La technique du peel-blot : une méthode de préparation d’échantillons cryo-EM pour séparer les couches uniques des échantillons biologiques multicouches ou concentrés
29 juin 2022
La technique peel-blot est une méthode de préparation de grille cryo-EM qui permet de séparer des échantillons biologiques multicouches et concentrés en couches uniques afin de réduire l’épaisseur, d’augmenter la concentration des échantillons et de faciliter le traitement des images.
La technique peel-blot permet de séparer des échantillons cryo-EM biologiques multicouches et concentrés en couches uniques pour réduire l’épaisseur, augmenter la concentration et faciliter le traitement de l’image. Les concentrations de l’échantillon peuvent être augmentées avant la préparation de la grille, et le transfert de peau peut être ajusté pour obtenir une distribution dense des échantillons à couche unique pour une collecte de données très efficace. Pour commencer, empilez deux morceaux de papier filtre de format pore de 20 à 25 micromètres et placez un long film de paraffine à côté avec le papier tourné vers le haut.
Placez un morceau de papier filtre submicronique sur deux morceaux supplémentaires de papier filtre. Positionnez la pince anticapillaire avec la jambe pliée vers le haut et la jambe droite vers le bas et sélectionnez une grille de 600 mailles avec le côté lisse ou brillant vers le haut. Placez les pinces sur une boîte de Petri ou une autre surface surélevée pour éviter le contact de la grille propre avec d’autres articles.
Retirez le papier du film de paraffine et tirez sur les côtés pour créer un petit bord. Pipeter deux gouttes de 150 microlitres donc une solution de tréhalose à 4% à environ un à deux centimètres d’un côté court du film de paraffine. Les deux gouttes doivent être distantes d’environ un centimètre.
Ensuite, sur un banc séparé ou sur le sol, versez de l’azote liquide dans un petit récipient en mousse de polystyrène et placez un petit récipient cryo-EM dans l’azote liquide. Couvrir le contenant en mousse de polystyrène avec des lingettes non pelucheuses. Pour faire flotter le film de carbone du mica, utilisez une pince Dumont 5 et touchez un côté du mica à un léger angle vers le bas sur l’une des gouttes de solution de tréhalose.
Déplacez le mica vers le bas pour laisser la tension de l’eau se soulever lentement du film de carbone. Libérez le mica une fois que le film de carbone flotte à la surface de la gouttelette. Inspectez visuellement le film de carbone pour éviter d’utiliser du carbone endommagé sous forme de fractures.
Insérez la grille maintenue par la pince anticapillaire à un angle de 20-30 degrés dans une goutte de tréhalose à une position adjacente, puis centrez la grille sous le film de carbone. Ramassez le film de carbone, maintenez la grille dans la même orientation et abaissez lentement la grille sur la surface de la deuxième goutte de tréhalose sans briser la tension superficielle de la goutte. Cela éliminera le film de carbone inutile qui aurait pu s’enrouler autour du bord de la grille du côté rugueux.
Faites pivoter les pinces anti-capillaires et placez-les sur une boîte de Pétri avec le côté carbone de la grille vers le bas. Pipeter 1,3 microlitre de l’échantillon dans le ménisque léger tréhalose sur le dessus de la grille. Ensuite, pipeter la solution environ 8 à 10 fois pour mélanger et répartir le tréhalose et l’échantillon des deux côtés de la grille.
Pipeter une ou plusieurs gouttes de 1,7 microlitre de solution de tréhalose sur le film de paraffine tout en incubant l’échantillon de solution de tréhalose sur la grille pendant une minute. Faites pivoter la grille dans sa position d’origine avec le film de carbone vers le haut et appuyez sur la grille sur le papier filtre submicronique à l’aide de la pince anti-capillaire. Une fois que la solution a été absorbée par le papier filtre et que le film de carbone est à plat, attendez trois secondes avant de soulever la grille et de la déplacer verticalement sur la goutte de 1,7 microlitre de solution de tréhalose.
Ces étapes peuvent être répétées entre une et trois réitérations ou plus, selon l’échantillon. Épongez la grille sur les deux morceaux de papier filtre, puis soulevez la grille du papier filtre. Après environ 13 secondes, selon l’humidité et le tampon de l’échantillon, plongez la grille dans l’azote liquide dans le petit récipient en polystyrène expansé et placez-la dans le récipient cryo-EM ou transférez-la directement pour le dépistage cryo-EM ou la collecte de données.
Un échantillon cristallin 2D de leucotriène C4 synthase humaine soumis à la méthode peel-blot est montré ici. La région à gauche de la flèche a été largement réduite à des cristaux 2D monocouches dans une région de contact entre le film de carbone et la barre de grille qui a été écaillée puis déplacée. La région située à droite de la flèche n’a pas été affectée par la tache pelée.
La moitié inférieure de l’image représente les régions avec de grandes bicouches phospholipidiques, principalement monocouches, résultant de l’application du peel-blot. La moitié supérieure n’était pas dans une zone de contact entre la barre de grille et le film de carbone, et contenait donc des liposomes complets avec deux bicouches phospholipidiques. Le carré de la grille d’une grille de 400 mailles montre l’empreinte de la barre de grille et les régions écaillées résultantes, ainsi que les régions qui n’étaient pas en contact avec une barre de grille ou soumises à moins d’itérations de transfert de pelage.
Ces images montraient le buvard d’une grille EM préparée par rétroinjection sur un papier filtre submicronique utilisant un film de carbone très fin. Les images sont des images uniques au contact initial avec la membrane, 1 000 millisecondes après le contact et 2 000 millisecondes après le contact. La flèche indique les carrés de la grille où la pression capillaire a rompu le film de carbone.
Éviter les fractures dans le film de carbone et combiner du papier filtre submicronique avec une goutte de tréhalose de 1,7 microlitre pour aspirer puis séparer les couches sont des étapes clés. Les échantillons épluchés sont utilisés pour la collecte de données cryo-EM à haute résolution, suivie d’un traitement d’image pour la détermination de la structure. Le peel-blot permet une détermination structurée des cristaux 2D de protéines monocouches qui étaient auparavant trop épais pour la cryo-EM.
En outre, il peut concentrer divers échantillons en couches uniques sur un film de carbone.
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Aperçu
La technique du « peel-blot » est une méthode de préparation de grilles de cryo-ME qui permet de séparer des échantillons biologiques multicouches et concentrés en monocouches. Cette méthode réduit l'épaisseur, augmente la concentration de l'échantillon et facilite le traitement des images.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microscopie électronique cryogénique (cryo-ME)
- Préparation d'échantillons biologiques
- Techniques de traitement d'images
Contexte
- Les échantillons biologiques multicouches peuvent nuire à la qualité de l'imagerie.
- Une concentration élevée des échantillons est essentielle pour une collecte de données efficace.
- Les méthodes traditionnelles peuvent ne pas séparer adéquatement les couches.
- La technique de transfert par pelage offre une solution à ces difficultés.
Objectif de l'étude
- Améliorer la préparation des échantillons pour la microscopie électronique cryogénique.
- Accroître l'efficacité de la collecte de données à partir d'échantillons biologiques.
- Faciliter une meilleure imagerie grâce à une réduction de l'épaisseur de l'échantillon.
Méthodes utilisées
- Empiler des papiers filtres pour créer un environnement approprié pour la séparation des échantillons.
- Utiliser des pinces anti-capillaires pour une manipulation précise des échantillons.
- Utiliser une grille de 600 mailles pour une imagerie optimale.
- Ajuster la technique de décollage-absorption pour obtenir une distribution dense d'échantillons en monocouche.
Résultats principaux
- La technique parvient avec succès à séparer les échantillons multicouches en couches individuelles.
- Une concentration accrue de l'échantillon conduit à une amélioration des résultats d'imagerie.
- Une collecte efficace des données est obtenue grâce à la nouvelle méthode.
- La préparation de l'échantillon peut être adaptée à des besoins d'imagerie spécifiques.
Conclusions
- La technique du peel-blot est efficace pour la préparation d'échantillons en microscopie électronique cryogénique.
- Cette méthode améliore la qualité de l'imagerie biologique.
- Les applications futures pourraient s'étendre au-delà des utilisations actuelles en microscopie électronique cryogénique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
La technique de préparation d'échantillons pour la microscopie électronique cryogénique par transfert après décollage permet de surmonter un goulot d'étranglement critique en biologie structurale en permettant la séparation d'échantillons biologiques multicouches ou fortement concentrés en monocouches adaptées à l'imagerie haute résolution. Cette capacité améliore la fiabilité prédictive lors des phases précoces de découverte et de validation de cibles en assurant une qualité optimale des échantillons pour l'élucidation structurale. La méthode favorise l'avancement du portefeuille de projets en réduisant les risques techniques et en augmentant le débit dans les flux de travail fondés sur la cryo-EM.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'interrogation structurale de protéines et de complexes membranaires auparavant inaccessibles en raison de l'épaisseur de l'échantillon.
- Réduit l'ambiguïté mécanistique en fournissant des spécimens de haute qualité en monocouche destinés à l'analyse structurale.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des cibles en facilitant la détermination précise de la structure d'assemblages biologiquement pertinents.
Élaboration de tests et criblage
- Prépare des systèmes biologiques monocouche validés pour l'analyse et le criblage en cryo-ME en aval.
- Améliore la reproductibilité et la standardisation de la préparation des échantillons dans les protocoles d'imagerie quantitative.
- Permet une évaluation efficace de la qualité et de la concentration des échantillons avant la collecte de données à haut débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- Facilite la continuité entre la découverte et la validation préclinique en permettant des études structurales de cibles pertinentes pour la maladie.
- Réduit le risque d'échec de l'imagerie dû à l'hétérogénéité de l'échantillon ou à une épaisseur excessive.
- Permet l'alignement translationnel des biomarqueurs en rendant possible la visualisation à haute résolution d'assemblages complexes.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La technique de type peel-blot s'intègre dans la chaîne de découverte en microscopie électronique cryogénique, depuis la validation précoce de cibles jusqu'à l'identification de candidats thérapeutiques et la recherche préclinique, en garantissant l'aptitude des échantillons à l'imagerie haute résolution et aux analyses ultérieures.
- Biologie de la découverte : Facilite la validation d'hypothèses et l'élucidation de voies biologiques en permettant des études structurales sur des échantillons difficiles.
- Écrans : Fournit des spécimens reproductibles en monocouche pour des écrans par cryo-ME fiables et une évaluation quantitative.
- Analytique : Produit des données de haute qualité en réduisant l'épaisseur de l'échantillon et en maximisant l'efficacité d'imagerie.
- Recherche translationnelle : Préserve la continuité des flux de travail structuraux pour des cibles pertinentes en matière de maladies, selon le type d'échantillon pris en charge.
- Réutilisation en entreprise : Offre une capacité standardisée et adaptable de préparation d'échantillons pour divers assemblages biologiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'incertitude mécanistique dans les études structurales.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité, la reproductibilité à grande échelle et la standardisation de la préparation des échantillons en microscopie électronique cryogénique.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/ne pas aller » et l'efficacité du capital en réduisant les taux d'échec technique.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque et la progression de cibles validées sur le plan structural.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la préparation des grilles de cryo-ME et la manipulation de films de carbone délicats.
- Exige un accès à des instruments spécialisés, notamment des pinces anti-capillaires et du papier filtre submicronique.
- Implique une standardisation inter-équipes de la concentration des échantillons et des paramètres de capillarité.
- Peut nécessiter des adaptations selon les types d'échantillons ou les formats de grilles, en fonction du contexte biologique.
- Les limitations pratiques incluent la sensibilité à l'humidité, à la composition du tampon et au risque de rupture du film de carbone.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:33
Preparation Steps for the Peel‐Blot Technique
1:57
Placing the Carbon Film onto the Grid
3:07
Separation of Multi-Layered 2D Crystals into Single Layer
6:42
Conclusion
4:55
Results: 2D Crystals of Human Leukotriene C4 Synthase and Liposomes Subjected to the Peel‐Blot Method, the Peel-Blot Footprint, and Blotting an EM Grid Prepared by Back-Injection on a Submicron Filter Paper
