Visualisation de la localisation subcellulaire d’une protéine dans le cœur à l’aide de l’immunomarquage médié par les points quantiques suivi de la microscopie électronique à transmission

Déterminer la localisation subcellulaire d’une protéine est essentiel pour délimiter son bon fonctionnement et les mécanismes impliqués dans celle-ci. Cette méthode peut nous aider à visualiser la localisation subcellulaire d’une protéine au niveau de l’ultrastructure. L’immunomarquage médié par les points quantiques est plus stable, résistant au photoblanchiment, a ses propres spectres d’émission, produit une densité électronique élevée et affiche une efficacité et une rétention plus élevées sur les tissus avec une meilleure pénétration dans les tissus.

Plusieurs étapes du processus, c’est-à-dire la fixation, la gravure, le blocage et la concentration optimale des points quantiques, sont des étapes difficiles à optimiser. Il est conseillé d’essayer plusieurs points temporels et concentrations des réactifs utilisés. Un autre défi est la manipulation des grilles pour lesquelles seule la patience et, bien sûr, la pratique fonctionnent.

Chowdhury Abdullah, boursier postal, Naznin Remex, un étudiant diplômé de mon laboratoire, et Brandon Hartman, superviseur de la microscopie électronique de nos services de microscopie électronique, feront la démonstration de la procédure. Après avoir anesthésié les souris et ouvert la cavité thoracique, abondez le cœur en utilisant du glutaraldéhyde glacé à 3% dans 0,1 molaire de tampon cacodylate de sodium pendant deux minutes. Utilisez une aiguille de calibre 25 de cinq pouces sur huit pouces pour introduire les fixateurs dans le cœur en utilisant la pression de gravité.

Immédiatement après que le cœur commence à se remplir avec le fixateur, soulevez l’apex du cœur pour soulager la pression. Coupez les récipients en dessous à un à deux millimètres du cœur et laissez les liquides s’écouler. Disséquez le cœur.

Retirez les oreillettes et déposez les ventricules dans une boîte de Petri contenant 3% de glutaraldéhyde glacé et 0,1 molaire de cacodylate de sodium. Faites une coupe papillon après 30 à 60 minutes de fixation et replacez le ventricule dans la boîte de Pétri. Hacher le cœur à l’aide d’une lame chirurgicale en petits cubes d’un millimètre cube.

Fixez et immergez le tissu cardiaque disséqué dans une solution de glutaraldéhyde et de cacodylate pendant 24 heures à quatre degrés Celsius. Après 24 heures de fixation, laver le tissu dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 molaire deux fois pendant 20 minutes. Retirer le tissu du tampon cacodylate de sodium et le plonger dans une solution de tétroxyde d’osmium à 2 % pendant quatre heures à température ambiante.

Après osmication, immerger le tissu dans une solution d’acétate de sodium à 2% pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, immergez le tissu dans une solution d’acétate d’uranyle à 2% pendant une heure à température ambiante. Après coloration à l’acétate d’uranyle, déshydrater le tissu séquentiellement à travers les alcools gradués et l’acétone.

Incorporer le tissu déshydraté dans de la résine époxy à faible viscosité comme décrit dans le manuscrit. Mettez le tissu dans de la résine fraîche dans des micromoules de huit millimètres et durcissez le tissu incrusté à 70 degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir trouvé la zone d’intérêt, à l’aide d’un couteau ultra 45 degrés, produisez des sections ultraminces en or pâle.

Placez ces sections ultraminces sur le côté terne d’une grille de cuivre de 200 mailles. Commencez la coloration en démasquant l’antigène en mettant 20 microlitres de métaperiodate de solution de gravure sur un film de paraffine propre. Placez la grille séchée avec des sections de tissu sur la gouttelette de la solution de gravure.

Laisser la grille de section sur la solution pendant 30 minutes à température ambiante. Lavez les sections de tissu gravées en les plaçant sur une gouttelette d’eau distillée pendant 60 secondes. Bloquer les aldéhydes résiduels en plaçant la grille de section sur une gouttelette de solution de glycine 0,05 molaire pendant 10 minutes à température ambiante.

Éponger les bords de la grille sur du papier filtre pour éliminer la solution résiduelle de glycine. Placer la grille de section dans 10 à 20 microlitres de solution bloquante pendant 25 minutes à température ambiante. Éponger les bords de la grille sur du papier filtre et placer les sections de la grille sur un diluant d’anticorps pour le conditionnement à température ambiante pendant 10 minutes.

Incuber les sections de grille avec des anticorps primaires pendant une heure 30 minutes dans une chambre humidifiée. Sécher la grille par éponge et laver les sections de la grille avec un diluant d’anticorps deux fois pendant cinq minutes chacune. Incuber les sections de grille avec un anticorps secondaire biotinylé pendant une heure dans une chambre humidifiée.

Une fois la grille séchée par étalage, laver les sections de la grille avec un diluant d’anticorps deux fois pendant cinq minutes chacune. Incuber les sections de grille dans un QD conjugué à la streptavidine disponible dans le commerce pendant une heure dans une chambre à température ambiante. Prévenez l’exposition à la lumière en recouvrant la chambre de papier d’aluminium.

Après avoir séché les bords de la grille à l’aide de papier filtre, lavez les sections de la grille en les plaçant sur des gouttelettes d’eau pendant deux minutes et épongez les bords de la grille pour les faire sécher. Insérez le porte-échantillon dans la colonne du microscope et enclenchez l’interrupteur de la pompe pour évaluer le goniomètre, puis insérez complètement le porte-échantillon dans la colonne du microscope. Concentrez-vous bien sur la zone souhaitée.

Capturez l’image à l’aide d’un appareil photo numérique haute vitesse et enregistrez le fichier au format tif. Les membranes mitochondriales, les lysosomes et l’interface mitochondriale de la membrane du réticulum endoplasmique ou du réticulum sarcoplasmique ont montré la présence de points quantiques marqués par Sigmar1. Les coupes cardiaques ont été visualisées à l’aide d’immunoglobuline G de lapin et de points quantiques comme contrôle isotype de l’anticorps primaire anti-Sigmar1 chez le lapin.

Une chose importante à considérer tout en travaillant sur ce protocole est de démasquer le temps pour l’antigène. Si les sections de tissu sont gravées trop longtemps, la solution de métaperiodate créera des perforations dans les sections minces de tissus. Le marquage quantique médié par points attire de plus en plus l’attention dans la détection des tumeurs, le profilage moléculaire et immunitaire des tumeurs et l’imagerie tissulaire, ouvrant une nouvelle voie au diagnostic médical.

Les points quantiques sont également utiles dans le traitement des tumeurs via des thérapies photodynamiques et des anomalies ophtalmiques en délivrant des médicaments aux yeux.