Name: La technique du peel-blot : une méthode de préparation d’échantillons cryo-EM pour séparer les couches uniques des échantillons biologiques multicouches ou concentrés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Découvrez la technique du peel-blot pour la préparation d'échantillons cryo-EM en couches uniques. Cette méthode réduit l'épaisseur, augmente la concentration et facilite le traitement d'images des échantillons biologiques multicouches.

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Une partie de ce travail a été soutenue par la subvention HL090630 (ISK) des NIH.

1. Étapes de préparation pour la technique peel-blot
REMARQUE: La préparation nécessite que les éléments suivants soient placés les uns à côté des autres.
<ol><li>Empiler deux morceaux de papier filtre de 20 à 25 μm de taille pore (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Placez un film de paraffine de ~8 cm x 10 cm de long à côté du papier filtre avec le papier tourné vers le haut.</li>
	<li>Placez un morceau de papier filtre submicronique sur deux autres morceaux de papier filtre #4 (Figure 1-1).</li>
	<li>Positionnez la pince anti-capillaire avec la jambe pliée vers le haut et la jambe droite vers le bas. Ensuite, sélectionnez une grille à 600 mailles avec le côté lisse / brillant vers le haut. Placez les pinces sur une boîte de Petri ou une autre surface surélevée pour éviter le contact de la grille propre avec d’autres articles.</li>
	<li>Retirez le papier du film de paraffine et tirez sur les côtés (~5 mm) pour créer un petit bord. Pipeter deux gouttes de 150 μL de solution de tréhalose à 4 % ~1-2 cm d’un côté court du film de paraffine et ~1 cm d’intervalle sur le film de paraffine.</li>
	<li>Sur un banc séparé ou sur le sol, versez de l’azote liquide dans un petit contenant en mousse de polystyrène (voir Tableau des matériaux). ATTENTION : Recevez une formation sur la manipulation appropriée à l’aide de gants et d’un écran facial afin d’éviter les engelures.</li>
	<li>Placez un petit récipient cryo-EM dans l’azote liquide et couvrez le récipient en mousse de polystyrène avec des lingettes non pelucheuses.</li>
</ol>2. Placer le film de carbone sur le réseau
<ol><li>Utilisez la pince Dumont #5 (voir Tableau des matériaux) pour faire flotter le film de carbone du mica en touchant un côté du mica à un léger angle vers le bas (~20°-40°) sur l’une des gouttes de solution de tréhalose et laissez lentement la tension de l’eau se soulever du film de carbone en déplaçant le mica vers le bas. Libérez le mica une fois que le film de carbone flotte à la surface de la gouttelette.</li>
	<li>Inspectez visuellement le film de carbone pour éviter d’utiliser du carbone endommagé sous forme de fractures.</li>
	<li>Insérez la grille maintenue par la pince anticapillaire à un angle (~20°-30°) dans une goutte de tréhalose à une position adjacente, puis centrée sous le film de carbone. Ramassez le film de carbone (figure 1-2).</li>
	<li>Gardez la grille dans la même orientation et abaissez-la lentement sur la surface de la deuxième goutte de tréhalose sans rompre la tension superficielle de la goutte pour éliminer le film de carbone inutile qui aurait pu s’enrouler autour du bord de la grille du côté rugueux.</li>
</ol>3. Séparation de cristaux 2D multicouches en couches simples
<ol><li>Faites pivoter les pinces anticapillaires (voir le tableau des matériaux) et placez-les sur une boîte de Pétri avec le côté carbone de la grille vers le bas (figure 1-3).</li>
	<li>Pipeter 1,3 μL de l’échantillon dans le ménisque du tréhalose léger au-dessus de la grille. Pipeter la solution ~8-10 fois pour mélanger et répartir le tréhalose et échantillonner des deux côtés de la grille.</li>
	<li>Pendant l’incubation de la solution pendant 1 min, pipeter une ou plusieurs gouttes de 1,7 μL de solution de tréhalose sur le film de paraffine.</li>
	<li>Faites pivoter la grille dans sa position d’origine avec le film de carbone tourné vers le haut.</li>
	<li>Utilisez les pinces anticapillaires pour presser la grille sur le papier filtre submicronique (Figure 1-4). Une fois que la solution a été absorbée par le papier filtre et que le film de carbone est à plat, attendre 3 secondes avant de soulever la grille et de la déplacer verticalement sur la goutte de 1,7 μL de solution de tréhalose (Figure 1-5). REMARQUE: Répétez cette étape plusieurs fois pour les échantillons fortement empilés, ou la grille est préparée pour la vitrification dans les étapes suivantes.</li>
	<li>Épongez la grille sur les deux feuilles de papier filtre, puis soulevez la grille du papier filtre (Figure 1-6). Après environ 13 s, selon l’humidité et le tampon d’échantillon, plongez la grille dans l’azote liquide dans le petit récipient en polystyrène expansé et placez la grille dans le récipient cryo-EM grid ou transférez-la directement pour le dépistage cryo-EM ou la collecte de données. REMARQUE: Afin d’optimiser rapidement le protocole, tachez négativement la grille pelée à cette étape plutôt que de la plonger dans de l’azote liquide. Colorer négativement l’échantillon en appliquant 3 μL d’acétate d’uranyle à 1% sur la grille, incuber la grille pendant 30 s et l’éponger avec un morceau déchiré de papier filtre de 20 à 25 μm de la taille des pores. Les grilles de cristaux 2D vitrifiés dans du tréhalose, du tanin ou du glucose sont régulièrement plongées à la main pour la vitrification car le tréhalose, le tanin et le glucose empêchent la formation de glace cristalline à des taux utilisés pour plonger à la main2.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents ou d’autres conflits d’intérêts.

Le peel-blot est une méthode puissante pour surmonter l’empilement et l’épaisseur de cristaux 2D multicouches et d’échantillons similaires pour la collecte de données cryo-EM et le traitement d’images. Une décision sur l’utilisation du peel-blot sera basée sur les paramètres biologiques de l’échantillon et devra également être évaluée une fois qu’un modèle 3D cryo-EM sera disponible. L’importance biologique des contacts et la flexibilité potentielle des régions de contact seront particulièrement importantes dans cette év...

La technique peel-blot a été développée afin de séparer les cristaux bidimensionnels empilés de protéines membranaires en couches uniques afin d’obtenir des échantillons suffisamment minces pour la collecte de données cryo-EM 2D et 3D et de faciliter le traitement des images1. Le protocole convient également à d’autres types d’échantillons multilamellaires ainsi qu’à l’obtention de concentrations élevées d’échantillons de l’un ou l’autre type d’échantillon sur la grille sans augmenter l’épaisseur en Z.
La réduction des couches d’échantillon en une seule couche est obtenue en appliquant une combinaison de pression capillaire et de forces de cisaillement dans un protocole qui étend considérablement et modifie la méthode de rétroinjection2. Une première étape de buvard entraîne une prise en sandwich serrée et une adhérence au film de carbone et à une barre de grille de chaque côté de l’échantillon multicouche pendant le buvard sur submicron plutôt que la taille des pores du papier filtre de 20 à 25 μm dans la méthode de rétroinjection. La séparation, ou le pelage, d’une couche individuelle se produit lorsque l’on force la séparation des couches en sandwich une fois que la grille est pressée verticalement sur une goutte de tréhalose, forçant le film de carbone à s’éloigner de la barre de grille (Figure 1). Le repositionnement du film de carbone loin du point de contact d’origine avec la barre de grille se produit à l’étape suivante, lorsque la grille est à nouveau épongée sur du papier filtre submicronique. Le nombre d’itérations de ces étapes peut être optimisé pour des échantillons spécifiques. De plus, le protocole peut être utilisé pour augmenter les concentrations des échantillons tout en évitant l’agrégation en Z. En raison de la dépendance à l’adhérence à la barre de grille et au film de carbone ainsi que de la séparation forcée, cette approche peut ne pas convenir aux molécules très fragiles telles que certaines protéines et complexes protéiques délicats et / ou instables.
La technique du peel-blot ne nécessite ni équipement spécialisé ni fournitures coûteuses. L’applicabilité à des échantillons spécifiques nécessitera toutefois un examen attentif des paramètres biologiques. La décision est plus facile pour les cristaux 2D car un film de carbone est nécessaire pour assurer la planéité, mais la manipulation via la technique du peel-blot peut affecter l’intégrité biologique de l’échantillon ou l’ordre cristallin. L’adéquation de la technique peel-blot aux particules uniques est limitée et peut être testée pour celles qui nécessitent un film de carbone et sont stables à la manipulation. Les spécimens présentant des interactions biologiques critiques entre les couches peuvent ne pas convenir à la caractérisation à l’aide de la technique du peel-blot en raison de la perturbation de ces interactions.
La technique du peel-blot (« peel-blot ») est optimisée le plus rapidement par le test et le dépistage avec des échantillons négatifs ou non colorés par TEM à température ambiante. Une fois que le nombre optimal d’itérations peel-blot a été identifié, le temps nécessaire pour contrôler l’épaisseur avant la vitrification peut être déterminé.

<table><tbody><tr><td>Grilles 600 mailles</td><td>SPI</td><td>2060-C-XA</td><td></td></tr><tr><td>Pince anti-capillaire</td><td>Ted Pella</td><td>510-5</td><td></td></tr><tr><td>Carbone pour enrober le mica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryo-EM</td><td></td><td></td><td>Les grilles Cryo-EM peuvent être criblées à 120 kV ou 200 kV.&nbsp ; Les données haute résolution sont collectées à 300 kV.</td></tr><tr><td>Dumpont #5</td><td>Pince Ted Pella</td><td>5622</td><td></td></tr><tr><td>Boîte à grille pour stockage cryo-EM</td><td>Ted Pella</td><td>160-40</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azote</td><td></td><td></td><td></td>liquide</tr><tr><td>Mica</td><td>Ted Pella</td><td>56</td><td>Le mica est recouvert de carbone et coupé en carrés légèrement plus grands qu’une grille TEM. L’épaisseur du carbone peut nécessiter une optimisation pour éviter le carbone mince qui se brise facilement lors de plusieurs taches de pelage.</td></tr><tr><td>Coloration</td><td></td><td></td> négative <td>1-2 % d’acétate d’uranyle convient à de nombreux échantillons. D’autres colorants tels que l’acide phosphotungstique peuvent être remplacés.</td></tr>Récipient en polystyrène <tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Utilisé pour vitrifier la grille peel-blot.<td></td><td></td><td> Un conteneur maritime en polystyrène peut être recyclé à cet effet et doublé d’une feuille d’aluminium.</td></tr><tr><td>Papier filtre submicronique</td><td>MilliporeSigma</td><td>DAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à transmission</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td>Tout MET fonctionnant à une tension d’accélération de 80-120 kV conviendra au criblage de grilles colorées négativement.</td></tr><tr><td>Tréhalose</td><td></td><td></td><td>Préparez une solution de tréhalose à 4 %.</td></tr><tr><td>Papier filtre Whatman #4</td><td>MilliporeSigma</td><td>WHA1004150</td><td>Cela correspond au 20-25 &mu ; Papier filtre de taille M pore dans le protocole.</td></tr></tbody></table>

la technique du peel-blot : une méthode de préparation d’échantillons cryo-em pour séparer les couches uniques des échantillons biologiques multicouches ou concentrés

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

La technique de préparation de la grille cryo-EM par transfert peel-blot est une méthode de rétro-injection considérablement modifiée dans le but d’obtenir une réduction des couches d’échantillons multicouches. Cette élimination des couches avant la congélation peut aider à réduire l’épaisseur de l’échantillon à un niveau approprié pour la collecte de données cryo-EM, à améliorer la planéité de l’échantillon et à faciliter le traitement de l’image. La technique peel-blot permet de séparer les membranes multilamellaires en couches simples, les cristaux 2D stratifiés en cristaux individuels et les structures empilées en feuilles de protéines solubles à séparer également en couches uniques. L’épaisseur élevée de ces types d’échantillons pose souvent des problèmes insurmontables pour la collecte de données cryo-EM et le traitement d’images cryo-EM, en particulier lorsque la platine du microscope doit être inclinée pour la collecte de données. De plus, des grilles de concentrations élevées de l’un de ces échantillons peuvent être préparées pour une collecte efficace des données, car la concentration de l’échantillon avant la préparation de la grille peut être augmentée et la technique du transfert de pelage ajustée pour aboutir à une distribution dense de l’échantillon à une seule couche.

Une expérience réussie de transfert de pelage aboutira à des couches uniques d’échantillons à des concentrations souvent élevées. Il faut s’attendre à ce que certaines régions de la plupart des carrés de la grille contiennent encore plusieurs couches, en particulier à moins d’itérations des étapes de transfert de pelage. La majorité des carrés de grille, cependant, contiendront de vastes régions de couches simples comme observé pour les cristaux 2D de leucotriènesC4 synthase humaine (Figure 2) et de liposomes ...

La technique peel-blot est une méthode de préparation de grille cryo-EM qui permet de séparer des échantillons biologiques multicouches et concentrés en couches uniques afin de réduire l’épaisseur, d’augmenter la concentration des échantillons et de faciliter le traitement des images.

La technique du peel-blot : une méthode de préparation d’échantillons cryo-EM pour séparer les couches uniques des échantillons biologiques multicouches ou concentrés

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

La technique peel-blot permet de séparer des échantillons cryo-EM biologiques multicouches et concentrés en couches uniques pour réduire l’épaisseur, augmenter la concentration et faciliter le traitement de l’image. Les concentrations de l’échantillon peuvent être augmentées avant la préparation de la grille, et le transfert de peau peut être ajusté pour obtenir une distribution dense des échantillons à couche unique pour une collecte de données très efficace. Pour commencer, empilez deux morceaux de papier filtre de format pore de 20 à 25 micromètres et placez un long film de paraffine à côté avec le papier tourné vers le haut.Placez un morceau de papier filtre submicronique sur deux morceaux supplémentaires de papier filtre. Positionnez la pince anticapillaire avec la jambe pliée vers le haut et la jambe droite vers le bas et sélectionnez une grille de 600 mailles avec le côté lisse ou brillant vers le haut. Placez les pinces sur une boîte de Petri ou une autre surface surélevée pour éviter le contact de la grille propre avec d’autres articles.Retirez le papier du film de paraffine et tirez sur les côtés pour créer un petit bord. Pipeter deux gouttes de 150 microlitres donc une solution de tréhalose à 4% à environ un à deux centimètres d’un côté court du film de paraffine. Les deux gouttes doivent être distantes d’environ un centimètre.Ensuite, sur un banc séparé ou sur le sol, versez de l’azote liquide dans un petit récipient en mousse de polystyrène et placez un petit récipient cryo-EM dans l’azote liquide. Couvrir le contenant en mousse de polystyrène avec des lingettes non pelucheuses. Pour faire flotter le film de carbone du mica, utilisez une pince Dumont 5 et touchez un côté du mica à un léger angle vers le bas sur l’une des gouttes de solution de tréhalose.Déplacez le mica vers le bas pour laisser la tension de l’eau se soulever lentement du film de carbone. Libérez le mica une fois que le film de carbone flotte à la surface de la gouttelette. Inspectez visuellement le film de carbone pour éviter d’utiliser du carbone endommagé sous forme de fractures.Insérez la grille maintenue par la pince anticapillaire à un angle de 20-30 degrés dans une goutte de tréhalose à une position adjacente, puis centrez la grille sous le film de carbone. Ramassez le film de carbone, maintenez la grille dans la même orientation et abaissez lentement la grille sur la surface de la deuxième goutte de tréhalose sans briser la tension superficielle de la goutte. Cela éliminera le film de carbone inutile qui aurait pu s’enrouler autour du bord de la grille du côté rugueux.Faites pivoter les pinces anti-capillaires et placez-les sur une boîte de Pétri avec le côté carbone de la grille vers le bas. Pipeter 1,3 microlitre de l’échantillon dans le ménisque léger tréhalose sur le dessus de la grille. Ensuite, pipeter la solution environ 8 à 10 fois pour mélanger et répartir le tréhalose et l’échantillon des deux côtés de la grille.Pipeter une ou plusieurs gouttes de 1,7 microlitre de solution de tréhalose sur le film de paraffine tout en incubant l’échantillon de solution de tréhalose sur la grille pendant une minute. Faites pivoter la grille dans sa position d’origine avec le film de carbone vers le haut et appuyez sur la grille sur le papier filtre submicronique à l’aide de la pince anti-capillaire. Une fois que la solution a été absorbée par le papier filtre et que le film de carbone est à plat, attendez trois secondes avant de soulever la grille et de la déplacer verticalement sur la goutte de 1,7 microlitre de solution de tréhalose.Ces étapes peuvent être répétées entre une et trois réitérations ou plus, selon l’échantillon. Épongez la grille sur les deux morceaux de papier filtre, puis soulevez la grille du papier filtre. Après environ 13 secondes, selon l’humidité et le tampon de l’échantillon, plongez la grille dans l’azote liquide dans le petit récipient en polystyrène expansé et placez-la dans le récipient cryo-EM ou transférez-la directement pour le dépistage cryo-EM ou la collecte de données.Un échantillon cristallin 2D de leucotriène C4 synthase humaine soumis à la méthode peel-blot est montré ici. La région à gauche de la flèche a été largement réduite à des cristaux 2D monocouches dans une région de contact entre le film de carbone et la barre de grille qui a été écaillée puis déplacée. La région située à droite de la flèche n’a pas été affectée par la tache pelée.La moitié inférieure de l’image représente les régions avec de grandes bicouches phospholipidiques, principalement monocouches, résultant de l’application du peel-blot. La moitié supérieure n’était pas dans une zone de contact entre la barre de grille et le film de carbone, et contenait donc des liposomes complets avec deux bicouches phospholipidiques. Le carré de la grille d’une grille de 400 mailles montre l’empreinte de la barre de grille et les régions écaillées résultantes, ainsi que les régions qui n’étaient pas en contact avec une barre de grille ou soumises à moins d’itérations de transfert de pelage.Ces images montraient le buvard d’une grille EM préparée par rétroinjection sur un papier filtre submicronique utilisant un film de carbone très fin. Les images sont des images uniques au contact initial avec la membrane, 1 000 millisecondes après le contact et 2 000 millisecondes après le contact. La flèche indique les carrés de la grille où la pression capillaire a rompu le film de carbone.Éviter les fractures dans le film de carbone et combiner du papier filtre submicronique avec une goutte de tréhalose de 1,7 microlitre pour aspirer puis séparer les couches sont des étapes clés. Les échantillons épluchés sont utilisés pour la collecte de données cryo-EM à haute résolution, suivie d’un traitement d’image pour la détermination de la structure. Le peel-blot permet une détermination structurée des cristaux 2D de protéines monocouches qui étaient auparavant trop épais pour la cryo-EM.En outre, il peut concentrer divers échantillons en couches uniques sur un film de carbone.

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