Name: Étude des méthodes à faible coût pour mesurer la durée de vie et la durée de vie à Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Découvrez des méthodes économiques pour mesurer la durée de vie et la santé chez Caenorhabditis elegans. Ce protocole utilise la synchronisation par javel et l'évaluation de la locomotion pour étudier le vieillissement.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

G.G. est soutenu par T32AG052374 et R.H.S. est soutenu par R00AG065200 du National Institute on Aging. Nous remercions la CCG (financée par le NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) pour les souches.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

La durée de vie, définie plus simplement comme la durée de vie, est un phénomène binaire clair dans la plupart des organismes - soit un organisme est vivant ou ne l’est pas. Cependant, la longévité n’est pas toujours en corrélation avec la santé d’un organisme. Par exemple, les modèles d’hormèse mitochondriale où l’exposition au stress mitochondrial augmente considérablement la durée de vie sont généralement parmi les animaux ayant la plus longue durée de vie, mais présentent un retard de croissance et une diminution de la fonction métabolique37,54. De même, les animaux présentant des réponses au stress du réticulum endoplasmique hyperactif présentent également certains comportements et phénotypes qui peuvent être corrélés à une diminution de la santé, malgré une amélioration spectaculaire de l’homéostasie des protéines et de la durée de vie36,49. Enfin, de nombreux paradigmes de longévité dans les organismes modèles, y compris l’augmentation de la fonction HSF-155, l’augmentation de la fonction XBP-156 et la modification de la signalisation FoxO57, sont tous corrélés à un risque accru de cancer, et il est indiscutable qu’une durée de vie prolongée n’est pas bénéfique si un organisme est dans une lutte constante contre le cancer et d’autres maladies de santé. Par conséquent, la longévité ne peut pas être une mesure autonome en biologie du vieillissement.
Ainsi, le concept de healthspan a été un domaine en pleine croissance dans la biologie du vieillissement. La durée de santé, vaguement définie comme la période de la vie où l’on est en bonne santé, est plus difficile à déterminer que la longévité. Cependant, contrairement à la longévité, le concept de « santé » est compliqué, car il existe de nombreuses lectures différentes de la santé de l’organisme: au niveau de l’organisme, il y a la fonction / force musculaire, la fonction neuronale / cognitive, la santé reproductive, etc.; au niveau cellulaire, il y a l’homéostasie des protéines, l’homéostasie des lipides, l’homéostasie du glucose, le métabolisme, etc. En 2014, les biologistes du vieillissement ont définitivement caractérisé les caractéristiques biologiques du vieillissement avec la définition structurée qu’il doit s’agir de quelque chose qui se décompose naturellement pendant le vieillissement et peut être modifié expérimentalement de sorte que l’exacerbation expérimentale devrait accélérer le vieillissement et l’intervention expérimentale devrait ralentir le vieillissement. Ces neuf caractéristiques du vieillissement comprennent l’instabilité génomique, l’attrition des télomères, les altérations épigénétiques, la perte d’homéostasie des protéines (protéostase), l’épuisement des cellules souches, la signalisation intercellulaire altérée, le dysfonctionnement mitochondrial, la détection des nutriments dérégulée et la sénescence cellulaire58. Depuis lors, de nombreuses études soutiennent que d’autres facteurs devraient être inclus, y compris les protéines extracellulaires et la physiologie systémique telles que l’immunité et l’inflammation59. En fin de compte, la définition complexe de la durée de santé exige que la santé de l’organisme soit mesurée à l’aide de plusieurs méthodes différentes.
Par conséquent, dans ce manuscrit, plusieurs méthodes sont présentées pour mesurer divers aspects de la durée de santé à l’aide du modèle de nématode, C. elegans. Nous testons le comportement locomoteur à l’aide de tests de battement, la santé reproductive en utilisant le nombre d’œufs et la taille de la couvée, et la sensibilité au stress. En effet, le comportement locomoteur est une méthode de référence pour mesurer la durée de santé, car les organismes présentent une perte significative de motilité et de mouvement au cours du vieillissementde 51 ans. La perte du comportement locomoteur peut être attribuée à de multiples caractéristiques du vieillissement, car la fonction musculaire chez C. elegans dépend de la protéostase60 appropriée, du dysfonctionnement mitochondrial61 et de la signalisation neurone-muscle62. Bien que ce manuscrit se concentre sur une mesure du comportement locomoteur, il est important de noter qu’il existe de nombreuses autres méthodes, notamment la motilité des animaux sur une plaque de gélose solide, la réponse au toucher51 et les tests de chimiotaxie63. Cependant, ces méthodes nécessitent généralement des appareils d’enregistrement plus sophistiqués, l’utilisation d’un logiciel de suivi des vers ou l’utilisation de produits chimiques coûteux, dangereux ou volatils, qui peuvent tous être prohibitifs dans certains contextes de recherche.
En outre, les tests pour le nombre d’œufs et la taille du couvain sont présentés comme une méthode de mesure de la santé génésique et comme la méthode la plus simple pour mesurer la division cellulaire chez les vers adultes, car les vers adultes sont post-mitotiques et seules les cellules germinales et les embryons subissent une division cellulaire dans un ver adulte64. En tant que mesure de la division cellulaire, la santé reproductive peut être pertinente pour les caractéristiques de vieillissement de la sénescence cellulaire et de l’épuisement des cellules souches. La santé reproductive peut être affectée par de nombreux facteurs, y compris l’infection pathogène65 ou l’exposition au stress49, bien qu’il n’y ait pas de corrélation directe entre la santé reproductive et la longévité. En fait, certains animaux à longue durée de vie présentent une diminution significative de la taille de couvée49, et il est même possible qu’il existe une corrélation inverse entre la longévité et la taille de couvée50. Ce n’est pas un phénomène spécifique à C. elegans, car des effets néfastes de la reproduction sur la longévité ont longtemps été observés chez l’homme66, les chiens de compagnie67 et les souris68. Néanmoins, nous fournissons le nombre d’œufs et la taille des couvées comme une méthode fiable et peu coûteuse pour mesurer la santé reproductive avec la mise en garde que la santé reproductive peut ne pas être corrélée avec la longévité ou la durée de vie.
Enfin, les tests de survie sont proposés comme mesure indirecte de la santé de l’organisme. Il est important de noter que les réponses au stress cellulaire, y compris la réponse au stress thermique69 et au stressER 35, diminuent rapidement au cours du processus de vieillissement et ont une pertinence directe avec la marque de vieillissement de la protéostasie70,71. En revanche, les réponses hyperactives au stress peuvent augmenter considérablement la durée de vie en favorisant la résilience au stress 35,37,38. Bien que cette étude se concentre sur les méthodes les plus simples et les moins coûteuses, il existe un grand nombre de méthodes alternatives pour les tests de résistance au stress pour la thermotolérante41 et le stress oxydatif66, chacune nécessitant un ensemble différent d’équipements et de consommables. Au-delà des simples études d’exposition aux facteurs de stress, d’autres méthodes physiologiques peuvent être réalisées en fonction de l’accès à l’équipement. Par exemple, un analyseur de flux extracellulaire peut surveiller la fonction mitochondriale et la respiration cellulaire73; les microscopes à dissection fluorescente permettront de mesurer les rapporteurs transcriptionnels pour l’activation de la réponse au stress20; et des microscopes composés ou confocaux à haute résolution peuvent être utilisés pour mesurer la morphologie des organites avec des sondes fluorescentes pour les mitochondries74, le réticulum endoplasmique 75,76 et le cytosqueletted’actine 77.
Comme dernier avertissement pour les mesures de la longévité, bien que des méthodes chimiques et génétiques de stérilisation des vers soient proposées pour réduire considérablement les coûts, il est important de noter que les deux peuvent avoir un impact direct sur la durée de vie. Par exemple, l’exposition au FUDR a déjà eu un impact sur la durée de vie et la thermotolérabilité45. Et bien que le mutant glp-4(bn2) lui-même n’ait pas d’effets directs sur la durée de vie, la croissance à 25 °C est un léger stress thermiquede 33,34 et peut donc avoir un impact sur la durée de vie2. Il existe d’autres méthodes pour stériliser C. elegans, y compris la stérilité médiée par l’auxine78 ou d’autres mutants déficients en spermatozoïdes sensibles à la température79. Cependant, toutes les méthodes ont quelques mises en garde, et il faut prendre soin d’utiliser le test le moins préjudiciable pour les besoins scientifiques de chaque laboratoire. Une dernière limite des études de longévité est la variabilité potentielle qui peut se produire en raison de la faible taille des échantillons ou simplement d’une erreur objective de l’investigateur. Cela peut être contourné car de nouvelles technologies naissent dans les technologies de durée de vie automatisée80, mais encore une fois, ces systèmes sont coûteux et nécessitent des équipements et des compétences en ingénierie et en informatique. En fin de compte, la collection de méthodes fournies ici est un ensemble fiable d’outils qui peuvent être rapidement adaptés et appris dans presque toutes les institutions et fournissent une base solide pour la biologie du vieillissement.

Depuis la publication de 'The genetics of Caenorhabditis elegans', l’un des articles les plus influents de Sydney Brenner en 1974, ce ver microscopique a été considéré comme un système modèle exceptionnel pour étudier les mystères biologiques1. En 1977, Michael R. Klass a publié la méthode de mesure de la durée de vie de C. elegans et a établi ce système modèle pour étudier le vieillissement2. L’étude visant à comprendre la relation entre le stress et la longévité a commencé avec l’identification d’une seule mutation dans le gène de l’âge 1, ce qui a entraîné une prolongation de la durée de vie chez C. elegans3. En outre, des études contemporaines ont identifié d’autres mutations augmentant la durée de vie, qui ont révélé des vers mutants à longue durée de vie qui présentent une résistance accrue au stress 4,5,6. Avec ses nombreux avantages, notamment une courte durée de vie, un entretien facile, un génome complètement séquencé contenant l’homologie d’environ deux tiers de tous les gènes pathogènes humains, la disponibilité et la facilité d’utilisation des bibliothèques d’interférence ARN (ARNi) et la similitude physiologique avec les humains 7,8,9, C. elegans a rapidement été adopté comme un modèle exceptionnel pour la biologie du stress et du vieillissement.
Les plus grands avantages de C. elegans sont peut-être son coût d’entretien extrêmement faible, sa facilité d’expérimentation et la variété des outils génétiques disponibles pour les études. C. elegans est généralement cultivé sur un milieu d’agar solide avec une source de nourriture E. coli. Deux souches d’E. coli couramment utilisées sont OP50 standard, une souche B qui est peut-être la10 la plus couramment utilisée, et HT115, une souche K-12 qui est principalement utilisée pour les expériences d’ARNi11,12. La souche HT115 K-12 porte une délétion dans la RNAIII RNase, une mutation essentielle pour les méthodes aRNi, où des plasmides exprimant l’ARNd correspondant à des gènes individuels de C. elegans sont utilisés. Les vecteurs d’alimentation de l’ARNd permettent d’éliminer de manière robuste les gènes de C. elegans sans avoir besoin de croisements complexes ou d’édition du génome, car les bactéries porteuses de ces plasmides peuvent être directement nourries aux nématodes. Des milliers de ces vecteurs d’ARNi bactériens existent dans le contexte HT115, y compris la bibliothèque d’ARNi Vidal la plus populaire avec >19 000 constructions d’ARNi individuelles13 et la bibliothèque d’ARNi Ahringer avec 16 757 constructions d’ARNi14. Cependant, les régimes bactériens OP50 et HT115 présentent des différences majeures dans le profil métabolique, y compris des différences dans la vitamineB12 15,16. Par conséquent, il est recommandé d’effectuer toutes les expériences sur une seule source de bactéries, si possible, pour éviter les interactions gènes-régime alimentaire qui peuvent introduire de multiples facteurs de confusion comme décrit précédemment 17,18,19. En raison de sa facilité, les animaux sont maintenus sur OP50 pour toutes les conditions expérimentales décrites ici, mais toutes les expériences sont effectuées sur HT115 comme décrit précédemment20. En bref, les animaux sont maintenus à OP50 et transférés au HT115 après la synchronisation (après blanchiment) pour assurer la cohérence entre les expériences aRNi et non ARNi. Alternativement, une souche OP50 compétente en ARNi portant une délétion similaire de l’ARNIII RNase trouvée dans la souche E. coli K12 HT115 peut également être utilisée21.
Peut-être qu’une limitation majeure aux expériences d’ARNi chez C. elegans est le souci de l’efficacité de l’arête. Bien que l’efficacité de l’élimination puisse être validée via la qPCR ou le Western Blotting, ceux-ci nécessitent un équipement et des réactifs coûteux et se limitent à l’analyse en vrac. C’est encore plus préoccupant en regardant des cellules spécifiques, telles que les neurones, qui sont réfractaires (moins sensibles) à l’ARNi. Bien que l’efficacité de l’ARNi dans des cellules spécifiques puisse être améliorée par la surexpression de SID-1, la protéine transmembranaire essentielle à l’absorption de l’ARNd22, cela se limite toujours aux modèles d’expression spécifiques au type cellulaire des promoteurs utilisés pour ces constructions, et donc les knockouts et les mutations des gènes sont le moyen le plus infaillible d’épuiser les fonctions des gènes. Au-delà de l’élimination médiée par l’ARNi, C. elegans se prête également très bien à l’édition du génome avec des stratégies basées sur CRISPR 23,24,25 et à la surexpression de construction transgénique par microinjections, avec la possibilité d’intégrer des constructions transgéniques par irradiation ou intégration basée sur des transposons 26,27,28,29 . Cependant, ces méthodes nécessitent un équipement de micro-injection coûteux, et le coût élevé des ARN guides ou de l’enzyme Cas9 peut interdire ces méthodes dans les institutions à financement limité. Au lieu de cela, des milliers de lignées transgéniques et de mutants sont facilement disponibles pour quelques dollars à la fois au Caenorhabditis Genetics Center (CGC) et au National Bioresource Project (NBRP). Le NBRP propose des mutants isolés pour un grand nombre de gènes de C. elegans, y compris des souches mutantes publiées et donc vérifiées, des mutants dérivés de projets pilotes et des mutants qui n’ont pas encore été caractérisés. En revanche, la CCG est un dépositaire de lignes C. elegans principalement publiées et établies du milieu de la recherche. Les deux expédient des souches dans le monde entier à des tarifs très raisonnables et offrent une grande variété d’options pour ceux qui ont une capacité limitée à synthétiser des souches en interne.
Ici, une collection de méthodes organisées est proposée, qui sont susceptibles d’être les méthodes les moins coûteuses pour tester la durée de vie et la durée de vie chez C. elegans. Toutes les méthodes présentées ici nécessitent de l’équipement et des fournitures à faible coût et n’utilisent que des souches facilement disponibles auprès de la CCG. Peut-être le plus prohibitif pour les tests de longévité et de survie chez C. elegans est le coût des plaques de milieu de croissance des nématodes (NGM). Étant donné que C. elegans est hermaphrodite et autofertilisant, les tests de survie standard exigent que les animaux adultes soient continuellement éloignés de leur progéniture pour éviter la contamination par la progéniture. Non seulement ce processus prend du temps, mais il peut devenir coûteux en raison de la nécessité d’environ 100 plaques par condition pour exécuter un seul test de durée de vie. Ici, deux alternatives sont proposées : l’utilisation du mutant sans lignée germinale sensible à la température, le glp-4(bn2), ou la stérilisation chimique à l’aide de la 5-fluoro-2'-désoxyuridine (FUDR). glp-4 code pour une synthétase d’ARNt valyl aminoacyle, et les glp-4(bn2) sensibles à la température sont déficients en matière de reproduction à des températures restrictives en raison de la diminution de la traduction des protéines30,31. FUDR est une méthode robuste pour stériliser chimiquement C. elegans en empêchant la réplication de l’ADN, inhibant ainsi la reproduction32. Bien que le FUDR puisse être d’un coût prohibitif pour certains laboratoires, seule une petite quantité est nécessaire pour stériliser chimiquement les vers, et sa stabilité sous forme de poudre peut le rendre réalisable pour la plupart des groupes. L’utilisation du mutant glp-4(bn2) sensible à la température est certainement l’option la moins chère, car la seule exigence est un incubateur pour déplacer les animaux vers les 25 ° C restrictifs; cependant, il convient de noter qu’une croissance à 25 °C peut provoquer un léger stress thermique33,34. Quelle que soit la méthode, l’utilisation d’animaux stériles peut réduire considérablement les coûts des consommables nécessaires aux tests liés à l’âge.
Pour étudier le vieillissement, les tests de durée de vie standard sont conventionnels car les paradigmes qui modifient la longévité ont des impacts directs sur le vieillissement. Cependant, les mesures de la durée de vie et de la tolérance au stress présentent des informations supplémentaires sur la santé de l’organisme. Ici, plusieurs méthodes sont proposées pour mesurer la durée de la santé: 1) la fécondité en tant que mesure de la santé reproductive; 2) la taille du couvain comme mesure de la santé du développement et de la viabilité de la progéniture pondue; et 3) le comportement locomoteur en tant que mesure de la fonction musculaire et de la motilité, qui sont tous deux directement corrélés au vieillissement. De plus, des tests de tolérance au stress sont proposés: survie au stress ER, stress mitochondrial / oxydatif et survie au stress thermique. En effet, les animaux ayant une résistance accrue au stress ER35,36, au stress mitochondrial37 et au stress thermique38 présentent une durée de vie accrue. Le stress ER est appliqué en exposant C. elegans à la tunicamycine, qui bloque la glycosylation liée à l’azote et provoque l’accumulation de protéines mal repliées39. Le stress mitochondrial/oxydatif est induit par l’exposition au paraquat, qui induit la formation de superoxyde spécifiquement dans les mitochondries40. Le stress thermique est appliqué par l’incubation des animaux à 34-37 °C33,41. Tous les tests décrits ici peuvent être effectués avec un minimum d’équipement et de fonds, et offrent une variété d’outils pour étudier le vieillissement dans divers groupes.

<table><tbody><tr><td>APEX IPTG</td><td>Genesee</td><td>18-242</td><td>pour ARNi</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>90000-764</td><td>pour plaques NGM</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>VWR</td><td>97064-330</td><td>pour plaques NGM</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>pour plaques NGM</td></tr><tr><td>Carbenicilline</td><td>VWR</td><td>76345-522</td><td>pour ARNi</td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>VWR</td><td>80057-932</td><td>pour plaques NGM</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td>solvant pour médicaments</td></tr><tr><td>LB Bouillon VWR</td><td></td><td>95020-778</td><td>pour LB</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté</td><td>VWR</td><td>97062-132</td><td>pour plaques NGM, M9</td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>36541</td><td>pour stress oxydatif/mitochondrial</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>VWR</td><td>97061-566</td><td>pour l’eau de Javel Soluton</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique</td><td>VWR</td><td>EM-PX1570-2</td><td>pour plaques NGM</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>VWR</td><td>EM-PX1565-5</td><td>pour</td></tr><tr><td>M9 S7E Lunette de dissection</td><td>Leica</td><td>10450840</td><td>Microscope de dissection standard</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>VWR</td><td>EM-SX0420-5</td><td>pour plaques NGM, M9</td></tr><tr><td>Hypochlorite de sodium</td><td>VWR</td><td>RC7495.7-32</td><td>pour solution d’eau de Javel</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>VWR</td><td>71003-472</td><td>pour chlorhydrate de</td></tr><tr><td>tétracycline</td> M9 <td>VWR</td><td>97061-638</td><td>pour l’ARNi</td></tr><tr><td>Tunicamycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7765-50MG</td><td>pour le stress RE</td></tr></tbody></table>

Étude des méthodes à faible coût pour mesurer la durée de vie et la durée de vie à caenorhabditis elegans

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

La découverte et le développement de Caenorhabditis elegans en tant qu’organisme modèle ont eu une influence en biologie, en particulier dans le domaine du vieillissement. De nombreuses études historiques et contemporaines ont identifié des milliers de paradigmes altérant la durée de vie, y compris les mutations génétiques, l’expression des gènes transgéniques et l’hormèse, une exposition bénéfique et de bas grade au stress. Avec ses nombreux avantages, y compris une courte durée de vie, une maintenance facile et peu coûteuse, et un génome entièrement séquencé avec homologie à près des deux tiers de tous les gènes humains, C. elegans a rapidement été adopté comme un modèle exceptionnel pour la biologie du stress et du vieillissement. Ici, plusieurs méthodes standardisées sont étudiées pour mesurer la durée de vie et la durée de vie qui peuvent être facilement adaptées à presque tous les environnements de recherche, en particulier ceux avec un équipement et des fonds limités. L’incroyable utilité de C. elegans est présentée, soulignant la capacité d’effectuer de puissantes analyses génétiques en biologie du vieillissement sans avoir besoin d’une infrastructure étendue. Enfin, les limites de chaque analyse et les approches alternatives sont discutées pour examen.

Caenorhabditis elegans est un excellent système modèle avec des méthodes robustes et peu coûteuses pour étudier la durée de vie, la durée de vie et la résilience au stress.

Étude des méthodes à faible coût pour mesurer la durée de vie et la durée de vie à Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Ce protocole présente les méthodes les moins coûteuses et les moins techniques pour servir le vieillissement dans les elegans de mer. Un organisme modèle influent en biologie du vieillissement. Le plus grand avantage de ces méthodes est la facilité de mise en œuvre, en utilisant des équipements et du matériel à faible coût.Les rendre accessibles à tout chercheur, peu importe son expérience ou le financement disponible. Comme une étude sur le vieillissement ancien, il existe une variabilité naturelle de la santé au sein des populations. Par conséquent, il est essentiel que les expériences soient effectuées sur des animaux en bonne santé, bien nourris et étroitement synchronisés.Pour assurer l’invalidité de déchirure Commencez la préparation d’un milieu de croissance de nématode d’un litre ou d’une plaque de tarière NGM. Ajouter 2,5 grammes de pep tone, 3,0 grammes de chlorure de sodium et 20 grammes de tarière dans une fiole d’un litre avec une barre d’agitation et ajouter de l’eau distillée à un volume final de 970 millilitres. Stériliser la solution de tarière NGM dans une fiole d’un litre à l’aide d’un autoclave standard ou d’un stérilisateur à fluides.Et laissez la solution remuer jusqu’à ce qu’elle refroidisse à 60 à 75 degrés Celsius. Pendant que la solution refroidit, chauffer un bain de perles à 65 à 70 degrés Celsius. Une fois que la solution de tarière NGM refroidit à 60 à 75 degrés Celsius.Ajouter les additifs liquides et laisser la solution se mélanger complètement pendant cinq minutes. Plongez ensuite le ballon dans un bain de billes à 65 à 70 degrés Celsius pour empêcher le fluide de se solidifier en versant dans la plaque. Pipeter neuf à 11 millilitres de la solution dans chaque plaque de 60 millilitres.Lorsque vous avez terminé, replacez la pipette dans la solution chauffée pour maintenir la température et empêcher tout fluide de se solidifier dans la pipette. Répétez la procédure pour toutes les plaques et laissez les plaques NGM a se solidifier pendant la nuit. Une fois solidifiés, utilisez-les pour ensemencer les plaques avec des bactéries ou stockez les plaques dans des récipients scellés jusqu’à trois mois à quatre degrés Celsius pour synchroniser les vers par blanchiment.Recueillir les nématodes en versant une petite quantité de solution M9 sur une assiette contenant les vers sans trop remplir la boîte de Pétri. Ensuite, agitez doucement la solution M nine pour détacher les vers des pelouses bactériennes. Ensuite, collectez les vers gravides adultes dans un tube de 15 millilitres avec une pipette sérologique.Éviter de percer la tarière avec l’embout de la pipette. Engraisser les animaux par centr pendant 30 secondes à 1100 fois G, et aspirer le surnageant. Ajouter cinq millilitres de la solution de blanchiment fraîchement préparée à la pastille de ver et vérifier les vers au microscope à dissection toutes les quelques minutes avec agitation vigoureuse intermittente jusqu’à ce que tous les corps de vers adultes soient dissous et qu’il ne reste que des œufs dans le mélange.Ensuite, granulez les œufs en faisant tourner le mélange d’eau de Javel pendant 30 secondes à 1100 fois G et aspirez la solution de blanchiment. Ensuite, lavez les œufs granulés en ajoutant jusqu’à 15 millilitres de solution M9 et en inversant le tube quatre ou cinq fois pour disperser les œufs et la solution. Encore une fois, centrifuger le tube pendant 30 secondes à 1100 fois G pour granuler les œufs et aspirer la solution de M9.Effectuez le lavage quatre fois pour éliminer tout agent de blanchiment du mélange d’œufs. Après le quatrième lavage, la centrifusion aspire la solution M9 de 100 microlitres à deux millilitres en fonction du nombre total de vers blanchis. Bien agiter les œufs pour briser les touffes et s’assurer que les œufs sont complètement remis en suspension dans la solution M9.Alternativement, les animaux peuvent être arrêtés pour une synchronisation temporelle plus étroite en ajoutant 10 à 12 millilitres de solution M9 à la pastille d’œuf dans un tube chronique de 15 millilitres. Laissez les vers tourner dans un rotateur jusqu’à 24 heures à 20 degrés Celsius. Pour approximer l’œuf ou L, une pipette à concentration quatre microlitres du mélange d’œufs sur une plaque NGM assise avec des bactéries.Ensuite, comptez et calculez les œufs présents par microlitre de milieu. Répéter le comptage trois ou quatre fois pour améliorer l’approximation, en fonction de la plaque d’approximation, du nombre approprié d’œufs ou de L un animaux arrêtés sur la plaque de tarière NGM ensemencée avec des bactéries de votre choix. Mesurer le comportement locomotive des vers par battage.Déplacer un petit nombre de vers adultes du premier jour d’une plaque de tarière NGM sur 10 à 20 microlitres de solution M9 sous une lunette de dissection. Ensuite, concentrez-vous sur un ver à la fois et comptez le nombre de fois que le spécimen passe d’une formation concave à une formation convexe en 15 secondes. Utilisez un compteur manuel et une minuterie et répétez la procédure pour 10 à 15 vers.Vieillissez les vers à l’âge désiré et répétez les mesures de battage à tous les âges souhaités. Comme visualisé, les vers plus anciens battent à des vitesses nettement plus lentes. Pour les mesures de quantité et de fertilité.Chez 10 à 15 vers Caenorhabditis elegans, distinguer L quatre vers dans une plaque tarière NGM séparée ensemencée avec des bactéries de choix. Laissez les animaux grandir pendant la nuit à 20 degrés Celsius et assurez-vous qu’un lot d’assiettes nouvellement ensemencé est prêt pour le lendemain. Pour mesurer la quantité d’œufs pondus par Caenorhabditis elegans, transférez les vers adultes dans une lame de tarière NGM fraîche ensemencée avec cette bactérie pillée toutes les 12 à 24 heures pendant sept à huit jours ou jusqu’à ce que les œufs ne soient plus visibles et comptez le nombre d’œufs pondus sur les assiettes.Pour mesurer la taille du couvain de Caenorhabditis elegans, transférer les vers adultes sur une plaque à vis sans fin NGM fraîche ensemencée de bactéries toutes les 12 à 24 heures, ou sept à huit jours ou jusqu’à ce que la progéniture ne soit plus visible. Conservez toutes les assiettes contenant des œufs à 20 degrés Celsius. Deux jours après le transfert des vers.Comptez la descendance développée dans l’assiette. Comptez tous les vers vivants et en développement au stade L quatre ou plus tôt pour vous assurer que la génération F deux ne confond pas les résultats. Retirez tous les vers de l’assiette au fur et à mesure qu’ils sont comptés.Entretenez les plaques pendant un à deux jours supplémentaires avant de les noter à nouveau pour vous assurer que les animaux dont l’éclosion ou le développement est retardé ne sont pas manqués. L’effet de la méthode de stérilisation sur la durée de vie des nématodes sauvages de type N2 a montré que les changements dans la durée de vie des vers cultivés sur les plaques de vis sans fin NGM étaient similaires à ceux des vers cultivés sur les plaques FUDR de vis sans fin NGM ou aux quatre animaux mutants BN2 cultivés sur les plaques de vis sans fin NGM. L’animal renversé par la FMC a connu une baisse significative de sa durée de vie pour toutes les conditions.Une diminution substantielle du nombre d’œufs pondus et de la taille du couvain a été observée chez les animaux de type HSF par rapport aux témoins de type sauvage. Certains animaux HSF une surexpression présentaient une stérilité totale, ce qui indique que la santé reproductive peut être inversement corrélée à la longévité. Le taux de battage a fourni une méthode fiable pour mesurer la santé au cours du vieillissement, mesurée par une diminution significative du battement chez les animaux âgés par rapport aux jeunes.La survie au stress sont des tests fiables pour mesurer la santé des organismes, la tunicamycine qui provoque un stress du réticulum a entraîné une durée de vie réduite quelle que soit la concentration par rapport au contrôle du DMSO. Les niveaux élevés de paraquat ont considérablement raccourci la durée de vie tandis que de faibles concentrations de paraquat ont augmenté la durée de vie en raison de l’effet hormétique. Dans les essais de thermotolérance, la surexpression de HSF one a augmenté la tolérance thermique à 37 degrés Celsius pour toutes les expériences de durée de vie et de vieillissement.Il est important de se rappeler que les techniques de stérilisation peuvent avoir un effet pléiotropique sur la santé des organismes, ce qui a un impact sur les résultats. De nombreuses approches supplémentaires et complémentaires existent pour mesurer la durée de santé si l’équipement et l’infrastructure sont disponibles, y compris les mesures de la transcription, de l’agrégation des protéines de traduction, de l’organite, de la morphologie et des fonctions métaboliques.

surveying-low-cost-methods-to-measure-lifespan-healthspan

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Dans cet article nous présentons un protocole général pour la mesure de la durée de vie des nématodes maintenu sur un support solide avec UV-tué alimentaire bactérienne.

Mesure Caenorhabditis elegans</emDurée de vie> sur des milieux solides

Dans ce protocole, nous présentons une méthode pour...

Mesure Caenorhabditis elegans</emDurée de vie> à 96 plaques de microtitration bien

Cette vidéo décrit une méthode traditionnelle de mesure de la durée de vie de C. elegans, basée sur des plaques. L’exemple de protocole mesure la durée de vie des vers traités avec de l’ARNi.

Analyse de la durée de vie : Mesure de la longévité de C. elegans

Nous décrivons ici la méthode de jeu de réplicas, une approche quantitative mesure la durée de vie/survie de c. elegans et healthspan d’une manière robuste et haut débit, permettant ainsi la projection de nombreuses conditions sans sacrifier la qualité des données. Ce protocole décrit la stratégie et fournit un outil logiciel pour l’analyse des données de jeu de réplicas.

La méthode Set de la réplique : Une approche de haut-débit pour mesurer quantitativement Caenorhabditis elegans durée de vie

Les microbes intestinaux peuvent avoir un impact positif ou négatif sur la santé de leur hôte via des mécanismes spécifiques ou conservés. Caenorhabditis elegans est une plate-forme pratique pour dépister de tels microbes. Le présent protocole décrit le dépistage à haut débit de 48 isolats bactériens pour déterminer leur impact sur la résistance au stress des nématodes, utilisés comme indicateur de la santé des vers.

Criblage à haut débit d’isolats microbiens ayant un impact sur la santé de Caenorhabditis elegans

Un protocole optimisé pour la culture de nématodes individuels isolés sur des milieux solides dans des dispositifs multipuits microfabriqués est présenté ici. Cette approche permet de surveiller chaque animal tout au long de sa vie pour une variété de phénotypes liés au vieillissement et à la santé, y compris l’activité, la taille et la forme du corps, la géométrie du mouvement et la survie.

Culture à long terme et surveillance de Caenorhabditis elegans isolés sur des milieux solides dans des dispositifs multipuits

La plateforme d’imagerie « The Lifespan Machine » automatise l’observation à vie de grandes populations. Nous montrons les étapes nécessaires pour effectuer des tests de durée de vie, de résistance au stress, de pathogenèse et de vieillissement comportemental. La qualité et l’étendue des données permettent aux chercheurs d’étudier les interventions dans le vieillissement malgré la présence de variations biologiques et environnementales.

Tests comportementaux à haut débit sur le vieillissement et la durée de vie à l’aide de la machine Lifespan

Nous décrivons un morbidostat configurable à faible coût qui permet de caractériser la résistance aux antibiotiques en ajustant dynamiquement la concentration du médicament. Le dispositif peut être intégré à une plate-forme microfluidique multiplexée. L’approche peut être étendue aux études de résistance aux antibiotiques en laboratoire.

Conception et utilisation d&#39;un faible coût automatisé Morbidostat pour Adaptive Evolution des bactéries Sous Sélection des médicaments antibiotiques

Génétiquement codés histone-miniSOG induit des mutations héréditaires du génome entier d'une manière dépendant de la lumière bleue. Cette méthode de mutagenèse est simple, rapide, exempt de produits chimiques toxiques, et bien adapté pour le dépistage génétique avant et l'intégration du transgène.

Optogénétiques mutagenèse aléatoire Utilisation Histone-miniSOG dans<em&gt; C. elegans</em

Ici, nous présentons un cadre permettant de relier le large éventail de restriction alimentaire à durée de vie et l’expression des gènes. Les auteurs décrivent des protocoles pour large gamme restriction alimentaire et l’imagerie quantitative de l’expression des gènes sous ce paradigme. Nous exposons plus amples analyses informatiques pour révéler qui sous-tendent les fonctions de traitement d’informations des circuits génétiques impliqués dans la détection de nourriture.

Quantification des informations codées par Gene Expression niveaux pendant la durée de vie Modulation sous large gamme diététique Restriction chez c. elegans

Découvrez des méthodes économiques pour mesurer la durée de vie et la santé chez Caenorhabditis elegans. Ce protocole utilise la synchronisation par javel et l'évaluation de la locomotion pour étudier le vieillissement.

Étude des méthodes à faible coût pour mesurer la durée de vie et la durée de vie à Caenorhabditis elegans

Explorer plus de vidéos