In vivo Imagerie chronique à deux photons de la microglie dans l’hippocampe de souris

Les rôles de la microglie dans l’hippocampe ne sont pas encore entièrement compris. Ce protocole peut directement imager comment les microglies entrent en contact et régulent les neurones. L’imagerie in vivo de la microglie au repos et des neurones dans l’hippocampe a été très difficile.

Cette méthode peut résoudre ce problème. Pour implanter la fenêtre d’observation, faites une rainure circulaire de trois millimètres sur le crâne à l’aide d’un poinçon dermique, en assurant l’alignement de la rainure avec la zone précédemment marquée. Lorsque le coup de poing dermique atteint la couche la plus interne du crâne avant de toucher la mère sous-jacente, soulevez doucement l’îlot osseux central à l’aide d’une aiguille de calibre 30.

Ensuite, retirez soigneusement la dure-mère à l’aide d’un sélecteur de dure-dure. Aspirez le pia, les vaisseaux piaux et le tissu cortical de la surface. Gardez la profondeur de la surface des tissus exposés homogène sur toute la fenêtre crânienne et approfondissez progressivement l’aspiration jusqu’à ce que les fibres de la capsule externe soient exposées.

Après avoir positionné l’embout d’aspiration sur la capsule externe près du ventricule latéral à l’extrémité rostrolatérale de la fenêtre crânienne, retirez la couche superficielle de la capsule externe qui court dans le caudomédial jusqu’à la direction rostrolatérale. Ensuite, retirez la couche interne dans le sens médiolatéral. Confirmer le retrait de toute la capsule externe en vérifiant l’exposition complète de la surface de l’alvéus et de la commissure de l’hippocampe dorsal.

Après vous être assuré que le saignement a complètement cessé, remplissez le trou avec une solution saline stérile au niveau de la surface du crâne. Ensuite, insérez le tube métallique à fond de verre verticalement dans le trou tout en aspirant l’excès d’eau débordant des côtés du tube jusqu’à ce que le fond en verre appuie légèrement contre l’alvéus et aplatisse partiellement le CA1 sous-jacent. À l’aide du ciment de résine dentaire, fixez la paroi du tube inséré au crâne environnant.

Placez la souris dans le dispositif de maintien de la tête sous la lentille de l’objectif du microscope à deux photons et sur l’étage de balayage XY motorisé. Remplissez ensuite l’espace entre le fond en verre et la lentille de l’objectif avec de l’eau sans créer de bulles d’air. Ajustez la mise au point sur CA1 avec le guidage de la fluorescence émise par le parenchyme cérébral et la lumière réfléchie par le bord du tube métallique sous éclairage continu par le laser pulsé.

Ajustez l’angle de la tête de la souris en inclinant le dispositif de maintien de la tête de sorte que le fond du verre soit parallèle au plan d’imagerie. Ajustez ensuite le collier correcteur de l’objectif pour obtenir la résolution la plus élevée à une profondeur de la structure cible dans le CA1. Ensuite, confirmez que les cellules fluorescentes dans la couche moléculaire du gyrus denté ou DG à une profondeur de 500 micromètres du fond de verre sont imagées dans tout le champ de vision.

Ce n’est qu’en cas de réussite chirurgicale que les signaux DG peuvent être détectés immédiatement. Élever la souris postopératoire dans un logement individuel pendant plusieurs semaines. Placez la souris anesthésiée sous le microscope à deux photons.

Effectuer l’imagerie de l’hippocampe. Confirmez si la qualité et l’intensité des images capturées après la réduction de l’œdème postopératoire sont meilleures ou comparables à celles capturées le jour de la chirurgie. S’assurer que les microglies ont retrouvé leur morphologie ramifiée.

Effectuez ensuite une imagerie in vivo sur la couche d’intérêt dans le CA1. La microglie chez les souris CX3CR1-GFP capturées immédiatement après la chirurgie n’a montré aucune activation importante. Après une chirurgie réussie sans induction d’œdème, les profondeurs d’imagerie à deux photons dépassaient l’ensemble des couches CA1 et atteignaient 500 micromètres de la surface chirurgicale.

La microglie dans la phase chronique de plus de trois semaines après la chirurgie a montré une intensité et une résolution fluorescentes plus élevées et une distribution plus homogène en raison de la réduction de l’œdème et de l’inflammation. Les microglies dans toutes les couches ont déjà restauré leur morphologie ramifiée et présenté des corps cellulaires immobiles et des processus hautement modaux. Les images haute résolution sur l’ensemble du CA1 ont été fournies pendant plusieurs mois.

Les signaux de la microglie fluorescente aident à identifier les couches de l’hippocampe. La microglie dans l’alvéus avait des corps cellulaires allongés et des processus s’étendant le long des voies axonales. La microglie dans la strate pyramidale pourrait être distinguée par la densité plus faible de leurs processus.

La frontière entre le CA1 et le DG pouvait être reconnue par des vaisseaux sanguins épais le long de la frontière, ce qui était mieux reconnu par l’étiquetage des vaisseaux avec de la sulforhodamine 101. À titre d’exemple d’application, la microglie GFP positive et les neurones pyramidaux marqués tdTomato ont été imagés simultanément. Le marquage neuronal a permis de comprendre les structures de couches exactes du CA1.

Le point le plus important est de réduire les dommages chirurgicaux. Éviter les lésions tissulaires par aspiration. Appliquez une légère pression lors de l’insertion du fond de verre et évitez que le ciment dentaire ne touche la surface du cerveau.

Cette approche aidera à identifier le rôle de la microglie dans l’hippocampe. Par exemple, comment les microglies interagissent avec les neurones, comment ils sont impliqués dans l’apprentissage et comment ils contrôlent les maladies du cerveau.