Name: Développement de lignées cellulaires musculaires Knock-Out à l’aide de l’édition de gènes CRISPR/Cas9 médiée par le lentivirus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Découvrez la génération de myoblastes knock-out par CRISPR/Cas9 pour étudier la fonction des gènes musculaires. Cette méthode rapide et économique facilite l'analyse des myopathies et l'édition génique ciblée.

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Ces travaux ont été financés par des subventions de l’Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) et d’Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).

<ol><li>Claussnitzer, M., Susztak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+insight+into+metabolic+diseases+from+human+genetic+discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries.</a> Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).</li>
<li>Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR+tools+for+variant+interpretation+and+disease+modeling+in+inherited+retinal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies.</a> Genes. 11 (5), 473(2020).</li>
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<li>Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+specificity+of+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Target specificity of the CRISPR-Cas9 system.</a> Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).</li>
<li>Merienne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+self-inactivating+KamiCas9+system+for+the+editing+of+CNS+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes.</a> Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).</li>
<li>Marty, I., Fauré, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation-contraction+coupling+alterations+in+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Excitation-contraction coupling alterations in myopathies.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).</li>
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<li>Garibaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dusty+core+disease%27+%28DuCD%29%3A+expanding+morphological+spectrum+of+RYR1+recessive+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Dusty core disease' (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3(2019).</li>
<li>Marty, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+a+complex+involving+Dihydropyridine+receptor+and+Ryanodine+receptor+in+triad+junctions+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).</li>
<li>Oddoux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triadin+deletion+induces+impaired+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1, 34(2011).</li>
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<li>Luis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+old+and+the+new%3A+Prospects+for+non-integrating+lentiviral+vector+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology.</a> Viruses. 12 (10), 1103(2020).</li>
<li>Leenay, R. T., Beisel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering%2C+communicating%2C+and+engineering+the+CRISPR+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 4, Unit 4.21 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Une étape majeure sur la voie de la caractérisation des gènes de fonction inconnue impliqués dans les pathologies est le développement de modèles cellulaires pertinents pour étudier la fonction de ces gènes. L’utilisation de l’édition de gènes à l’aide de CRISPR / Cas9 est un domaine de recherche en croissance exponentielle, et le développement de modèles knock-out tels que présentés ici est l’une de ses applications les plus largement utilisées. Dans ce contexte, nous proposons ici un protocole polyvalent pour développe...

Avec les progrès du séquençage des gènes et l’identification de mutations dans les gènes de fonctions inconnues dans un tissu spécifique, le développement de modèles cellulaires pertinents pour comprendre la fonction d’un nouveau gène cible et confirmer son implication dans les mécanismes physiopathologiques connexes constitue un outil essentiel. En outre, ces modèles sont d’une importance majeure pour les développements thérapeutiques futurs 1,2 et constituent une alternative intéressante au développement de modèles animaux knock-out en ligne droite avec les recommandations internationales pour la réduction de l’utilisation d’animaux dans l’expérimentation. L’édition de gènes à l’aide de CRISPR/Cas9 est l’un des outils les plus puissants actuellement disponibles, ce qui a permis le développement de nombreux modèles knock-out/knock-in, et la validation ciblée de gènes à l’aide de CRISPR/Cas9 est l’une des applications les plus utilisées de CRISPR/Cas93. Le succès de l’édition de gènes repose sur la capacité d’introduire les outils CRISPR (les ARN guides et la nucléase Cas9) dans le modèle cellulaire cible, ce qui peut être un défi dans de nombreuses cellules difficiles à transfecter, telles que les cellules musculaires4. Ce défi peut être surmonté avec l’utilisation de virus, généralement le lentivirus, qui a le grand avantage de transduire efficacement de nombreux types de cellules et de délivrer son transgène. Mais son inconvénient majeur est l’intégration du transgène dans le génome de la cellule hôte, conduisant à une altération potentielle des gènes localisés sur le site d’intégration et à l’expression permanente du transgène, ce qui, dans le cas de la nucléase Cas9, entraînerait des conséquences dommageables5. Une solution intelligente a été proposée par Merienne et ses collègues6, qui consiste à introduire dans les cellules un ARN-guide ciblant le gène Cas9 lui-même, conduisant à l’inactivation de Cas9. Une adaptation de cette stratégie est présentée ici comme un protocole convivial et polyvalent permettant d’éliminer pratiquement n’importe quel gène dans les cellules difficiles à transfecter.
Le but du protocole présenté ici est d’induire l’inactivation d’un gène d’intérêt dans les cellules musculaires immortalisées. Il peut être utilisé pour éliminer n’importe quel gène d’intérêt, dans différents types de cellules immortalisées. Le protocole décrit ici contient des étapes pour concevoir les ARN guides et leur clonage en plasmides lentiviraux, pour produire les outils CRISPR dans des vecteurs lentiviraux, pour transduire les cellules avec les différents lentivirus et pour cloner les cellules pour produire une lignée cellulaire modifiée homogène.
En utilisant ce protocole, des cellules musculaires squelettiques humaines immortalisées ont été développées avec délétion du récepteur de la ryanodine de type 1 (RyR1), un canal calcique essentiel impliqué dans la libération intracellulaire du calcium et la contraction musculaire7. L’élimination (KO) du gène a été confirmée au niveau de la protéine à l’aide du transfert Western et au niveau fonctionnel à l’aide de l’imagerie calcique.

<table><tbody><tr><td>Anticorps anti-CACNA1S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA048892</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>Blp I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0585S</td><td>Enzyme de restriction</td></tr><tr><td>CalPhos Kit de transfection de mammifères</td><td>Takara</td><td>631312&nbsp ;</td><td>Kit de transfection</td></tr><tr><td>Easy blot anti souris IgG GeneTex</td><td></td><td>GTX221667-01</td><td>HRP anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Easy blot anti Rabbit IgG GeneTex</td><td></td><td>GTX221666</td><td>HRP anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Fluo-4 direct Molecular</td><td>Sobes F10472</td><td></td><td>Imagerie calcique</td></tr><tr><td>GAPDH(14C10) Rabbit mAb&nbsp ;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2118</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Fermentas</td><td>ER0501</td><td>Enzyme de restriction</td></tr><tr><td>InFusion HD Precision Plus</td><td>Takara</td><td>638920</td><td>Kit de ligature</td></tr><tr><td>MasterMix Phusion High Fidelity avec GC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F532L</td><td>Mix pour réaction PCR avec anticorps haute fidélité Taq polymerase et dNTPs</td></tr><tr><td>Myosin Heavy Chain</td><td>DHSB</td><td>MF20</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>REF&nbsp ; 740424</td><td>Maxipréparation Kit pour la purification des plasmides</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel et PCR Nettoyage</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td>Purification de l’ADN</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952</td><td>Kit pour l’extraction de l’ADN de la cellule</td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 Chimiquement compétent E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C737303</td><td>Cellules chimiquement compétentes</td></tr><tr><td>Plasmide #87904</td><td>Addgene</td><td>87904</td><td>Plasmide lentiviral codant pour le SpCas9 (pour LV-Cas9)</td></tr><tr><td>Plasmide #87919</td><td>Addgene</td><td>87919</td><td>Squelette lentiviral pour l’insertion d’une cassette avec des guides (pour LV-guide-cible)</td></tr><tr><td>Plasmide #12260</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Plasmide lentiviral codant pour lentiviral Emballage lentiviral GAG POL</td></tr><tr><td>Plasmide #8454</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>Plasmide lentiviral codant pour la production de particules rétrovirales lentivirales et MuLV</td></tr><tr><td>V5 Tag Anticorps monoclonal</td><td>Invitrogene</td><td>R96025&nbsp ;</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>XL10-Gold Cellules ultracompétentes</td><td>Agilent</td><td>200317</td><td>Cellules chimiquement compétentes</td></tr><tr><td>Xma I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0180S</td><td>Enzyme de restriction</td></tr></tbody></table>

développement de lignées cellulaires musculaires knock-out à l’aide de l’édition de gènes crispr/cas9 médiée par le lentivirus

Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

Une application importante des courtes répétitions palindromiques régulatrices groupées (CRISPR) / Cas 9 est le développement de lignées cellulaires knock-out, en particulier pour étudier la fonction de nouveaux gènes / protéines associés à une maladie, identifiés lors du diagnostic génétique. Pour le développement de telles lignées cellulaires, deux questions majeures doivent être démêlées : l’insertion des outils CRISPR (le Cas9 et l’ARN guide) avec une grande efficacité dans les cellules choisies, et la restriction de l’activité Cas9 à la délétion spécifique du gène choisi. Le protocole décrit ici est dédié à l’insertion des outils CRISPR dans des cellules difficiles à transfecter, telles que les cellules musculaires. Ce protocole est basé sur l’utilisation de lentivirus, produits avec des plasmides accessibles au public, pour lesquels toutes les étapes de clonage sont décrites pour cibler un gène d’intérêt. Le contrôle de l’activité de Cas9 a été réalisé à l’aide d’une adaptation d’un système précédemment décrit appelé KamiCas9, dans lequel la transduction des cellules avec un lentivirus codant pour un ARN guide ciblant le Cas9 permet l’abolition progressive de l’expression de Cas9. Ce protocole a été appliqué au développement d’une lignée cellulaire musculaire humaine RYR1-knock-out, qui a été caractérisée au niveau protéique et fonctionnel, pour confirmer l’élimination de cet important canal calcique impliqué dans la libération de calcium intracellulaire musculaire et dans le couplage excitation-contraction. La procédure décrite ici peut facilement être appliquée à d’autres gènes dans les cellules musculaires ou dans d’autres cellules difficiles à transfecter et produire des outils précieux pour étudier ces gènes dans les cellules humaines.

Ce protocole a été appliqué aux myoblastes immortalisés d’un sujet sain15 (cellules dites HM, pour les myoblastes humains), dans lequel le RyR1 a déjà été caractérisé16, afin d’éliminer le gène RYR1 codant pour la protéine RyR1. La conception de l’ARN guide a été faite pour supprimer la séquence englobant une partie de l’exon 101 et de l’intron 101 du gène. La suppression d’une partie de l’exon 101 devrait entraîner une perturbation du cadre de lecture. De plus, l’...

Le protocole décrit comment générer des myoblastes knock-out à l’aide de CRISPR/Cas9, de la conception des ARN guides au clonage cellulaire et à la caractérisation des clones knock-out.

Développement de lignées cellulaires musculaires Knock-Out à l’aide de l’édition de gènes CRISPR/Cas9 médiée par le lentivirus

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

Ce protocole permet le développement de l’élimination des cellules musculaires dans n’importe quel gène, afin d’étudier plus avant la fonction de ce gène dans le muscle. L’avantage est qu’il est bon marché et plus rapide que le développement d’animaux knock-out d’étudier n’importe quel gène. Cette technique peut être utilisée, par exemple, pour étudier l’implication d’un gène nouvellement identifié dans une myopathie.Si la technique décrite ici est appliquée aux cellules iPS, elle peut conduire au développement de cellules knock-out pour n’importe quel gène dans n’importe quel type de cellules. Pour commencer à regrouper régulièrement de courtes répétitions palindromiques espacées ou une délétion génique médiée par CRISPR, utilisez d’abord des outils de navigateur de génome comme ensembl. org pour identifier le gène cible ainsi que les séquences d’ADN des deux côtés de celui-ci.Pour obtenir la liste des exons du gène, cliquez d’abord sur la transcription de la séquence codante de la protéine, puis sur Exons. Ensuite, cliquez sur Télécharger la séquence et sélectionnez uniquement séquence génomique pour télécharger la séquence de consensus complète de l’ensemble du gène. Faites défiler la liste des exons et des introns du gène pour sélectionner ceux qui sont ciblés.Pour concevoir l’ARN guide, sélectionnez d’abord les séquences nucléotidiques des introns immédiatement en amont et en aval de la séquence cible. Ensuite, allez sur un site Web tel que crispr.tefor. net et utiliser les séquences sélectionnées pour concevoir deux ARN guides, chacun de 20 nucléotides de long sans le protospacer adjacent Motif séparé par quelques centaines de paires de bases.Déterminez ensuite la séquence du complément inverse pour chaque ARN guide et ordonnez les amorces. Pour construire des cassettes d’ARN guides pour le clonage de plasmides, exécutez d’abord une PCR avec un ensemble d’amorces en utilisant la recette et le programme décrits dans le texte, puis séparez les produits pcR dans un gel d’agarose à 1% à l’aide d’un tampon Tris-borate-EDTA. Ensuite, éliminez le fragment de paire de 300 bases et purifiez-le à l’aide d’un kit.De même, après avoir exécuté une autre PCR avec l’autre ensemble d’amorces, purifiez un fragment d’ADN long de 400 bases en 20 microlitres de tampon d’élution. Pour insérer les cassettes d’ARN guide dans un squelette plasmidique lentiviral, mettez d’abord en place une double réaction de digestion du plasmide avec les enzymes de restriction Xma 1 et Blp 1 comme décrit dans le texte. Après avoir incubé le tube réactionnel à 37 degrés Celsius pendant une heure, incubez-le à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes, puis exécutez le produit de digestion dans un gel d’agarose à 1% et purifiez le plasmide d’environ 10 paires de kilobases à l’aide d’un kit approprié.Quantifiez également le produit purifié en mesurant la densité optique. Pour ligaturer la cassette d’ARN guide avec le plasmide, préparez un mélange réactionnel avec l’ARN guide purifié, l’ADN plasmidique linéarisé, l’enzyme et l’eau jusqu’à un volume final de 10 microlitres, puis incubez le tube de réaction à 50 degrés Celsius pendant 15 minutes pour générer le plasmide final, appelé pGuide. Pour la production de lentivirus, commencez par semer une plaque de 145 centimètres avec 1 million de cellules HEK 293 dans du DMEM avec un taux élevé de glucose et de pyruvate complété par 10% FBS et 1% de pénicilline ou de streptomycine.Ensuite, cultivez les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois jours dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone. Le quatrième jour, vérifiez les cellules pour vous assurer d’une confluence de 60 à 65%. Ensuite, préparez la solution de transfection composée du plasmide d’intérêt, du plasmide codant pour l’enveloppe du virus, du plasmide d’emballage lentiviral psPAX2 et du phosphate de calcium.Réglez le volume final à 1000 microlitres avec de l’eau. Ensuite, ajouter la solution de transfection goutte à goutte à un millilitre de 2X HBS sous agitation et incuber à température ambiante pendant au moins 10 minutes. Après cela, ajoutez la solution goutte à goutte aux cellules.Pour une distribution homogène de la solution de transfection, inclinez doucement la plaque dans toutes les directions, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone pendant au moins cinq heures. Ensuite, retirez le support des plaques et lavez les cellules avec du PBS pour vous débarrasser des réactifs de transfection, puis ajoutez 12 millilitres de milieu frais. Après 48 heures d’incubation à 37 degrés Celsius, regrouper le milieu de toutes les plaques dans un tube.Mettez le tube dans un seau scellé et centrifugez à 800 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, puis filtrez le surnageant à l’aide d’un filtre de 0,45 micromètre et centrifugez le filtrat à 68 300 fois G pendant deux heures à quatre degrés Celsius, à l’aide d’un rotor à godet oscillant. Après avoir retiré le surnageant, gardez les tubes à l’envers sur une serviette en papier dans une armoire de sécurité pendant cinq à 10 minutes pour éliminer au maximum le liquide des granulés. Ajouter 100 microlitres de milieu de prolifération HEC et maintenir les tubes à quatre degrés Celsius pendant au moins deux heures.Ensuite, remettez en suspension la pastille par pipetage. Après avoir collecté toutes les pastilles remises en suspension, faites des aliquotes de 10 ou 25 microlitres, puis stockez les aliquotes à moins 80 degrés Celsius après congélation instantanée dans de l’hydrogène liquide. Pour la transduction des myoblastes, commencez par ensemencer chaque puits d’une plaque de 96 puits avec 100 microlitres de milieu de prolifération contenant 10 000 cellules myoblastiques.Le lendemain, ajoutez des volumes précalculés de guides BT et de LV Cas9 aux cellules d’une armoire de sécurité. Après cinq jours d’incubation, libérez les cellules du puits en ajoutant de la trypsine. Après avoir compté le nombre de cellules, transférez les cellules des puits avec une confluence de 40 à 50% vers une nouvelle plaque.Après cinq heures d’incubation, ajouter les volumes calculés de tueur LV à une multiplicité d’infection de 20 et incuber pendant cinq à 10 jours ou au moins deux passages entre les deux. Pour la caractérisation fonctionnelle des clones génétiquement modifiés par imagerie calcique, plaque 50 000 cellules au centre d’une boîte de 35 millimètres recouverte de laminine. Pour induire la différenciation, ajoutez le support de différenciation décrit dans le texte.Après six jours d’incubation, retirez le milieu de culture et délimitez les cellules avec un stylo hydrophobe. Ajoutez ensuite 50 microlitres de Fluo-4 Direct, dilués un à un dans un milieu de différenciation, aux myotubes différenciés. Après avoir incubé la vaisselle à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, lavez les cellules deux fois avec un tampon Krebs complété par un milligramme par millilitre de glucose.Ensuite, utilisez un microscope à fluorescence inversée ou un microscope confocal avec un objectif 10X pour mesurer les variations de fluorescence à une fréquence d’une image par seconde pendant 90 secondes et choisissez un champ avec au moins 10 myotubes. Après avoir retiré le tampon Krebs supplémentaire, stimuler les cellules avec deux millilitres de chlorure de potassium pour la dépolarisation de la membrane ou deux millilitres de florochloral métacrésol ou 4CmC ou RyR1 stimulation directe. Visualisez la variation de fluorescence après stimulation, puis quantifiez la variation de fluorescence dans chaque myotube.Ce protocole pourrait être utilisé avec succès pour éliminer le gène RyR1 des myoblastes humains, ce qui a entraîné une réduction de l’ADN génomique dans les cellules. L’élimination de RyR1 a également été confirmée au niveau de la protéine, car la protéine RyR1 n’a pas pu être détectée dans les cellules ciblées par transfert Western. L’absence d’activité de RyR1 dans les myotubes différenciés des cellules knock-out de RyR1 a été vérifiée par imagerie calcique Fluo-4 après stimulation directe de RyR1 par 4CmC ou stimulation indirecte par dépolarisation membranaire induite par le chlorure de potassium.La séquence qui sera supprimée devrait être nécessaire à la prédiction d’une protéine fonctionnelle. Cette technique est idéale pour le développement d’outils post-génomiques permettant d’étudier l’implication d’un nouveau gène dans les maladies musculaires.

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Le système / cas9 CRISPR offre la possibilité de faire éditer génome ciblé accessible et abordable pour la communauté scientifique. Ce protocole vise à démontrer comment créer des virus qui Knockout un gène d'intérêt en utilisant le système / cas9 CRISPR, puis les injecter stéréotaxique dans le cerveau de souris adulte.

Design et emballage, et de livraison de titre élevé CRISPR Retro et lentivirus via stéréotaxique Injection

Les progrès récents dans la capacité de manipuler génétiquement les lignées cellulaires somatiques offrent un grand potentiel pour la recherche fondamentale et appliquée. Ici, nous présentons deux approches pour la production et le dépistage de knock-out créés par CRISPR / Cas9 dans des lignées cellulaires de mammifères, avec et sans utilisation de marqueurs sélectionnables.

Génération indépendante et dépendante de la sélection de CRISPR / Cas9-Meded Knockouts dans les cellules de mammifères

Un protocole pour rapide CRISPR/Cas9-mediated disruption de génique chez la souris et des cellules hématopoïétiques humaines primaires est décrit dans cet article. Ribonucléoprotéines Cas9-sgRNA sont introduits par électroporation avec sgRNAs des vicitimes in vitro de transcription et commerciale Cas9. Édition de hautes efficacités sont réalisées avec peu de temps et de coût financier.

Perturbation de gène hautement efficace des cellules progénitrices hématopoïétiques murins et humains par CRISPR/Cas9

Nous présentons ici un protocole visant à modifier génétiquement les cellules primaires ou agrandis humaines tueuses naturelles (NK) à l’aide de Cas9 ribonucléoprotéines (Cas9/RNP). En utilisant ce protocole, nous avons généré des cellules NK humaines déficients pour transformer le récepteur du facteur de croissance – b 2 (TGFBR2) et de l’hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Génération des cellules de knock-out primaire et élargi NK humaine à l’aide de Cas9 ribonucléoprotéines

Les protocoles décrits pour l'édition génomique très efficace des cellules hématopoïétiques et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) par le système CRISPR/Cas9 pour développer rapidement des systèmes de modèle de souris avec des modifications génétiques hématopoïétiques spécifiques au système.

Modification du génome de Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated pour l'étude des cellules hématopoïétiques dans les modèles de maladie

Nous présentons ici un protocole pour le développement de modèles murins génétiquement modifiés utilisant des cellules souches embryonnaires, en particulier pour les grands knock-in d’ADN (KI). Ce protocole est mis au point à l’aide de l’édition du génome CRISPR / Cas9, ce qui permet d’améliorer considérablement l’efficacité du KI par rapport à la méthode conventionnelle de ciblage de l’ADN linéarisé par recombinaison homologue.

Ciblage génique hautement efficace médié par CRISPR/Cas9 dans des cellules souches embryonnaires pour le développement de modèles murins manipulés par des gènes

À mesure que les protocoles liés à CRISPR deviennent de plus en plus utiles et accessibles, des complications et des obstacles peuvent encore survenir dans des conditions expérimentales spécifiques. Ce protocole décrit la création d’une lignée cellulaire humaine knock-out sérine/thréonine-protéine kinase 1 (RIPK1/RIP1) à l’aide de CRISPR/Cas9 et met en évidence les défis potentiels rencontrés au cours de ce processus.

Génération d’une lignée cellulaire RIP1 knockout U937 à l’aide du système CRISPR-Cas9

La méthode présentée décrit la génération d’un gène knock-out médié par CRISPR dans la lignée H9 de cellules souches embryonnaires humaines (hESC), qui exprime de manière stable des sgRNA ciblant le gène L2HGDH à l’aide d’un système de distribution de gènes à médiation lentivirale très efficace.

Délétion de gène médiée par CRISPR-Cas9 dans des cellules souches pluripotentes humaines cultivées dans des conditions sans nourrisseur

La lignée cellulaire THP-1 est largement utilisée comme modèle pour étudier les fonctions des monocytes/macrophages humains dans divers domaines de recherche liés à la biologie. Cet article décrit un protocole pour une ingénierie efficace basée sur CRISPR-Cas9 et l’isolement de clones unicellulaires, permettant la production de données phénotypiques robustes et reproductibles.

Inactivation du gène CRISPR-Cas9 médiée par électroporation dans les cellules THP-1 et isolement de clones unicellulaires

Des détails sont présentés sur la façon dont le cartographie QTL avec une carte génétique basée sur la séquence génomique complète peut être utilisé pour identifier un gène de résistance aux médicaments chez Toxoplasma gondii et comment cela peut être vérifié avec le système CRISPR / Cas9 qui modifie efficacement une cible génomique, dans ce cas le Gène de résistance aux médicaments.

Mapping QTL et édition CRISPR / Cas9 pour identifier un gène de résistance aux médicaments<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Découvrez la génération de myoblastes knock-out par CRISPR/Cas9 pour étudier la fonction des gènes musculaires. Cette méthode rapide et économique facilite l'analyse des myopathies et l'édition génique ciblée.

Développement de lignées cellulaires musculaires Knock-Out à l’aide de l’édition de gènes CRISPR/Cas9 médiée par le lentivirus

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