Name: In vivo Imagerie chronique à deux photons de la microglie dans l’hippocampe de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Découvrez l'imagerie chronique in vivo à deux photons de la microglie dans l'hippocampe de souris. Cette méthode permet d'observer les interactions microglie-neurones et leur rôle dans l'apprentissage.

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Nous tenons à remercier M. Kondo et M. Matsuzaki de nous avoir prêté l’objectif XLPLN25XSVMP. Ce travail a été soutenu financièrement par la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) par Grant-in-Aid for JSPS Research Fellow (18J21331 à R.K.) et Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 à S.O.), par l’Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (JP19gm1310003 et JP17gm5010003 à S.O.), et par l’Agence japonaise pour la science et la technologie par Moonshot R&D (JPMJMS2024 à H.M.).

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées et réalisées conformément aux politiques du Comité d’éthique animale et du Comité de sécurité des expériences génétiques recombinantes de l’Université de Tokyo. Des souris CX3CR1-GFP mâles et femelles, âgées de 2 à 4 mois, ont été utilisées dans les expériences. Pour la sécurité des expérimentateurs et le maintien de conditions stériles, toutes les procédures ont été effectuées avec des blouses blanches, des masques et des gants stériles. Tous les instruments ont été stérilisés avant utilisation.
1. Préparation des instruments et des animaux
<ol><li>Assemblez un tube métallique à fond de verre (figure 1A).<ol><li>Appliquez une petite goutte d’adhésif optique à séchage UV à une extrémité d’un tube en acier inoxydable sur mesure (diamètre extérieur 3,0 mm, diamètre intérieur 2,8 mm, hauteur 1,7 mm). Étaler uniformément la colle sur le bord circulaire du tube. REMARQUE: Une quantité suffisante d’adhésif doit être utilisée pour couvrir tout le bord du tube.</li>
		<li>Placez une glissière circulaire en verre (3,0 mm de diamètre, 0,15 ± 0,02 mm d’épaisseur) à l’extrémité recouverte de colle du tube métallique et appuyez légèrement sur la lamelle de recouvrement contre le tube de sorte que l’espace entre le tube et le verre soit rempli de colle. Ensuite, ajustez la position du verre pour qu’il s’adapte au bord extérieur du tube métallique.</li>
		<li>Irradiez le verre avec de la lumière UV pendant un temps suffisant pour durcir l’adhésif. REMARQUE: Assurez-vous que le verre et le tube sont complètement fixés. Si l’adhérence est insuffisante, le verre peut se détacher après la chirurgie, ce qui entraîne un échec de l’imagerie ou une fuite de liquide céphalorachidien (LCR).</li>
		<li>Désinfectez le tube métallique assemblé à fond de verre avec de l’éthanol à 70 % et lavez-le avec une solution saline stérile pour éliminer les débris.</li>
	</ol></li>
	<li>Stérilisez tous les instruments chirurgicaux avec un stérilisateur à chaleur sèche.</li>
	<li>Préparez les souris à la chirurgie d’implantation de fenêtre. REMARQUE: Les souris doivent être d’âge approprié. Il est préférable qu’ils soient génétiquement modifiés pour exprimer des protéines fluorescentes dans le CA1 et le gyrus denté (DG). Ces points sont expliqués plus en détail dans la section Discussion.</li>
</ol>2. Anesthésie et fixation de la tête
<ol><li>Anesthésier une souris par injection intrapéritonéale de kétamine-xylazine (100 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine). Administrer du méloxicam (2 mg/kg) par injection sous-cutanée pour l’analgésie préopératoire. Confirmer la disparition de la réponse aux stimuli douloureux, tels que le pincement de la queue pour assurer une profondeur d’anesthésie adéquate. Ajouter une demi-dose de kétamine-xylazine chaque fois que l’anesthésie s’estompe pendant la chirurgie, généralement 1 h après l’administration initiale et toutes les 30 minutes par la suite. Utilisez un coussin chauffant sous le corps pour fournir un soutien thermique et appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. NOTE: Le choix de l’anesthésie pour la chirurgie est essentiel. Ce point est discuté en détail dans la section Discussion.</li>
	<li>Appliquez une crème dépilatoire pour enlever les poils du cuir chevelu. Désinfectez le cuir chevelu plusieurs fois dans un mouvement circulaire avec un gommage à la povidone iodée suivi d’alcool. Placez la souris sur la plate-forme chirurgicale préparée avec un tampon imperméable stérile et appliquez des champs stériles pour sécuriser le site chirurgical. Ensuite, coupez et retirez le cuir chevelu circulairement avec un scalpel afin que les os pariétal et occipital soient complètement exposés du côté opératoire.</li>
	<li>Retirez le tissu conjonctif sous-cutané en le frottant avec un coton-tige tout en appliquant une solution saline stérile pour éliminer le saignement. Grattez délicatement la surface crânienne avec un couteau miniature à pointe ronde pour enlever le périoste, ce qui contribue à renforcer l’adhérence entre le ciment et l’os (voir étape 2.6).</li>
	<li>Appliquez du matériel de gravure dentaire sur toute la surface, attendez des dizaines de secondes et rincez avec suffisamment de solution saline stérile.</li>
	<li>À l’aide d’une encre imperméable, marquez la zone de l’os à enlever (une zone circulaire d’un diamètre de 3,0 mm, centrée d’environ 2,5 mm en arrière et de 2,5 mm latéralement au bregma). Après le marquage, séchez soigneusement la surface du crâne. REMARQUE: La position de la craniotomie dépend de la taille de l’hippocampe et doit être optimisée pour différents âges. Des indicateurs utiles pour la position de la craniotomie seront présentés ci-dessous (voir étape 3.4.5, NOTE).</li>
	<li>Fixez la plaque d’aluminium rectangulaire d’une épaisseur de 1,0 mm et d’un trou de 5,0 mm de diamètre au centre du crâne à l’aide de ciment de résine dentaire conformément aux instructions du fabricant.<ol><li>Alignez soigneusement le trou au centre de la plaque avec la zone circulaire marquée à l’aide d’un stylo (voir étape 2.5) de sorte que la plaque d’aluminium soit parallèle à la surface marquée du crâne (figure 1B). Assurez-vous que le ciment scelle hermétiquement tous les espaces entre la plaque et l’os. Attendez environ 5 minutes pour que le ciment soit suffisamment durci.</li>
	</ol></li>
	<li>Placez la souris sur le dispositif de maintien de la tête avec des ajusteurs d’angle via la plaque fixée.</li>
</ol>3. Implantation de la fenêtre d’observation
REMARQUE: Les interventions chirurgicales suivantes doivent être effectuées au microscope stéréoscopique.
<ol><li>Faites une rainure circulaire sur le crâne à l’aide d’un poinçon dermique d’un diamètre de 3,0 mm. Alignez la rainure circulaire et la zone marquée avec un stylet à l’étape 2.5. Tournez le poinçon dermique avec une légère pression pour que la profondeur de la rainure augmente progressivement. Vérifiez fréquemment que la profondeur de la rainure est constante sur toute la circonférence.</li>
	<li>Lorsque le poinçon dermique atteint la couche la plus interne du crâne, avant de toucher la dure-mère sous-jacente, soulevez doucement l’îlot osseux central à l’aide d’une aiguille de 30 G. REMARQUE: Une légère fuite de liquide du bas de la rainure indique que la rainure est proche de la dure-mère.</li>
	<li>Retirez la dure-mère à l’aide d’un sélecteur de dure-dure. REMARQUE: L’enlèvement complet de la dure-mère dans la fenêtre crânienne est nécessaire et nécessitera une résection soigneuse de la dure-mère résiduelle à la périphérie à l’aide de pinces fines.</li>
	<li>Aspirez doucement le tissu pour exposer l’alvéus de l’hippocampe par des aiguilles émoussées de 23 G ou 25 G reliées à l’aspirateur. REMARQUE : Cette étape est la plus critique pour une imagerie réussie. Les points techniques clés pour l’aspiration tissulaire sont décrits en détail dans la section Discussion.<ol><li>Aspirer le pia et les vaisseaux pial.</li>
		<li>Aspirez le tissu cortical de la surface. Gardez la profondeur de la surface des tissus exposés homogène sur toute la fenêtre crânienne. Approfondissez progressivement l’aspiration jusqu’à ce que les fibres de la capsule externe soient exposées.</li>
		<li>Placez soigneusement l’embout d’aspiration sur la capsule externe près du ventricule latéral (LV) situé à l’extrémité rostrolatérale de la fenêtre crânienne. Retirez la couche superficielle de la capsule externe allant dans la direction caudomédiale à rostrolatérale, puis la couche interne dans la direction médiolatérale. REMARQUE: La capsule externe près du BT peut être facilement retirée de la structure sous-jacente.</li>
		<li>Confirmer le retrait de toute la capsule externe en vérifiant l’exposition complète de la surface de l’alvéus et de la commissure de l’hippocampe dorsal (DHC). NOTE: Le DHC couvre la partie caudomédiale du CA1. L’alvéus et le DHC se distinguent de la capsule externe par leur orientation fibreuse. À savoir, les fibres dans l’alvéus et le DHC vont dans la direction rostromédiale à caudolatérale, et peuvent être distinguées des fibres dans la capsule externe. L’alvéus et le DHC sont étroitement attachés au CA1 et ne doivent pas être endommagés. Tous les fragments de la capsule externe doivent être enlevés, car tous les fragments restants empêcheront le contact direct de la lamelle de couverture en verre avec l’alvée.</li>
		<li>Confirmez que le saignement a complètement cessé et remplissez le trou avec une solution saline stérile au niveau de la surface du crâne. REMARQUE: Le champ de vision ici aide à juger si le trou est dans la position appropriée pour l’âge spécifique de la souris. Idéalement, l’alvéus et le CA1 sous-jacent devraient occuper la majeure partie de la zone centrale. Une partie de la DHC est visible dans la zone caudomédiale. L’ouverture du VG est détectable au bord rostrolatéral (figure 3A).</li>
	</ol></li>
	<li>Insérez le tube métallique à fond de verre (voir étape 1.1) verticalement dans le trou tout en aspirant l’excès d’eau qui déborde des côtés du tube jusqu’à ce que le fond de verre appuie légèrement contre l’alvéus et aplatisse partiellement le CA1 sous-jacent. REMARQUE: Cette pression doit être ajustée en conséquence. S’il est trop résistant, le CA1 sera endommagé. S’il est trop faible, l’aberration sphérique due à la courbure du CA1 nuira à la résolution de l’imagerie dans les structures profondes.</li>
	<li>À l’aide de ciment de résine dentaire, fixez la paroi du tube inséré au crâne environnant (figure 1C). Assurez-vous que toute la circonférence est hermétiquement scellée et qu’il n’y a pas de fuite d’air ou de LCR. Attendez environ 5 minutes pour que le ciment durcisse. REMARQUE: Si le ciment est placé lorsque sa viscosité est faible, il peut fuir dans le parenchyme cérébral par l’espace entre le tube et le crâne et endommager le cerveau. Par conséquent, le ciment doit être appliqué après le début de la polymérisation, ce qui augmente la viscosité et réduit les fuites à travers l’espace.</li>
	<li>Lavez toute la plaque, le crâne et l’intérieur du tube avec une solution saline stérile pour enlever les débris.</li>
</ol>4. Microscopie à deux photons immédiatement après la chirurgie pour le contrôle de qualité de la chirurgie
<ol><li>Placez la souris dans le dispositif de maintien de la tête sous la lentille objectif du microscope à deux photons et sur l’étage de balayage XY motorisé. Utilisez un coussin chauffant pour le support thermique. Surveillez et ajustez la profondeur de l’anesthésie comme décrit à l’étape 2.1, car ce contrôle de qualité peut prendre jusqu’à 30 minutes. REMARQUE: L’objectif d’immersion dans l’eau avec une distance de travail (WD) supérieure à 3 mm et une ouverture numérique élevée (NA) est recommandé. Un collier correcteur de la lentille d’objectif peut améliorer la résolution en compensant le décalage de l’indice de réfraction entre le verre et les biomatériaux.</li>
	<li>Remplissez l’espace entre le verre et la lentille de l’objectif avec de l’eau, en prenant soin d’éviter les bulles d’air. Si nécessaire, élargissez la surface de la plaque métallique à l’aide d’un film plastique, qui retient plus d’eau, pour couvrir toute la lentille avant de l’objectif.</li>
	<li>Allumez un laser femtoseconde pulsé de longueur d’onde de 920 nm pour l’excitation des sondes fluorescentes exprimées dans le cerveau et démarrez un logiciel d’acquisition d’images.</li>
	<li>Ajustez la mise au point sur le CA1 à l’aide de l’étage motorisé et du système de mise au point motorisé. Positionnez la structure cible avec le guidage de la fluorescence émise par le parenchyme cérébral et de la lumière réfléchie par le bord du tube métallique sous éclairage continu par le laser pulsé.</li>
	<li>Mesurez les profondeurs du parenchyme cérébral touchant le fond de verre en ajustant la mise au point avec le système de mise au point motorisée. Comparez les profondeurs à différents endroits horizontaux pour juger de l’alignement du fond de verre et du plan d’imagerie.<ol><li>Ajustez l’angle de la tête de la souris en inclinant le dispositif de maintien de la tête jusqu’à ce que le fond en verre soit réglé pour être parallèle au plan d’imagerie.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajustez le collier de correction de l’objectif pour obtenir la résolution la plus élevée à la profondeur de la structure cible dans le CA1.</li>
	<li>Confirmer que les cellules fluorescentes dans la couche moléculaire (ML) de la pale supérieure DG à une profondeur de 500 μm du fond de verre peuvent être imagées dans tout le champ de vision. NOTE: Cette étape est importante pour juger de la qualité de la chirurgie. Si le CA1 est endommagé, l’œdème cérébral focal empêche la détection de fluorescence à une profondeur de plus de 200 μm de la surface. Ce n’est que lorsque le CA1 n’est pas endommagé et que la courbure des couches de CA1 est correctement aplatie par la lame de recouvrement sus-jacente que les signaux DG peuvent être détectés immédiatement après la chirurgie (Figure 2A-D). La section Résultats représentatifs fournit un moyen simple de déterminer la limite entre l’AR1 et le DG.</li>
</ol>5. Soins postopératoires
<ol><li>Aspirez l’eau à l’intérieur du tube et recouvrez-le d’un joint en plastique pour empêcher les débris d’entrer.</li>
	<li>Gardez la souris au chaud et attendez la récupération de l’anesthésie.</li>
	<li>Administrer du méloxicam (2 mg / kg) par voie sous-cutanée toutes les 24 heures tant que la souris présente un comportement lié à la douleur.</li>
	<li>Élever la souris postopératoire dans un logement individuel pendant plusieurs semaines.</li>
</ol>6. Imagerie chronique in vivo à deux photons de la microglie à l’aide de souris CX3CR1-GFP
<ol><li>Après l’induction de l’anesthésie, laver l’intérieur du tube métallique avec une solution saline stérile pour enlever les débris. Assurez-vous que l’alvéus blanc de l’hippocampe est visible à travers le verre (Figure 3A) et qu’il n’y a pas de complications telles que des saignements postopératoires.</li>
	<li>Placez la souris sous le microscope à deux photons en suivant les étapes 4.1 à 4.6.</li>
	<li>Vérifier la qualité et l’intensité des images obtenues par excitation à deux photons de l’hippocampe (Figure 3B). S’assurer que les images prises après la réduction de l’œdème postopératoire sont comparables ou supérieures à celles prises le jour de l’intervention (Figure 2A, voir étape 4.5). REMARQUE: La détérioration de l’image indique la présence de lésions tissulaires à l’intérieur du cerveau.</li>
	<li>S’assurer que les microglies ont déjà retrouvé leur morphologie ramifiée (Figure 3C). REMARQUE: Les données d’imagerie de la microglie indiquent qu’au moins 3-4 semaines sont nécessaires pour que la microglie revienne à son état basal.</li>
	<li>Effectuer une imagerie in vivo dans n’importe quelle couche du CA1 aux fins particulières de l’expérience.</li>
</ol>

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</ol>

Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts.

Cette méthode contient des procédures chirurgicales élaborées, mais elle peut fournir des images haute résolution sur l’ensemble du CA1 pendant une période prolongée si elle est préparée correctement. Des expériences avec plusieurs souris ont confirmé que la qualité de l’image dans la phase postopératoire chronique est meilleure que celle de l’imagerie postopératoire aiguë. La meilleure qualité d’image a été maintenue pendant plus de 2 mois. La cause la plus fréquente d’échec est une lésion involontaire du CA1 pendant la chirurgie, qui est identifiée dans le contrôle de qualité postopératoire (voir étape 4). Cela peut être dû à une blessure directe par aspiration, à un assèchement du cerveau, à une pression excessive exercée par le verre ou à une toxicité du ciment dentaire à l’étape finale. Une autre cause d’échec est le saignement postopératoire, qui peut être confirmé par la fenêtre à fond de verre dans la semaine 1 après la chirurgie (voir étape 6.1). Lisez attentivement le protocole et prenez toutes les précautions pour éviter de tels problèmes.
Même avec la configuration actuelle du microscope à deux photons avec des détecteurs GaAsP en laboratoire, la tentative d’imager le CA1 dorsal à travers le cortex entraîne une perte de résolution importante due à la diffusion non négligeable de la lumière. Par conséquent, pour obtenir une résolution suffisante pour observer le mouvement des processus microgliaux ou la formation d’épines dendritiques des neurones dans le CA1, l’élimination d’une partie du cortex sus-jacent est inévitable, comme dans la méthode actuelle. La seule autre façon de réduire l’étendue de l’élimination corticale tout en maintenant une résolution d’image élevée consiste à intégrer une lentille relais, telle qu’une lentille à indice de réfraction de gradient (GRIN). Dans cette approche, une lentille GRIN a été placée à l’intérieur d’un tube de guidage implanté directement au-dessus du CA1 pour l’imagerie chroniqueCA1 28,29. Le diamètre extérieur du tube de guidage était de 1,8 mm, ce qui est inférieur aux 3,0 mm du dispositif dans cet article, tout en produisant une haute résolution (NA; 0,82) comparable au système ici (NA effectif; 0,88). Cependant, l’approche utilisant une lentille GRIN a un champ de vision étroit pour l’observation à haute résolution et une courte profondeur d’imagerie limitée par le WD de la lentille GRIN. Par conséquent, l’imagerie de toutes les couches de l’hippocampe dans un large champ de vision avec une haute résolution est un avantage spécifique de la méthode décrite dans cet article.
Une limitation de cette procédure est que l’élimination partielle du cortex et l’inflammation peuvent avoir des effets néfastes sur l’hippocampe. Cependant, parce que le cortex enlevé n’a pas d’entrée directe dans l’hippocampe, que le cortex entorhinal n’est pas endommagé et que l’hippocampe lui-même n’est pas directement blessé, l’évaluation globale est que la déficience fonctionnelle de l’hippocampe n’est pas significative. Plusieurs études antérieures ont confirmé que les fonctions de l’hippocampe, y compris l’apprentissage et la mémoire, sont préservées après l’implantation de la fenêtre hippocampique 25,26,27,30,31,32,33,34. Par conséquent, l’approche d’imagerie décrite ici devrait rapporter fidèlement les fonctions de l’hippocampe après une période postopératoire suffisante.
Les orientations futures des sujets de recherche basés sur cette technique d’imagerie peuvent inclure l’élagage synaptique détecté par imagerie simultanée de la microglie et des neurones5, l’interaction microgliale liée à l’apprentissage avec les synapses35, la motilité microgliale régulée par l’activité neuronale de l’hippocampe36 et les réponses microgliales à l’inflammation périphérique ou aux lésions tissulaires7. Cette méthode permettra également d’élucider la progression des maladies neurodégénératives. Par exemple, dans la maladie d’Alzheimer (MA), les protéines β amyloïdes et tau s’accumulent parallèlement à la mort des cellules neuronales et à l’atrophie hippocampique, entraînant un dysfonctionnement cognitif; Les microglies ont été signalées comme étant impliquées dans ce processus37,38. L’imagerie chronique in vivo de la microglie et des neurones à l’aide des modèles murins AD nous permettra de surveiller la corrélation entre les fonctions microgliales et la pathologie neuronale dans l’hippocampe des modèles murins AD.
Cet article se concentre sur l’imagerie microgliale, mais la même procédure d’imagerie est applicable aux autres types de cellules neuronales et gliales dans le CA1. De plus, le protocole est limité à l’imagerie de souris anesthésiées, mais la technique peut également être étendue à la surveillance de la microglie hippocampique chez les souris éveillées. Les artefacts de mouvement induits par la respiration, les battements cardiaques et les mouvements du corps, en particulier dans les couches profondes de l’hippocampe loin de la fenêtre en verre, peuvent exister dans des expériences avec des souris éveillées. Par conséquent, un système de correction de mouvement approprié peut être nécessaire pour capturer la morphologie et la dynamique microgliales.
Discussion relative au Protocole Il est conseillé de sélectionner des souris d’âge approprié et de modifications génétiques pour l’expression de sondes fluorescentes présentant une spécificité temporelle et spatiale (voir étape 1.3). Les souris âgées de 1 mois peuvent être utilisées pour des expériences, mais les souris de plus de 2 mois sont plus faciles à manipuler, avec leur plus grande taille et leur résistance au stress chirurgical. De plus, la capsule externe et l’alvéus de l’hippocampe sont plus difficiles à séparer chez les souris plus jeunes. Par conséquent, le retrait de la capsule externe chez les jeunes souris nécessite des compétences chirurgicales (voir les étapes 3.4.3-4). L’évaluation de la chirurgie et l’imagerie subséquente seront plus simples avec des souris exprimant des protéines fluorescentes de manière reproductible et uniforme dans le CA1 et le DG (voir étape 4.7). Par conséquent, dans les essais initiaux de la chirurgie, il est conseillé d’utiliser des souris transgéniques avec des neurones peu marqués, tels que les souris Thy1-YFP ou Thy1-GFP39, ou des souris avec des microglies marquées, telles que les souris CX3CR1-GFP24.
Pour une chirurgie réussie, le choix de l’anesthésie est important (voir étape 2.1). Différents types d’anesthésie peuvent provoquer divers degrés d’œdème cérébral peropératoire, qui affectent la difficulté de la chirurgie, la position relative du tube métallique implanté et l’étendue de la compression cérébrale par la fenêtre en verre. Ces facteurs peuvent également influencer la survie des neurones de l’hippocampe après la chirurgie.
Dans le processus d’aspiration pour exposer l’hippocampe (voir étape 3.4), les points suivants doivent être notés pour minimiser les dommages au cerveau et assurer une imagerie réussie. Fournir constamment une solution saline stérile à la surface des tissus en positionnant une sortie sur le côté de la fenêtre crânienne. Empêcher la surface des tissus de s’exposer à l’air pendant l’aspiration. Le principe de base de l’aspiration tissulaire est d’enlever la surface du tissu par un flux de liquide dans l’embout d’aspiration. Le contact direct de l’embout d’aspiration avec le tissu doit être évité. Réglez la pression négative appliquée au tube d’aspiration pour qu’elle soit minimale. Aspirez le tissu étape par étape et confirmez que le saignement est contrôlé à chaque étape. Lorsque le saignement est prolongé, attendez que le saignement cesse spontanément. Gardez l’aspiration à une courte distance du point de saignement avec un flux constant de solution saline stérile. Aspirez le tissu pour créer un espace cylindrique dont la taille s’adapte au tube métallique à fond de verre (voir étape 1.1). Choisissez des aiguilles de 23 G pour aspirer des vaisseaux piaires épais ou de gros fragments de tissus et des aiguilles de 25 G pour aspirer les petits débris tissulaires.

Les microglies sont les seules cellules immunitaires et les macrophages tissulaires résidant dans le cerveau. En plus de leurs fonctions en tant que cellules immunitaires, telles que la réponse rapide à l’inflammation, il a été démontré qu’elles jouent divers rôles physiologiques dans le maintien et le remodelage des circuits neuronaux, tels que l’élagage synaptique, la régulation de la plasticité synaptique et le contrôle de l’activité neuronale 1,2,3,4,5 . Les interactions physiologiques entre la microglie et les neurones présentent un intérêt croissant à la fois pour le développement des circuits neuronaux et la neurobiologie des maladies. L’analyse de la physiologie de la microglie in vivo nécessite des méthodes pour observer la microglie sans lésions tissulaires ni réponses inflammatoires. Cependant, les microglies sont sensibles à l’inflammation et changent radicalement de forme et de fonction en réponse à des lésions tissulaires 6,7.
L’imagerie in vivo à deux photons est un outil idéal pour capturer la dynamique physiologique de la microglie8. Les premières applications de l’imagerie in vivo à deux photons ont révélé le mouvement dynamique des processus microgliaux pour la surveillance environnementale dans le cortex de souris adulte 9,10. Les études d’imagerie à deux photons suivantes ont étendu la surveillance in vivo de la microglie pour l’analyse des interactions fonctionnelles et structurelles avec les neurones 5,11,12,13,14. Cependant, la profondeur d’imagerie de la microscopie conventionnelle à deux photons a été limitée à moins de 1 mm de la surface du cerveau15,16. Cette contrainte explique la rareté des études antérieures rapportant le comportement de la microglie dans les régions profondes du cerveau, comme l’hippocampe.
Des études récentes de séquençage de l’ARN ont révélé une hétérogénéité régionale considérable de la microglie, ce qui soulève la possibilité de rôles fonctionnels distincts 17,18,19,20,21. Par conséquent, il est nécessaire d’enregistrer les interactions microgliales avec les neurones dans diverses régions du cerveau, mais des difficultés techniques ont entravé de telles études. En particulier, l’implication active microgliale dans le remodelage des synapses a été rapportée comme étant essentielle dans le développement du réseau neuronal hippocampique et de ses fonctions liées à la mémoire22,23. Cependant, des méthodes efficaces pour observer la microglie hippocampique non contestée in vivo n’ont pas été disponibles.
Ce protocole explique les procédures pour l’observation chronique in vivo de la microglie au repos dans le CA1 de l’hippocampe dorsal à l’aide de techniques chirurgicales contrôlées avec précision. L’imagerie à deux photons de la zone CA1 chez les souris CX3CR1-GFP (CX3CR1+/GFP), qui expriment la GFP dans la microglie24, a permis d’observer la microglie ramifiée dans toutes les couches du CA1 avec une résolution suffisante. Le protocole comprend plusieurs conseils pour une implantation réussie de la fenêtre d’observation et des conditions d’imagerie appropriées. De plus, la visualisation simultanée des neurones pyramidaux et de la microglie dans le CA1 est présentée comme un exemple d’application. Les avantages, les limites et les potentiels de cette technique sont également discutés.

<table><tbody><tr><td>23 G Aiguilles émoussées</td><td>NIPRO</td><td>02-166</td><td>Embouts d’aspiration pour l’aspiration.</td></tr><tr><td>Aiguilles émoussées de 25 g</td><td>NIPRO</td><td>02-167</td><td>Embouts d’aspiration pour l’aspiration.</td></tr><tr><td>Poinçons dermiques de 3 mm (DermaPunch)</td><td>Maruho</td><td>213001610</td><td>Outils pour craniotomie.</td></tr><tr><td>Aiguilles 30 G</td><td>Dentronics</td><td>Aiguille jetable n° 30</td><td>Outils pour craniotomie.</td></tr><tr><td>Un laser pulsé femtoseconde</td><td>Spectra-Physics</td><td>MaiTai Deep See</td><td>A laser Ti :Sapphire utilisé à une longueur d’onde de 920 nm.</td></tr><tr><td>Un microscope à deux photons</td><td>Nikon</td><td>A1R MP+</td><td>Microscope pour l’imagerie CA1.</td></tr><tr><td>AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td><td>Penn Vector Core</td><td></td><td>AAV pour le marquage neuronal.</td></tr><tr><td>AAV1-hSyn-Cre</td><td>Penn Vector Core</td><td></td><td>AAV pour le marquage neuronal.</td></tr><tr><td>Un objectif pour l’imagerie à deux photons</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XSVMP</td><td>objectif 25&times avec une longue distance de travail, une grande ouverture numérique et un collier de correction</td></tr><tr><td></td><td>Aspirateurs Shin-ei Industries</td><td>KS-500</td><td>Outils pour l’aspiration.</td></tr><tr><td>Plaques en aluminium</td><td>Narishige</td><td>CP-1</td><td>Plaques en alminum pour la fixation de la tête.</td></tr><tr><td>Crème dépilatoire chimique</td><td>YANAGIYA</td><td></td><td>Crème pour l’épilation autour du site chirurgical.</td></tr><tr><td>Lamelles de recouvrement circulaires en verre</td><td>Matsunami Glass</td><td>3&phi ; N° 1</td><td>Lamelles collées sur des tubes en acier inoxydable.</td></tr><tr><td>Souris CX3CR1-GFP</td><td>Le Jackson Laboratory</td> 008451 <td>souris transgéniques pour l’imagerie microgliale.</td><td></td></tr><tr><td>Tubes cylindriques en acier inoxydable</td><td>MORISHITA</td><td>Tubes métalliques sur mesure</td><td>à implanter. Diamètre extérieur 3,0 mm, diamètre intérieur 2,8 mm, hauteur 1,7 mm.</td></tr><tr><td>Matériau de gravure dentaire</td><td>Sun Medical</td><td>204610461</td><td>Utilisé pour graver les os du crâne.</td></tr><tr><td>Ciment à base de résine dentaire (Super-Bond C& B)</td><td>Sun Medical</td><td>204610555</td><td>Ciment dentaire.</td></tr><tr><td>Cueilleurs de duras (Micro Points)</td><td>Outils de science fine</td><td>10063-15</td><td>Outils pour l’élimination de la dura.</td></tr><tr><td>Pinces fines (Dumont #5)</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>11252-20</td><td>Outils chirurgicaux.</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Bio Research Center</td><td>PRI13-3374</td><td>Utilisé pour désinfecter le site chirurgical.</td></tr><tr><td>Dispositif de maintien de la tête</td><td>Narishige</td><td>MAG-2</td><td>Le dispositif de maintien de la tête des souris avec ajusteurs d’angle</td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Bio Research Center</td><td>BWT-100A et HB-10</td><td>Outils pour fournir un soutien thermique à la souris pendant la chirurgie.</td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>ALA Scientific</td><td>HEATINGPAD-1 et Hot-1</td><td>Outils pour fournir un support thermique à la souris sur le dispositif de maintien de la tête.</td></tr><tr><td>Kétamine (Ketalar)</td><td>Daiichi Sankyo Company</td><td>S9-001665</td><td>Anesthésie pendant la chirurgie.</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>M1959</td><td>Analgésie pendant la chirurgie.</td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique</td><td>Sato Pharmaceutical</td><td></td><td>Utilisé pour prévenir la sécheresse oculaire pendant la chirurgie.</td></tr><tr><td>Solution de gommage à la povidone iodée</td><td>Meiji Seika Pharma</td><td>2612701Q1137</td><td>Utilisé pour désinfecter le site chirurgical.</td></tr><tr><td>Couteaux miniatures à bout rond</td><td>Surgistar</td><td>4769</td><td>Outils chirurgicaux.</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS</td><td>450-098-67</td><td>Outil chirurgical jetable.</td></tr><tr><td>Stéréomicroscopes</td><td>Leica Microsystems</td><td>S8 APO</td><td>Microscopes pour la chirurgie.</td></tr><tr><td>Solution saline stérile</td><td>Otsuka Pharmaceutical Factory</td><td>3311401A2026</td><td>Solution de lavage pendant la chirurgie.</td></tr><tr><td>Tampon étanche stérile</td><td>AS ONE</td><td>8-5945-01 Plate-forme</td><td>chirurgicale.</td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7635</td><td>Un colorant pour l’imagerie in vivo des vaisseaux.</td></tr><tr><td>Champ chirurgical</td><td>Medline Industries</td><td>MP-0606F6T</td><td>Champ perforé pour la chirurgie.</td></tr><tr><td>Lumière UV</td><td>Toshiba</td><td>GL15</td><td>Utilisé pour durcir les adhésifs.</td></tr><tr><td>Adhésifs optiques à durcissement UV</td><td>Thorlabs</td><td>NOA81</td><td>Adhésifs pour le collage de lamelles sur des tubes en acier inoxydable.</td></tr><tr><td>Xylazine (Celactal 2 %)</td><td>Bayer</td><td></td><td>Anesthésie pendant la chirurgie.</td></tr></tbody></table>

in vivo imagerie chronique à deux photons de la microglie dans l’hippocampe de souris

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

La microglie, seule cellule immunitaire résidente dans le cerveau, participe activement au maintien des circuits neuronaux en modifiant les synapses et l’excitabilité neuronale. Des études récentes ont révélé l’expression différentielle des gènes et l’hétérogénéité fonctionnelle de la microglie dans différentes régions du cerveau. Les fonctions uniques du réseau neuronal de l’hippocampe dans l’apprentissage et la mémoire peuvent être associées aux rôles actifs de la microglie dans le remodelage des synapses. Cependant, les réponses inflammatoires induites par les interventions chirurgicales ont été problématiques dans l’analyse microscopique à deux photons de la microglie hippocampique. Ici, une méthode est présentée qui permet l’observation chronique de la microglie dans toutes les couches de l’hippocampe CA1 à travers une fenêtre d’imagerie. Cette méthode permet l’analyse des changements morphologiques dans les processus microgliaux pendant plus de 1 mois. L’imagerie à long terme et à haute résolution de la microglie au repos nécessite des procédures chirurgicales peu invasives, une sélection appropriée des lentilles objectives et des techniques d’imagerie optimisées. La réponse inflammatoire transitoire de la microglie hippocampique peut empêcher l’imagerie immédiatement après la chirurgie, mais les microglies restaurent leur morphologie quiescente en quelques semaines. De plus, l’imagerie simultanée des neurones et de la microglie nous permet d’analyser les interactions de plusieurs types de cellules dans l’hippocampe. Cette technique peut fournir des informations essentielles sur la fonction microgliale dans l’hippocampe.

En utilisant cette technique, la microglie ramifiée et quiescente peut être observée de manière chronique dans toutes les couches du CA1 dorsal, y compris la strate orienne (SO), la strate pyramidale (SP), la strate radiatum (SR) et la strate lacunosum-molécule (SLM), en particulier 3-4 semaines après la chirurgie lorsque l’inflammation disparaît. Si la chirurgie est effectuée de manière appropriée, l’imagerie peut être effectuée jusqu’à plusieurs mois après la chirurgie. Cette section contient trois sujets utiles pour l’évaluation de l’imagerie intravitale. Tout d’abord, des images d’échantillons immédiatement après la chirurgie et dans la phase chronique sont fournies comme références pour les procédures chirurgicales et d’imagerie appropriées. Deuxièmement, la morphologie distincte de la microglie, leur intensité de fluorescence et la distribution des vaisseaux sanguins dans des couches spécifiques de l’hippocampe sont décrites pour aider les lecteurs à estimer la profondeur d’imagerie allant de l’alvéus au DG. Troisièmement, un exemple d’application est fourni qui illustre l’imagerie simultanée des neurones et de la microglie.
Les images représentatives de la microglie chez les souris CX3CR1-GFP immédiatement après la chirurgie sont présentées à la Figure 2. S’il n’y a pas de dommages apparents au CA1 et que la courbure des couches CA1 est correctement aplatie par la lame de recouvrement sus-jacente, les profondeurs d’imagerie à deux photons de la microglie dépassent les couches entières de CA1 et atteignent 500 μm de la surface chirurgicale, où la ML ou la couche de cellules granulaires (GCL) du DG existe (Figure 2A; voir étape 4.7 et Figure 4E). Les microglies sont légèrement moins ramifiées, en particulier dans la couche proche de la surface chirurgicale par rapport à celles de l’hippocampe intact. Néanmoins, ils ne présentent aucune activation proéminente, suggérant des interventions chirurgicales appropriées (Figure 2B). D’autre part, l’œdème dans le CA1 induit par des lésions tissulaires limitera la profondeur d’imagerie à 200 μm (Figure 2C). Les lésions tissulaires induisent également une activation microgliale anormale, telle que l’accumulation de processus de gonflement vers la surface du tissu libre (Figure 2D; comparer à l’image supérieure de la Figure 2B). Ce sont des signes d’une chirurgie inappropriée.
Les images représentatives de la microglie en phase chronique plus de 3 semaines après la chirurgie sont présentées à la figure 3. La microglie peut être imagée à nouveau au-delà du CA1 vers les couches plus profondes du DG avec une intensité et une résolution fluorescentes plus élevées et une distribution plus homogène (voir étape 6.3, Figure 3B). La qualité de l’imagerie est meilleure que celle immédiatement après la chirurgie (Figure 2A). Cette différence peut s’expliquer par une réduction de l’œdème et de l’inflammation. Les microglies de toutes les couches ont déjà restauré leur morphologie ramifiée (Figure 3C), différente de leur aspect postopératoire (Figure 2B). L’imagerie accélérée de la microglie dans le CA1 révèle les corps cellulaires immobiles et les processus très mobiles de surveillance (Vidéo 1-2). Leur comportement mobile est similaire au rapport précédent de la dynamique des processus microgliaux dans le cortex9.
Il est simple de spécifier les couches de l’hippocampe imagées en fonction de la distribution et de la profondeur des corps cellulaires neuronaux, en utilisant des souris exprimant des sondes fluorescentes dans les neurones de l’hippocampe25,26,27. Sans l’aide de l’information positionnelle sur les corps cellulaires des neurones, les signaux de la microglie fluorescente fournissent à eux seuls quelques indices pour l’identification des couches de l’hippocampe (Figure 3B). Les microglies dans l’alvéus ont des corps cellulaires allongés et des processus qui ont tendance à s’étendre le long des voies axonales (Figure 4A). Les microglies dans d’autres couches peuvent être distinguées par leurs corps cellulaires ronds et leurs processus rayonnant sans directions préférées. Les microglies dans SP font partie des neurones pyramidaux densément emballés et peuvent être distinguées par la densité plus faible des processus microgliaux. Les couches au-dessus et au-dessous de SP sont identifiées comme SO et SR, respectivement (Figure 4B). Il est impossible de faire la distinction entre SR et SLM en se basant uniquement sur les propriétés microgliales. La frontière entre le CA1 et le DG est reconnue par des vaisseaux sanguins épais qui longent la frontière (figure 4C). Ces vaisseaux peuvent être mieux reconnus en marquant les vaisseaux avec des colorants tels que la sulforhodamine 101 (SR101; 5 mM, 4 μL/g de poids corporel) injectés par voie intrapéritonéale (Figure 4D). Le signal de fluorescence de la microglie chute fortement dans le DG par rapport au CA1 sus-jacent, probablement en raison de la différence dans l’indice de réfraction de ces structures. Cet écart d’intensité de fluorescence peut également aider à préciser la frontière entre le DG et le CA1. À titre d’exemple d’application, l’imagerie simultanée de microglies GFP positives et de neurones pyramidaux marqués par tdTomate est présentée (Figure 4E). Dans cette expérience, des souris CX3CR1-GFP ont reçu une injection de virus adéno-associé (AAV) pour l’expression de tdTomato dans les neurones pyramidaux de l’hippocampe. Le marquage neuronal aidera à comprendre les structures de couches exactes du CA1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig01.jpg"> Figure 1: Dessins schématiques pour l’implantation de la fenêtre d’observation . (A) Vue en coupe transversale du tube métallique assemblé à fond de verre. Un couvercle circulaire en verre adhère à une extrémité du tube cylindrique en acier inoxydable. (B) Vue en coupe transversale de la plaque d’aluminium attachée au crâne. La plaque doit être parallèle à la surface marquée du crâne afin de ne pas interférer avec la lentille de l’objectif, positionnée près de la plaque pour la mise au point. (C) Vue en coupe transversale du tube implanté. Le fond de verre doit être étroitement attaché à l’alvéus de l’hippocampe pour appuyer doucement et aplatir la surface du CA1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig02.jpg"> Figure 2 : Imagerie in vivo de la microglie chez des souris CX3CR1-GFP immédiatement après la chirurgie. (A) Reconstruction 3D représentative à partir de l’imagerie CA1 in vivo d’une souris CX3CR1-GFP le jour postopératoire (POD) 0 (largeur: 511 μm, hauteur: 511 μm, profondeur: 550 μm). La microglie fluorescente dans le ML du DG à une profondeur de 500 μm du fond de verre peut être imagée à travers l’ensemble du CA1. (B) Les microglies typiques remplies de GFP obtenues en (A) sont représentées comme les projections d’intensité maximale (MIP) de piles d’images d’une épaisseur de 20 μm à des profondeurs de 100, 300 et 520 μm du fond du verre. La morphologie microgliale est détectable à partir du CA1 superficiel jusqu’au ML du DG, bien qu’avec une détérioration apparente de l’image dans le DG. Les microglies, en particulier dans la couche proche de la surface chirurgicale, sont moins ramifiées mais ne présentent aucune activation évidente. Barres d’échelle, 50 μm. (C) Reconstruction d’image 3D représentative du CA1 endommagé chirurgicalement. Les données ont été acquises à partir d’une souris CX3CR1-GFP sur POD 0 (largeur : 399 μm, hauteur : 399 μm, profondeur : 450 μm). La fluorescence microgliale n’est détectable que jusqu’à la profondeur de 200 μm, contrairement au CA1 (A) non endommagé avec microglie fluorescente détectée à une profondeur de 500 μm. (D) L’image typique de la microglie anormalement activée en (C). La PIM des piles d’images GFP d’une épaisseur de 20 μm à une profondeur de 60 μm montre des processus de gonflement microglial s’étendant vers la surface des tissus exposés chirurgicalement. La morphologie microgliale globale est différente de l’image montrée en (B). Barre d’échelle, 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig03.jpg"> Figure 3 : Imagerie in vivo de la microglie chez des souris CX3CR1-GFP en phase chronique. (A) L’aspect représentatif de la fenêtre implantée sur le CA1 dorsal droit en phase chronique. À travers le fond de verre, les fibres blanches de l’alvéus sont clairement observées sans saignement postopératoire. Le DHC et le VG sont partiellement visibles dans la zone caudomédiale et dans le bord rostrolatéral, respectivement. Barre d’échelle, 1 mm. (B) Reconstruction 3D représentative à partir de l’imagerie CA1 chronique in vivo d’une souris CX3CR1-GFP sur POD 24 (largeur: 511 μm, hauteur: 511 μm, profondeur: 670 μm). Par rapport aux images immédiatement après la chirurgie (Figure 2A), la microglie montre une distribution plus homogène et peut être observée plus clairement dans les couches profondes du DG en raison de la réduction de l’œdème et de l’inflammation. (C) Les images typiques de microglies de (B) avec une morphologie ramifiée entièrement restaurée sont présentées comme les MIP des piles d’images GFP avec une épaisseur de 20 μm à des profondeurs de 100, 280 et 500 μm de la surface chirurgicale. Barres d’échelle, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig04.jpg"> Figure 4 : Indices permettant d’identifier chaque couche de l’hippocampe au cours de l’imagerie in vivo et exemple d’application de cette méthode. (A) L’image typique de la microglie dans l’alvéus de souris CX3CR1-GFP en phase chronique. Les corps cellulaires microgliaux et les processus s’étendant le long des voies axonales sont représentés dans la PIM des piles d’images GFP d’une épaisseur de 10 μm à une profondeur de 15 μm. Barre d’échelle, 50 μm. (B) Images représentatives de la microglie dans SO, SP et SR dans la phase chronique montrées comme la MIP des piles d’images GFP avec une épaisseur de 5 μm. La densité locale des processus microgliaux est plus faible dans SP que dans SO ou SR environnant en raison des neurones pyramidaux densément emballés dans SP. Barres d’échelle, 100 μm. (C) Les vaisseaux sanguins épais longeant la frontière entre le CA1 et le DG ne peuvent être reconnus que par la fluorescence microgliale. La projection d’intensité moyenne d’empilements d’images GFP en mosaïque d’une épaisseur de 90 μm dans la phase chronique à une profondeur d’environ 500 μm est montrée. Le vide du signal GFP correspond aux vaisseaux épais. Barre d’échelle, 500 μm. (D) (supérieur) Image du même champ de vision que C après injection intrapéritonéale de SR101. Barre d’échelle, 500 μm. (inférieur) Reconstruction 3D des images de pavage après injection de SR101 (largeur : 2,60 mm, hauteur : 1,73 mm, profondeur : 0,69 mm). Les vaisseaux épais longeant la frontière entre le CA1 et le DG peuvent être facilement reconnus par la fluorescence intravasculaire SR101. (E) (à gauche) reconstruction 3D du CA1 et du DG (largeur: 255 μm, hauteur: 255 μm, profondeur: 730 μm) et (droite) la MIP de la fluorescence GFP et tdTomate en SP réalisée à partir de piles d’images de 20 μm d’épaisseur. À 1 semaine avant la chirurgie, 1,5 μL d’un mélange de AAV1-CAG-FLEX-tdTomate (5,0 x 10 12 vg/mL) et AAV1-hSyn-Cre (1,0 x10 9 vg/mL) a été injecté dans l’hippocampe d’une souris CX3CR1-GFP pour marquer les neurones avec parcimonie. L’imagerie a été réalisée sur POD 0. SP et GCL sont facilement reconnaissables par la position des corps cellulaires neuronaux. Barre d’échelle, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Vidéo 1 : Imagerie accélérée de la microglie SO en phase chronique. Le MIP de GFP empile des images avec une épaisseur de 20 μm dans l’imagerie accélérée de la microglie SO, animée de sorte que 28 min de lecture en 1 seconde. Barre d’échelle, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/Video1.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Vidéo 2 : Imagerie accélérée de la microglie SR en phase chronique. Le MIP de GFP empile des images avec une épaisseur de 20 μm dans l’imagerie accélérée de la microglie SR, animée de sorte que 28 min de lecture en 1 seconde. Barre d’échelle, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/Video2.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>

Cet article décrit une méthode d’observation chronique in vivo de la microglie au repos dans l’hippocampe de souris CA1 à l’aide d’une chirurgie contrôlée avec précision et d’une microscopie à deux photons.

In vivo Imagerie chronique à deux photons de la microglie dans l’hippocampe de souris

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

Les rôles de la microglie dans l’hippocampe ne sont pas encore entièrement compris. Ce protocole peut directement imager comment les microglies entrent en contact et régulent les neurones. L’imagerie in vivo de la microglie au repos et des neurones dans l’hippocampe a été très difficile.Cette méthode peut résoudre ce problème. Pour implanter la fenêtre d’observation, faites une rainure circulaire de trois millimètres sur le crâne à l’aide d’un poinçon dermique, en assurant l’alignement de la rainure avec la zone précédemment marquée. Lorsque le coup de poing dermique atteint la couche la plus interne du crâne avant de toucher la mère sous-jacente, soulevez doucement l’îlot osseux central à l’aide d’une aiguille de calibre 30.Ensuite, retirez soigneusement la dure-mère à l’aide d’un sélecteur de dure-dure. Aspirez le pia, les vaisseaux piaux et le tissu cortical de la surface. Gardez la profondeur de la surface des tissus exposés homogène sur toute la fenêtre crânienne et approfondissez progressivement l’aspiration jusqu’à ce que les fibres de la capsule externe soient exposées.Après avoir positionné l’embout d’aspiration sur la capsule externe près du ventricule latéral à l’extrémité rostrolatérale de la fenêtre crânienne, retirez la couche superficielle de la capsule externe qui court dans le caudomédial jusqu’à la direction rostrolatérale. Ensuite, retirez la couche interne dans le sens médiolatéral. Confirmer le retrait de toute la capsule externe en vérifiant l’exposition complète de la surface de l’alvéus et de la commissure de l’hippocampe dorsal.Après vous être assuré que le saignement a complètement cessé, remplissez le trou avec une solution saline stérile au niveau de la surface du crâne. Ensuite, insérez le tube métallique à fond de verre verticalement dans le trou tout en aspirant l’excès d’eau débordant des côtés du tube jusqu’à ce que le fond en verre appuie légèrement contre l’alvéus et aplatisse partiellement le CA1 sous-jacent. À l’aide du ciment de résine dentaire, fixez la paroi du tube inséré au crâne environnant.Placez la souris dans le dispositif de maintien de la tête sous la lentille de l’objectif du microscope à deux photons et sur l’étage de balayage XY motorisé. Remplissez ensuite l’espace entre le fond en verre et la lentille de l’objectif avec de l’eau sans créer de bulles d’air. Ajustez la mise au point sur CA1 avec le guidage de la fluorescence émise par le parenchyme cérébral et la lumière réfléchie par le bord du tube métallique sous éclairage continu par le laser pulsé.Ajustez l’angle de la tête de la souris en inclinant le dispositif de maintien de la tête de sorte que le fond du verre soit parallèle au plan d’imagerie. Ajustez ensuite le collier correcteur de l’objectif pour obtenir la résolution la plus élevée à une profondeur de la structure cible dans le CA1. Ensuite, confirmez que les cellules fluorescentes dans la couche moléculaire du gyrus denté ou DG à une profondeur de 500 micromètres du fond de verre sont imagées dans tout le champ de vision.Ce n’est qu’en cas de réussite chirurgicale que les signaux DG peuvent être détectés immédiatement. Élever la souris postopératoire dans un logement individuel pendant plusieurs semaines. Placez la souris anesthésiée sous le microscope à deux photons.Effectuer l’imagerie de l’hippocampe. Confirmez si la qualité et l’intensité des images capturées après la réduction de l’œdème postopératoire sont meilleures ou comparables à celles capturées le jour de la chirurgie. S’assurer que les microglies ont retrouvé leur morphologie ramifiée.Effectuez ensuite une imagerie in vivo sur la couche d’intérêt dans le CA1. La microglie chez les souris CX3CR1-GFP capturées immédiatement après la chirurgie n’a montré aucune activation importante. Après une chirurgie réussie sans induction d’œdème, les profondeurs d’imagerie à deux photons dépassaient l’ensemble des couches CA1 et atteignaient 500 micromètres de la surface chirurgicale.La microglie dans la phase chronique de plus de trois semaines après la chirurgie a montré une intensité et une résolution fluorescentes plus élevées et une distribution plus homogène en raison de la réduction de l’œdème et de l’inflammation. Les microglies dans toutes les couches ont déjà restauré leur morphologie ramifiée et présenté des corps cellulaires immobiles et des processus hautement modaux. Les images haute résolution sur l’ensemble du CA1 ont été fournies pendant plusieurs mois.Les signaux de la microglie fluorescente aident à identifier les couches de l’hippocampe. La microglie dans l’alvéus avait des corps cellulaires allongés et des processus s’étendant le long des voies axonales. La microglie dans la strate pyramidale pourrait être distinguée par la densité plus faible de leurs processus.La frontière entre le CA1 et le DG pouvait être reconnue par des vaisseaux sanguins épais le long de la frontière, ce qui était mieux reconnu par l’étiquetage des vaisseaux avec de la sulforhodamine 101. À titre d’exemple d’application, la microglie GFP positive et les neurones pyramidaux marqués tdTomato ont été imagés simultanément. Le marquage neuronal a permis de comprendre les structures de couches exactes du CA1.Le point le plus important est de réduire les dommages chirurgicaux. Éviter les lésions tissulaires par aspiration. Appliquez une légère pression lors de l’insertion du fond de verre et évitez que le ciment dentaire ne touche la surface du cerveau.Cette approche aidera à identifier le rôle de la microglie dans l’hippocampe. Par exemple, comment les microglies interagissent avec les neurones, comment ils sont impliqués dans l’apprentissage et comment ils contrôlent les maladies du cerveau.

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