Nettoyage optique rapide pour l’analyse à semi-haut débit des sphéroïdes tumoraux

Mon laboratoire est spécialisé dans la modélisation tumorale tridimensionnelle et quadridimensionnelle. Les modèles sphéroïdes tumoraux sont largement utilisés dans la biologie et la découverte de médicaments. Cependant, les protocoles existants pour la collecte de données à partir de ces expériences sont coûteux, difficiles et limités.

Ce protocole nécessite des produits chimiques et des équipements facilement accessibles, et n’exige pas beaucoup de main-d’œuvre par rapport aux méthodes actuelles qui fournissent des résultats similaires. Ce protocole a été développé pour être relativement facile à mettre en œuvre pour les débutants et robuste aux petites erreurs, car de nombreuses étapes sont réversibles. Commencez par peser 0,5 gramme d’agarose à bas point de fusion dans une bouteille en verre.

Et ajoutez 25 millilitres de PBS. Faire fondre l’agarose en faisant bouillir la solution au micro-ondes pendant 30 à 60 secondes avec le couvercle fermé et en remuant constamment. Peser neuf grammes de N, N, N’N’Tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine, 22 grammes d’urée, 44 grammes de saccharose, 0,1 gramme de Triton X-100 et 24,9 grammes d’eau désionisée.

Chauffer la solution dans un bain-marie de 56 degrés Celsius avec un mélange constant. Une fois les cristaux dissous, laissez reposer la solution à température ambiante pour permettre aux bulles formées pendant le mélange de remonter à la surface. Générez des sphéroïdes en utilisant la méthode de superposition d’agarose décrite dans le manuscrit textuel.

Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette d’un millilitre à l’aide d’un scalpel pour agrandir l’orifice. À l’aide de la pipette, aspirez les sphéroïdes des puits et transférez-les dans un tube conique transparent de 1,5 millilitre. Plusieurs sphéroïdes des mêmes conditions peuvent être combinés dans le même tube.

Lavez les sphéroïdes deux fois dans un millilitre de PBS, puis ajoutez une solution neutre de paraformaldéhyde préchauffée à 4% et incuber les sphéroïdes à 37 degrés Celsius. Après 20 minutes, retirez la solution de paraformaldéhyde et lavez les sphéroïdes deux fois avec un millilitre de PBS. Ensuite, pour la coloration, transférez jusqu’à 15 sphéroïdes dans un tube PCR de 200 microlitres, à l’aide d’une pipette.

Perméabiliser les cellules en utilisant 200 microlitres de 0,5% Triton X-100 dans du PBS. Placez les tubes PCR à l’intérieur de tubes à bouchon à vis de 50 millilitres et couvrez le tube avec du papier d’aluminium et incuber les sphéroïdes à température ambiante avec une légère agitation. Après deux heures, remplacez la solution par 200 microlitres de tampon de dilution d’anticorps et incuber pendant une nuit à température ambiante.

Le lendemain, retirez le tampon de dilution des anticorps avant d’ajouter 75 microlitres d’anticorps primaires et incuber à quatre degrés Celsius pendant deux jours et demi. Après l’incubation, retirez le surnageant et lavez les sphéroïdes deux fois avec 200 microlitres de PBS, contenant 0,1% Tween et 0,1% Triton X-100 ou PBS-TT. Incuber ensuite avec 200 microlitres de PBS-TT pendant quatre heures à température ambiante.

Ensuite, retirez PBS-TT avant d’ajouter 100 microlitres de l’anticorps secondaire et incuber à quatre degrés Celsius pendant deux jours et demi. Après l’incubation, retirez le surnageant et lavez deux fois avec du PBS-TT, avant d’incuber avec 200 microlitres de PBS-TT pendant quatre heures. Pour le montage, utilisez une pipette de 200 microlitres, transférez les sphéroïdes fixes et colorés dans des tubes PCR de 500 microlitres, à raison d’un tube par condition.

Remplacez la solution par 200 microlitres de gel d’agarose liquide à 2% et centrifugez sur l’essorage rapide, à la vitesse maximale fixée, à température ambiante, pendant 30 secondes. Aspirer les sphéroïdes dans 50 microlitres de gel d’agarose liquide et distribuer dans le puits une plaque de fond en verre de 24 puits. Avant que le gel ne durcisse, séparez les sphéroïdes à l’aide d’une pointe de pipette dans le gel environnant et assurez-vous que les sphéroïdes sont recouverts de gel.

Ensuite, immergez le gel en ajoutant 500 microlitres de solution de nettoyage par puits, et incuber à température ambiante, dans l’obscurité, pendant 24 heures avant l’imagerie. Pour l’imagerie, choisissez un objectif avec une distance de travail suffisamment longue pour englober tout le sphéroïde, y compris la hauteur de montage du sphéroïde dans le vaisseau. Pour identifier le plan équatorial, réglez la mise au point jusqu’à ce que la plus grande surface soit atteinte dans le plan XY et imagez avec le pourcentage de puissance laser, la tension du détecteur, le gain et les paramètres de décalage requis.

Pour les images tridimensionnelles, réglez le début et la fin des sphéroïdes et choisissez l’intensité du signal appropriée à différentes profondeurs Z, en utilisant les paramètres de correction d’intensité Z. Cette étude montre une comparaison des sphéroïdes de mélanome humain FUCCI effacés et non effacés, par rapport aux sphéroïdes montés sur PBS. La solution de compensation fournit des images d’une grande clarté avec une distorsion de taille minimale.

La solution de compensation permet en outre une imagerie haute résolution des détails au niveau cellulaire plus profondément dans les sphéroïdes sans section histologique. Avec des images confocales tridimensionnelles, des détails au niveau cellulaire à une profondeur de 200 microns peuvent être obtenus. En outre, une comparaison entre le sphéroïde cryosectionné et le sphéroïde de trou dégagé, coloré pour le pimonidazole et p27kip1, est montrée.

La coloration au pimonidazole montre la région hypoxique du sphéroïde, et la coloration p27kip1, marque l’arrêt du cycle cellulaire et la coloration nucléaire DAPI. Une pénétration plus profonde et moins de diffusion permettent une meilleure représentation tridimensionnelle de la structure sphéroïde avec une perte de lumière minimale. Le rendu tridimensionnel des sphéroïdes FUCCI, colorés avec DRAQ7, est montré.

La solution de compensation a un impact minimal sur la taille des sphéroïdes. Le diamètre du sphéroïde a été défini sur la base d’une sphère ayant la même section transversale que le sphéroïde. On a observé une légère augmentation de la taille des sphéroïdes au cours des six premières heures, comme l’indique un changement de diamètre compris entre 2% et 6%En revanche, après 24 à 72 heures, les sphéroïdes sont revenus à une taille approximativement égale à la taille correspondante dans la fixation post-paraformaldéhyde PBS.

Il est important d’attendre au moins 24 heures avant l’imagerie, pour laisser la solution de dégagement s’équilibrer avec les sphéroïdes et le gel. Ce protocole permet aux praticiens de collecter rapidement des données à partir d’un grand nombre de sphéroïdes, ce qui permet une analyse mathématique et statistique quantitative détaillée qui fournit des informations détaillées sur la biologie.