<li>Couper séparément deux tubes en silicone de 12 cm à l’aide de ciseaux. Connectez un 1/16 in à un connecteur 1/8 in à une extrémité des deux tubes. Connectez un connecteur Luer mâle à l’autre extrémité d’un tube et un connecteur Luer femelle à l’autre tube.</li>
	<li>Stériliser tout le matériau de tubulure des étapes 4.7 et 4.8. Inclure deux tubes de pompe à 3 arrêts (1,85 mm) dans la stérilisation.</li>
	<li>Préparez trois robinets d’arrêt à 3 voies, un filtre à seringue, deux pipettes sérologiques de 1 ml et une seringue de 10 ml pour la configuration de la décellularisation. Retirez le filtre des pipettes sérologiques de 1 mL.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64069/64069fig02.jpg"> Figure 2 : Préparation du bioréacteur et construction du circuit de perfusion. Appareil représenté du circuit de perfusion comprenant (A) pompe péristaltique et (B) cassettes correspondantes pour les conduites d’entrée et de sortie. (C, D) Des tubes en silicone de 12 cm et 30 cm sont également présentés avec les connecteurs respectifs. E) Tubes pour pompe péristaltique (1,85 mm). Chambre du bioréacteur avec orifices marqués pour (F) l’entrée, (G) l’orifice de réapprovisionnement et (H) l’écoulement sortant. (I) Couvercle du bioréacteur avec orifice de ventilation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64069/64069fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
5. Décellularisation des membres postérieurs du rat
<ol><li>Placez la chambre stérilisée et vissez sur trois robinets d’arrêt à 3 voies à usage unique au niveau des conduites d’entrée, de sortie et de réapprovisionnement. Assurez-vous que le robinet d’arrêt de l’orifice de réapprovisionnement est bouché à ses deux orifices restants pour éviter les fuites.</li>
	<li>Fixer les tubes fabriqués à l’étape 4.8 aux robinets d’arrêt aux lignes d’entrée et de sortie.</li>
	<li>Connectez le tube péristaltique aux tubes à l’étape ci-dessus. Fixez la cassette sur le tube péristaltique et placez-la sur la pompe péristaltique. Ne fixez pas encore les cassettes avec le tube en place.</li>
	<li>Connectez un tube de l’étape 4.7 à l’extrémité du tube péristaltique de la ligne de sortie à partir de l’étape supérieure. Branchez une pipette sérologique de 1 mL à l’autre extrémité. Suspendre l’extrémité fixée à l’aide d’une pipette sérologique dans la fiole du réservoir de déchets.</li>
	<li>Répétez l’étape 4.7 pour la ligne d’entrée. Suspendre l’extrémité du tube fixé à la pipette sérologique dans le réservoir de détergent. Sceller immédiatement l’ouverture du flacon réservoir de détergent avec un parafilm. Voir la figure 3A,B pour un aperçu du circuit de décellularisation.</li>
	<li>Ajouter 0,25 % de SDS du bocal en verre de 1 L (étape 3.2) dans la chambre du bioréacteur à mi-chemin.</li>
	<li>Prenez le membre postérieur procuré à l’aide d’une pince Adson et suspendez-le soigneusement dans la chambre du bioréacteur.</li>
	<li>Utilisez deux paires de pinces Adson pour guider la partie canulée du membre postérieur jusqu’à la ligne d’entrée. Tout en tenant la canule avec une paire de pinces, utilisez l’autre paire de pinces pour tordre et fixer la conduite d’entrée à la canule. Assurez-vous que la canule n’est pas tirée ou tordue pour empêcher la décanulation.</li>
	<li>Une fois fixé, ajoutez plus de FDS à 0,25% du bocal en verre de 1 L pour submerger complètement le membre, au besoin. S’assurer que l’orifice de sortie est également immergé dans le réservoir du bioréacteur pour s’assurer que le débit sortant constant est maintenu (figure 3C).</li>
	<li>Fixer un filtre à seringue à usage unique à l’orifice de ventilation situé sur le couvercle de la chambre du bioréacteur, en se référant aux étapes 4.4 et 4.5.</li>
	<li>Fixez le couvercle du bioréacteur et assurez-vous que la chambre est scellée de tous les côtés (figure 3B).</li>
	<li>Pour éliminer l’air des tubes et amorcer le circuit de perfusion, utilisez une nouvelle seringue à usage unique de 10 ml pour aspirer le détergent du réservoir de détergent à l’aide du robinet d’arrêt à 3 voies à la conduite d’entrée.</li>
	<li>Une fois tiré, utilisez le même fluide à insérer dans le robinet d’arrêt à 3 voies à la ligne de sortie. Assurez-vous qu’il y a du détergent présent dans tout le tuyau aux lignes d’entrée et de sortie.</li>
	<li>Appuyez et fixez les cassettes avec le tube dans la pompe péristaltique. Allumez la pompe péristaltique à l’aide du bouton d’alimentation.<ol><li>Sur l’écran de la pompe péristaltique, passez au deuxième onglet à l’aide de la touche fléchée pour définir le taux de perfusion du premier canal. Débit d’entrée comme mode de livraison et régler le débit de perfusion à 1 mL/min. S’assurer que le sens d’écoulement est correct en fonction de la configuration de l’appareil. Répétez l’opération pour le deuxième canal.</li>
		<li>Calibrer la pompe péristaltique pour s’assurer que la quantité de liquide fournie par la conduite d’entrée et/ou prélevée dans la conduite de sortie s’écoule à un rythme constant entre les deux. Assurez-vous que l’ID du tube est réglé sur 1,85 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Commencez la décellularisation par perfusion de la machine à 1 mL/min pour les lignes d’entrée et de sortie en appuyant sur le bouton d’alimentation du clavier. Surveiller et s’assurer que le débit est constant et continu aux lignes d’entrée et de sortie.</li>
	<li>Poursuivre la décellularisation et surveiller quotidiennement. Utilisez la FDS de 1 L de 0,25 % (étape 3.2) pour réapprovisionner le réservoir du bioréacteur par l’orifice de réapprovisionnement, au besoin. Recherchez un aspect blanc et translucide du tissu, qui apparaîtra au jour 5, indiquant la décellularisation des membres postérieurs du rat.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64069/64069fig03.jpg"> Figure 3 : Vue d’ensemble du circuit du bioréacteur de décellularisation de perfusion du membre postérieur du rat. (A) Représentation schématique du circuit de perfusion du bioréacteur. Les flèches bleues indiquent la direction du flux de détergent et de déchets. (B) Vue d’ensemble du circuit de décellularisation avec bioréacteur contenant le membre postérieur du rat. Le réservoir SDS (flacon gauche) mène à la pompe péristaltique et au tube d’entrée du bioréacteur. Le débit sortant est relié au réservoir de déchets (fiole droite) par la pompe péristaltique. (C) (I) Bioréacteur contenant un membre postérieur de rat avec tube d’admission relié à l’artère fémorale canulée. (II) Port de réapprovisionnement situé dans le coin pour la perfusion du détergent. (III) Tubes de sortie suspendus dans le réservoir en suspension. Abréviation : FDS = dodécylsulfate de sodium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64069/64069fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
6. Lavage et stérilisation post-décellularisation
<ol><li>Après la confirmation de la décellularisation, remplacez le réservoir de détergent par le réservoir 1x PBS + 1% AA. Sceller l’ouverture de la fiole avec un parafilm. Commencez 1x PBS + 1% de perfusion AA à 1 mL / min et continuez pendant 2 jours.</li>
	<li>Remplacer le réservoir 1x PBS + 1% AA par 200 mL de réservoir 0,1% PAA/4% EtOH et commencer la perfusion à 1 mL/min pendant 2 h.</li>
	<li>Déconnectez le membre postérieur de la ligne d’entrée à l’aide de deux paires de pinces Adson stériles, avec une paire de pinces pour tordre la ligne d’entrée et l’autre tenant la canule. Assurez-vous que la canule n’est pas tirée pour empêcher la décanulation.</li>
	<li>Conservez le membre dans un bocal en verre de 500 ml contenant 1x PBS + 1% AA à 4 °C jusqu’à nouvelle utilisation.</li>
</ol>

<ol><li>Kueckelhaus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+composite+allotransplantation%3A+Current+standards+and+novel+approaches+to+prevent+acute+rejection+and+chronic+allograft+deterioration%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration.</a> Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).</li>
<li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+a+human+face+graft%3A+The+matrix+of+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Bioengineering a human face graft: The matrix of identity.</a> Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+skin%2Fadipose+tissue+flap+matrix+for+engineering+vascularized+composite+soft+tissue+flaps%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps.</a> Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).</li>
<li>Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+implications+for+extracellular+matrix-based+technologies+in+vascularized+composite+allotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation.</a> Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).</li>
<li>Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+rat+hind+limb+transplant+as+an+experimental+model+of+vascularized+composite+allotransplantation%3A+Approaches+and+advantages%5BTitle%5D)+AND+%22SAGE+Open+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages.</a> SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871(2020).</li>
<li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterilization+and+disinfection+methods+for+decellularized+matrix+materials%3A+Review%2C+consideration+and+proposal%5BTitle%5D)+AND+%22Bioactive+Materials%22%5BJournal%5D)">Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal.</a> Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).</li>
<li>Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+decellularized+liver+scaffolds+and+recellularized+liver+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts.</a> Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).</li>
<li>Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+generation+of+bioreactors+that+advance+extracellular+matrix+modelling+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering.</a> Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).</li>
<li>Cohen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascular+chimerism+within+donor+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of vascular chimerism within donor organs.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13437(2021).</li>
<li>Lupon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+composite+allografts+using+natural+scaffolds%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).</li>
<li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularised+skeletal+muscles+allow+functional+muscle+regeneration+by+promoting+host+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8398(2018).</li>
<li>Jank, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+composite+tissue+as+a+bioartificial+limb+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft.</a> Biomaterials. 61, 246-256 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Les membres postérieurs du rat sont utiles comme modèles expérimentaux dans VCA5. L’ingénierie tissulaire des échafaudages acellulaires représente la première étape pour remédier aux lacunes des schémas d’immunosuppression à long terme associés à l’ACV. L’utilisation de greffons composites pose un défi supplémentaire compte tenu de la présence de plusieurs tissus, chacun ayant des propriétés fonctionnelles, immunogènes et structurelles uniques. Le présent protocole montre une méthode efficace pour...

L’AVC est une option émergente pour les patients nécessitant une reconstruction chirurgicale complexe. Les lésions traumatiques ou les résections tumorales entraînent une perte de tissu volumétrique qui peut être difficile à reconstruire. VCA offre la transplantation de plusieurs tissus tels que la peau, les os, les muscles, les nerfs et les vaisseaux sous forme de greffe composite d’un donneur à un receveur1. Malgré sa nature prometteuse, l’ACV est limitée en raison des régimes immunosuppresseurs à long terme. L’utilisation à vie de ces médicaments augmente le risque d’infections opportunistes, de tumeurs malignes et de toxicité pour les organes terminaux 1,2,3. Pour aider à réduire et / ou éliminer le besoin d’immunosuppression, les échafaudages d’ingénierie tissulaire utilisant des approches de décellularisation pour VCA sont très prometteurs.
La décellularisation tissulaire consiste à conserver la structure de la matrice extracellulaire tout en éliminant le contenu cellulaire et nucléaire. Cet échafaudage décellularisé peut être repeuplé avec des cellules spécifiques au patient4. Cependant, la préservation du réseau ECM de tissus composites est un défi supplémentaire. Cela est dû à la présence de plusieurs types de tissus avec des densités, des architectures et des emplacements anatomiques variables dans un échafaudage. Le présent protocole propose une technique chirurgicale et une méthode de décellularisation pour un membre postérieur de rat. Il s’agit d’un modèle de preuve de concept pour appliquer cette technique d’ingénierie tissulaire aux tissus composites. Cela peut également inciter à des efforts ultérieurs pour régénérer les tissus composites par recellularisation.

<table><tbody><tr><td>Chlorure de sodium injectable à 0,9 % USP 50 mL</td><td>Baxter Corporation</td><td>JB1308M</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipettes sérologiques jetables</td><td>VWR</td><td>75816-102</td><td></td></tr><tr><td>Seringues jetables</td><td></td><td></td> de 10 cc <td>Obtenues d’un institut de recherche</td></tr><tr>Robinet <td></td><td></td><td>d’arrêt à 3 voies</td><td>Obtenu d’un institut de recherche</td></tr><tr><td>Seringues jetables</td><td></td><td></td> <td>de 5 ccObtenu de l’Institut de recherche</td></tr><tr><td>70 % Alcool</td><td></td><td></td> isopropylique <td>Obtenu de l’Institut de recherche</td></tr><tr><td>Filtre à seringue Acrodisc 0.2 &micro ; m</td><td>VWR</td><td>CA28143-310</td><td></td></tr><tr><td>Pince Adson, droite</td><td>Outils de science fine</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Angiocathéter 24 G 19 mm (&frac34 ; &rdquo;)&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>38112</td><td></td></tr><tr><td>Solution antibiotique-antimycosique (100x) 100 mL</td><td>Multicell</td><td>450-115-EL</td><td></td></tr><tr><td>Bone Cutter</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>12029-12</td><td></td></tr><tr><td>Connecteurs pour tubes de 1/16 » à 1/8 »</td><td>McMasterCarr</td><td>5117K52</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur Luer vers ardillon femelle (PVDF) - 1/8 » ID</td><td>McMasterCarr</td><td>51525K328</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>Outils de science fine</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine à pointes micro-émoussées</td><td>Outils de science fine</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Injection d’héparine sodique 10 000 UI/10 mL</td><td>LEO Pharma Inc.</td><td>006174-09</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur Luer mâle vers ardillon (PVDF) - 1/8" ID</td><td>McMasterCarr</td><td>51525K322</td><td></td></tr><tr><td>Micro Porte-aiguille</td><td>WLorenz</td><td>04-4125</td><td></td></tr><tr><td>Microciseaux</td><td>WLorenz</td><td>SP-4506</td><td></td></tr><tr><td>Acide peracétique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>269336-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique, 3 canaux</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-78001-68</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate 1x 500 mL</td><td>Wisent</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>Solution de gommage</td><td></td><td></td> chirurgical à la povidone <td>obtenue à partir d’un institut de recherche</td></tr><tr><td>Tube de pompe, 3 arrêts, tube de pompe Tygon E-LFL</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-96450-40</td><td></td></tr><tr><td>, silicone durci au platine</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-96410-16</td><td></td></tr><tr><td>Lame de scalpel - #10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Manche de scalpel - #3&nbsp ;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de dodécylsulfate de sodium Grade : Pureté : >99 %, 1 kg</td><td>Bioshop</td><td>SDS003.1</td><td></td></tr><tr><td>Suture chirurgicale #6-0</td><td>Covidien</td><td>VS889</td><td></td></tr></tbody></table>

obtention et décellularisation de membres postérieurs de rat à l’aide d’un bioréacteur ex vivo basé sur la perfusion pour l’allotransplantation composite vascularisée

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Les patients présentant des lésions traumatiques graves et une perte de tissu nécessitent une reconstruction chirurgicale complexe. L’allotransplantation composite vascularisée (ACV) est une voie reconstructive évolutive pour le transfert de plusieurs tissus en tant que sous-unité composite. Malgré la nature prometteuse de l’ACV, les besoins immunosuppresseurs à long terme constituent une limitation importante en raison du risque accru de tumeurs malignes, de toxicité pour les organes terminaux et d’infections opportunistes. L’ingénierie tissulaire des échafaudages composites acellulaires est une alternative potentielle pour réduire le besoin d’immunosuppression. Ici, l’obtention d’un membre postérieur de rat et sa décellularisation ultérieure à l’aide de dodécylsulfate de sodium (SDS) sont décrites. La stratégie d’approvisionnement présentée est basée sur l’artère fémorale commune. Un système de bioréacteur à perfusion automatique a été construit et utilisé pour la décellularisation ex vivo du membre postérieur. Une décellularisation réussie de la perfusion a été réalisée, ce qui a donné un aspect blanc translucide du membre postérieur. Un réseau vasculaire intact et perfusable dans tout le membre postérieur a été observé. Les analyses histologiques ont montré l’élimination du contenu nucléaire et la préservation de l’architecture tissulaire dans tous les compartiments tissulaires.

Le protocole d’approvisionnement a permis d’isoler et de canuler les artères fémorales communes pour les étapes de perfusion subséquentes. Les images de dissection représentatives de la figure 1A, B montrent l’emplacement de l’incision et l’exposition des vaisseaux fémoraux à une distance suffisante des points de bifurcation. La figure 2 montre l’appareil nécessaire à la préparation du bioréacteur et du circuit de perfusion. Le critère d’évaluat...

Nous décrivons la technique chirurgicale et le processus de décellularisation des membres postérieurs composites du rat. La décellularisation est réalisée à l’aide de dodécylsulfate de sodium à faible concentration à l’aide d’un système de perfusion machine ex vivo .

Obtention et décellularisation de membres postérieurs de rat à l’aide d’un bioréacteur ex vivo basé sur la perfusion pour l’allotransplantation composite vascularisée

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

Nous avons établi un modèle de petit animal pour la décellularisation d’un membre. Ceci est utile pour faciliter la recherche de preuve de concept sur le dé et la recellularisation des tissus composites vascularisés. Les schémas d’immunosuppression sont l’une des principales limites de l’allotransplantation composite vascularisée.L’immunogénicité tissulaire peut être réduite par la décellularisation. Pour commencer, faites une incision cutanée à l’aide d’une lame chirurgicale numéro 10 le long du ligament inguinal, en passant d’une direction latérale à une direction médiale, tout en tenant la peau environnante avec une pince Adson. Lorsque la graisse sous-jacente est exposée, utilisez une dissection contondante pour disséquer soigneusement la graisse et localiser les vaisseaux épigastriques supérieurs.À l’aide de micro-ciseaux, disséquez proximale et exposez le nerf fémoral sous-jacent, l’artère et la veine au niveau du ligament inguinal. Au microscope à dissection, identifier les vaisseaux fémoraux et disséquer l’artère et la veine à proximité à l’aide de pinces fines pour obtenir une longueur suffisante à partir des points de bifurcation du réseau artériel. Ensuite, ligaturez la veine fémorale et l’artère séparément en utilisant des sutures 6-0.Ensuite, effectuez une dissection circonférentielle autour du reste du membre postérieur sans perturber les vaisseaux fémoraux ligaturés et transectez l’os fémoral à mi-longueur à l’aide d’un coupe-os. Pour isoler complètement le membre postérieur, transecter les vaisseaux fémoraux ligaturés distaux aux ligatures à l’aide de micro-ciseaux et canuler l’artère fémorale à l’aide d’un angiocathéter de calibre 24 sous le microscope à dissection. Ensuite, rincer avec une solution saline héparinée jusqu’à ce que l’écoulement clair soit observé de la veine fémorale.Fixez la canule en attachant une suture autour du récipient canulé dans une autre suture distalement autour de la canule elle-même, en veillant à ce que la canule soit placée à proximité pour éviter de bloquer les points de bifurcation. Ensuite, submerger les membres postérieurs procurés et PBS jusqu’à la décellularisation. Pour construire le bioréacteur, placez la chambre stérilisée et vissez trois robinets d’arrêt à trois voies à usage unique aux lignes d’entrée, de sortie et de réapprovisionnement, en veillant à ce que le robinet d’arrêt de l’orifice de réapprovisionnement soit plafonné à ses deux orifices restants pour éviter les fuites.Fixez les tubes en silicone préalablement fabriqués aux robinets d’arrêt aux lignes d’entrée et de sortie. Ensuite, connectez le tube péristaltique aux tubes en silicone. Après avoir fixé la cassette sur le tube péristaltique, placez-la sur la pompe péristaltique.Ensuite, connectez l’un des tubes en silicone à l’extrémité du tube péristaltique de la ligne de sortie à partir de l’étape ci-dessus. À l’autre extrémité, brancher une pipette sérologique d’un millilitre et remettre en suspension l’extrémité fixée avec une pipette sérologique dans le flacon du réservoir de déchets. Ensuite, suspendez l’extrémité du tube fixé à la pipette sérologique dans le réservoir de détergent et scellez immédiatement l’ouverture du réservoir de détergent avec un parafilm.Ajoutez 0,25% de FDS du pot en verre d’un litre dans la chambre du bioréacteur à mi-chemin. Ensuite, prenez le membre postérieur procuré à l’aide de forceps Adson et suspendez-le soigneusement dans la chambre du bioréacteur. À l’aide de deux paires de forceps Adson, guider la partie canulée du membre postérieur jusqu’à la ligne d’entrée tout en tenant la canule avec une paire de pinces.Utilisez l’autre paire de pinces pour tordre et fixer la conduite d’entrée à la canule. Une fois fixé, ajoutez plus de FDS 0,25% à partir du pot en verre d’un litre pour submerger complètement le membre au besoin, en veillant à ce que l’orifice de sortie soit également immergé dans le réservoir du bioréacteur et que le débit sortant constant soit maintenu. Ensuite, fixez un filtre à seringue à usage unique à l’orifice de ventilation sur le couvercle de la chambre du bioréacteur et fixez le couvercle sur le bioréacteur, en veillant à ce que la chambre soit scellée de tous les côtés.Pour éliminer l’air du tube et amorcer le circuit de perfusion, utilisez une nouvelle seringue à usage unique de 10 millilitres pour aspirer le détergent du réservoir de détergent à l’aide d’un robinet d’arrêt à trois voies à la conduite d’entrée. Une fois tiré, utilisez le même fluide à insérer dans le robinet d’arrêt à trois voies à la ligne de sortie. Ensuite, appuyez et fixez les cassettes avec le tube dans la pompe péristaltique.Ensuite, allumez la pompe péristaltique à l’aide du bouton d’alimentation. Sur l’écran de la pompe péristaltique, passez au deuxième onglet en utilisant la touche fléchée pour régler le taux de perfusion pour le premier canal avec le débit d’entrée comme mode de livraison, et réglez le taux de perfusion à un millilitre par minute, en vous assurant que la direction de l’écoulement est correcte selon la configuration de l’appareil. Calibrer la pompe péristaltique pour s’assurer que la quantité de liquide délivrée par la conduite d’entrée et/ou prélevée dans la conduite de sortie s’écoule de manière constante entre les deux, en veillant à ce que l’ID du tube soit réglé à 1,85 millimètre.Commencez la décellularisation par perfusion de la machine à raison d’un millilitre par minute pour les lignes d’entrée et de sortie en appuyant sur le bouton d’alimentation du clavier. Surveiller et s’assurer que le débit est continu aux lignes d’entrée et de sortie. En utilisant 1 litre de 0,25% STS, reconstituer le réservoir du bioréacteur par le port de réapprovisionnement au besoin.Ensuite, recherchez un aspect translucide blanc du tissu, qui apparaîtra au cinquième jour, indiquant une décellularisation des membres postérieurs du rat. Après la confirmation de la décellularisation, remplacer le réservoir de détergent par le PBS et le réservoir antibiotique-antimycotique à 1%, et sceller l’ouverture du flacon avec un parafilm. Commencez PBS et 1% de perfusion antibiotique-antimycotique à un millilitre par minute, et continuez pendant deux jours.Remplacez le PBS et le réservoir antibiotique-antimycotique à 1% par 200 millilitres d’acide parasite à 0,1%, réservoir d’éthanol à 4% et commencez la perfusion à un millilitre par minute pendant deux heures. Sous une enceinte de biosécurité, débranchez le membre postérieur de la conduite d’entrée à l’aide de deux paires de pinces Adson stériles avec une paire de pinces pour tordre la conduite d’entrée, et l’autre tenant la canule, en veillant à ce que la canule ne soit pas tirée pour empêcher la décanulation. Conservez le membre dans un bocal en verre de 500 millilitres contenant du PBS et 1% d’antibiotique-antimycotique à 4 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure.L’artère fémorale et la veine décellularisées ont montré une perte de contenu nucléaire dans toutes les couches et le tissu conjonctif environnant, étant donné l’absence de noyaux colorés en bleu autrement présents dans les vaisseaux natifs. La tunique intima media et l’adventice de la veine fémorale et des artères ont été maintenues dans les vaisseaux décellularisés. Le nerf fémoral a montré la préservation de la structure des tissus, y compris l’endoneurium.L’os a montré une rétention structurelle globale avec perte de noyaux colorés d’ostéocytes et des couches environnantes d’endosteum et de périoste après la décellularisation. La peau a montré une perte de cellules de l’épiderme et du derme. Le derme présentait des fibres de collagène retenues similaires aux tissus cutanés natifs.Enfin, la vue transversale du muscle squelettique a montré la perte de noyaux autrement situés dans les périphéries de l’endomysium. La teneur en myofibrilles est restée conservée dans les fascicules respectifs après la décellularisation. La quantification de l’ADN à l’aide de PicoGreen a également été effectuée, où la teneur en ADN a été considérablement réduite dans les vaisseaux fémoraux, les nerfs, la peau, les muscles et les os.En suivant ce protocole, le membre décellularisé peut être caractérisé davantage. Cela implique d’examiner la matrice extracellulaire à l’aide de méthodes histologiques et biochimiques, et d’évaluer vasculaire à l’aide de l’imagerie. La tige décellularisée peut également être recellularisée à l’aide de cellules spécifiques aux tissus.

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Obtention et décellularisation de membres postérieurs de rat à l’aide d’un bioréacteur ex vivo basé sur la perfusion pour l’allotransplantation composite vascularisée

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