Imagerie par tomographie par émission de positons du trafic cellulaire : une méthode de radiomarquage cellulaire

Ce protocole décrit une méthode pas à pas pour le radiomarquage des cellules et du zirconium-89-DBN et son suivi non invasif par TEP. Cette technique fournit également une méthode fiable et stable pour le radiomarquage des cellules par une conjugaison covalente du zirconium-89-DBN aux moyens primaires des protéines de surface cellulaire. Les médecins et les scientifiques qui travaillent avec les thérapies cellulaires pour les maladies neurologiques et divers cancers trouveront ce protocole essentiel dans la compréhension de la pharmacocinétique des thérapies cellulaires via l’imagerie TEP non invasive.

Le protocole détaillé fournit des conseils aux nouveaux utilisateurs pour apprendre et adopter cette technique de radiomarquage. Des nœuds supplémentaires inclus aux étapes critiques aideront à résoudre les problèmes d’un nouvel utilisateur. Pour commencer, préparez une colonne avec environ 100 milligrammes de résine hydroxamate et activez-la en lavant la colonne avec huit millilitres d’acétonitrile anhydre pur, suivi d’une chasse d’eau avec cinq à six millilitres d’air.

Passez deux millilitres d’acide chlorhydrique 0,5 normal dans la colonne. Après avoir passé une chasse d’eau supplémentaire de cinq à six millilitres d’air, chargez lentement la solution contenant à la fois du zirconium-89 et de l’yttrium naturel dans la résine d’hydroxamate. Lavez l’yttrium naturel non lié de la résine d’hydroxamate avec 20 millilitres de deux acides chlorhydriques normaux, suivis de 10 millilitres d’eau déminéralisée.

Pour échapper au zirconium sous forme d’hydrogénophosphate de zirconium-89, ajoutez 0,5 millilitre de tampon de phosphate dipotassique de potassium dihydrogénophosphate de potassium à 1,2 molaire à la colonne et laissez-le reposer sur la colonne pendant 30 minutes. Ajoutez 1,5 millilitre supplémentaire de tampon à 1,2 molaire pour éluer le zirconium de la colonne. Ensuite, prenez environ 120 microlitres d’hydrogénophosphate de zirconium-89 formulé dans le tampon et neutralisez la solution avec HEPES-KOH et du carbonate de potassium pour atteindre un pH de 7,528.

Ajoutez quatre microlitres de DFO-Bn-NCS de cinq millimolaires fraîchement préparés à environ 285 microlitres d’hydrogénophosphate de zirconium-89 neutralisé. Et mélangez la solution par pipetage. Après avoir isolé le zirconium de l’yttrium, ajoutez 0,5 millilitre d’acide oxalique à une molaire dans la colonne et laissez-le reposer sur la colonne pendant une minute pour éluer le zirconium sous forme d’oxalate de zirconium-89.

Ajoutez 2,5 millilitres supplémentaires d’une molaire d’acide oxalique à la colonne. Pour convertir l’oxalate de zirconium-89 en chlorure de zirconium-89, lavez la colonne d’échange d’anions avec six millilitres d’acétonitrile, suivi d’un rinçage avec cinq à six millilitres d’air. Ensuite, lavez la colonne avec 10 millilitres de solution saline suivie d’une autre bouffée d’air.

Lentement, chargez la solution contenant de l’oxalate de zirconium-89 sur la colonne d’échange d’anions activée avant de la laver à nouveau à l’air. Ensuite, lavez la colonne avec 50 millilitres d’eau déminéralisée pour éliminer l’ion oxalate non lié. Pour échapper au zirconium sous forme de chlorure de zirconium-89, ajoutez 0,1 millilitre d’un acide chlorhydrique normal dans la colonne et laissez-le reposer sur la colonne pendant une minute.

Éluez le zirconium de la colonne avec 0,4 millilitre supplémentaire d’un acide chlorhydrique normal. Séchez le chlorure de zirconium-89 inéludé dans un flacon en forme de V en le plaçant dans un bloc chauffant à 65 degrés Celsius sous un flux constant d’azote gazeux pendant 10 à 30 minutes, puis reconstituez le chlorure de zirconium-89 séché dans de l’eau. Préparez 500 microlitres de suspension cellulaire avec environ 6 millions de cellules dans 500 microlitres d’HBSS tamponné HEPES dans un tube de micro-centrifugation de 1,5 millilitre et ajoutez environ 100 microlitres de zirconium-89-DBN formulé.

Mélangez le zirconium-89-DBN et la suspension cellulaire en pipetant doucement la solution de haut en bas à l’aide d’une micro-pipette. Incuber les cellules et le mélange de zirconium-89-DBN sur un agitateur à environ 550 tr/min à une température de 25 à 37 degrés Celsius pendant 30 à 45 minutes pour le marquage des cellules. Effectuer une CCM radioactive sur la réaction de radiomarquage cellulaire à l’aide d’un solvant CCM radioactif fraîchement préparé.

Calculez le pourcentage de radioactivité à Rf est égal à 0,01 à 0,02 à l’aide de l’équation affichée à l’écran. Dans un tube de micro-centrifugation séparé de 1,5 millilitre, mélangez environ 100 microlitres de zirconium-89-DBN formulé avec environ 500 microlitres de HBSS tamponné HEPES pour l’utiliser comme contrôle sans cellule pour la correction de l’arrière-plan. Calculez le pourcentage de radioactivité à Rf est égal à 0,01 à 0,02 à l’aide de l’équation affichée à l’écran, puis calculez le radiomarquage effectif des cellules en soustrayant les deux pourcentages de radioactivité calculés.

Après avoir confirmé l’achèvement du radiomarquage, ajouter 600 microlitres de milieu complet réfrigéré adapté à la cellule pour effectuer la trempe de la réaction de radiomarquage. Centrifugez les cellules à 96G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Et jetez le surnageant.

Remettre délicatement en suspension les cellules granulées dans 500 microlitres de milieu réfrigéré en pipetant le milieu de haut en bas à l’aide d’une micro-pipette. Centrifugez les cellules à 96 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant. Ensuite, calculez l’efficacité finale du radiomarquage après tous les lavages à l’aide de l’équation affichée à l’écran.

Pour s’assurer de la qualité des cellules radiomarquées, inspecter visuellement la suspension finale des cellules radiomarquées et, s’il n’y a pas d’amas, effectuer un test de viabilité d’exclusion du bleu de trypan à l’aide d’une solution de bleu de trypan à 0,4 % préparée dans du PBS dans l’heure qui suit le radiomarquage et les étapes de lavage. L’efficacité de chélation du DFO-Bn-NCS pour le zirconium-89 à l’aide d’hydrogénophosphate de zirconium-89 et de chlorure de zirconium-89 est différente selon la mesure de la CCM radioactive. La stabilité de diverses cellules radiomarquées au zirconium-89 sur sept jours est montrée ici.

La rétention de la radioactivité du zirconium-89 par les cellules radiomarquées s’est avérée stable dans toutes les cellules étudiées, avec un efflux négligeable observé pendant sept jours après le marquage. Les efficacités du radiomarquage cellulaire dans différents types de cellules avec du zirconium-89-DBN sont indiquées dans ce tableau. L’efficacité du radiomarquage cellulaire varie de 20 à 50 % comme un rendement non corrigé observé dans la pastille cellulaire radiomarquée après lavage.

L’étape la plus critique de ce protocole est l’ajout de DFO-Bn-NCS au mélange chélateur et l’évaluation de la qualité des cellules radiomarquées. L’application de cette technique permettra de comprendre la pharmacocinétique des thérapies cellulaires. Cela soulèverait également des questions sur la nécessité clinique de modifier le profil de clairance des thérapies cellulaires.