Sélection in vitro d’aptamères pour différencier les virus infectieux des virus non infectieux

Ce protocole décrit comment sélectionner des aptamères d’ADN capables de distinguer les virus infectieux des virus non infectieux afin d’obtenir une molécule de détection capable d’informer l’infectabilité des échantillons cliniques ou environnementaux. Cette technique peut être appliquée pour obtenir des aptamères sélectifs pour de nombreux autres virus, y compris les virus émergents, car elle ne nécessite pas de connaissance préalable des structures ou des séquences du virus. Cette technique permet le développement de capteurs aptamères pour le diagnostic clinique et la surveillance environnementale des virus infectieux afin de détecter si une personne est contagieuse ou si une méthode de désinfection environnementale fonctionne comme prévu.

La sélection peut être un processus difficile, surtout pour ceux qui sont nouveaux dans ce domaine. Il est important d’optimiser les conditions de PCR et de suivre l’avancement de la sélection avec la qPCR. Marcos Gramajo, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Pour commencer, concevez la bibliothèque initiale d’ADN simple brin ou SS et les amorces. Obtenez les oligos d’ADN à partir de sources commerciales avec purification de dessalage standard. Purifier la bibliothèque d’ADN SS et les amorces sur une électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant à 10% suivie d’une précipitation à l’éthanol.

Ensuite, procurez-vous une solution mère de virus infectieux et non infectieux ou préparez-les comme décrit dans le manuscrit textuel. Pour la dénaturation de la bibliothèque d’ADN SS, mélanger 10 microlitres de 100 micromolaires de la bibliothèque d’ADN SS avec 240 microlitres de tampon SELEX. Chauffer le mélange à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes dans un bain sec, puis placer le tube sur de la glace pendant 15 minutes.

Mélanger 250 microlitres de bibliothèque d’ADN SS dans un tampon SELEX avec 50 microlitres de virus infectieux pour une sélection positive. Incuber pendant deux heures à température ambiante. Ajoutez ensuite 400 microlitres d’une séquence millimolaire T20 à un filtre de 0,5 millilitre pour bloquer les sites non spécifiques.

Incuber les filtres pendant 30 minutes. Centrifuger le filtre à 14 000 G pendant 10 minutes pour éliminer la solution T20. Lavez ensuite le filtre trois fois avec le tampon SELEX pour éliminer les séquences T20 en excès.

Ensuite, ajoutez le mélange de virus infectieux de la bibliothèque d’ADN SS au filtre bloqué de 100 kilodaltons et à la centrifugeuse pour laver les séquences non liées. Lavez le filtre trois fois en ajoutant 400 microlitres de tampon SELEX et de centrifugation. Conservez la fraction dans le filtre et jetez l’écoulement.

Pour éluer les séquences liées, changez le tube de collecte du filtre centrifugeuse et ajoutez 300 microlitres de tampon SELEX contenant huit molaires d’urée au filtre. Chauffer le filtre à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis centrifuger pour recueillir le flux continu contenant les séquences éluées. Une fois cela fait, lavez les matériaux avec 10% d’eau de Javel.

Ensuite, ajoutez la solution de virus infectieux à ADN SS recueillie à l’étape précédente dans un filtre bloqué de 10 kilodaltons, centrifugez à 14 000 G pendant 15 minutes et jetez le flux. Laver le filtre trois fois avec 300 microlitres de tampon SELEX pour éliminer l’urée par centrifugation et éliminer l’écoulement. Récupérez la solution dans le filtre en la retournant dans un tube de collecte propre et en centrifugeant pendant cinq minutes.

Mesurer le volume final de la solution récupérée à l’aide d’une pipette et l’étiqueter comme un échantillon de la ronde 1A. Prenez 90% de l’échantillon de la ronde 1A comme modèle lors du premier tour et exécutez la PCR en utilisant des conditions optimisées. Pour récupérer l’ADN SS à l’aide de billes magnétiques modifiées par la streptavidine ou MB, divisez le produit en aliquotes de 50 microlitres et ajoutez-les à des tubes microcentrifugés contenant 50 microlitres MB. Incuber le tube pendant 30 minutes avec une légère agitation à température ambiante.

Placez ensuite le tube sur la grille magnétique pour isoler le MB et retirer le surnageant par pipetage. Lavez le MB deux fois en ajoutant 200 microlitres de tampon de liaison et de lavage au tube. Retirez ensuite le tube de la grille magnétique et tapotez-le avant de remettre en suspension le MB à une solution homogène par pipetage.

Replacez le tube sur la grille magnétique et retirez le surnageant. Après le deuxième lavage, remettre le MB en suspension dans 100 microlitres de tampon SELEX et chauffer la solution à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Placez immédiatement le tube dans le rack magnétique et récupérez le surnageant contenant le pool d’ADN SS.

Répétez cette étape de récupération en ajoutant 50 microlitres de tampon SELEX. Mesurez le volume final de la fraction récupérée et étiquetez-le comme rond 1X. Pour la dénaturation du pool d’ADN SS, prélevez 60% de l’échantillon Round 1X et mélangez-le avec 50 microlitres de tampon SELEX.

Chauffer l’échantillon dans un bain sec, puis placer le tube sur de la glace pendant 15 minutes. Ensuite, mélangez le pool d’ADN SS dénaturé dans un tampon SELEX avec 50 microlitres de chaque virus comme étape de contre-sélection et incuber pendant une heure à température ambiante. Après avoir bloqué les sites non spécifiques dans les filtres à centrifugation, ajouter le mélange dénaturé de pool d’ADN SS incubé avec une solution virale à un filtre bloqué de 100 kilodaltons.

Centrifuger le filtre à 14 000 g pendant 10 minutes et recueillir le débit. Prenez 300 microlitres de fraction et mélangez-les avec 50 microlitres de virus infectieux contenant 100 millions de copies par millilitre. Incuber pendant deux heures à température ambiante.

Préparer un mélange maître qPCR standard et des dilutions de la bibliothèque d’ADN SS purifié comme décrit dans le texte. Exécutez la qPCR pour déterminer le cycle de seuil. Après l’exécution, utilisez une courbe standard pour quantifier la quantité d’ADN SS dans les rondes 1A et 1X.

Ensuite, calculez le rendement d’élution comme la quantité d’ADN liée divisée par la quantité initiale d’ADN et tracez le rendement d’élution par rapport au nombre rond. Enfin, tracez les courbes de fusion pour différents tours. Pour un séquençage à haut débit, sélectionnez un kit approprié disponible dans le commerce.

Préparez plusieurs pools de cycles de sélection représentant un enrichissement élevé, moyen et faible, ainsi que le pool final à l’aide d’une paire d’index différente dans les adaptateurs de chaque pool. Envoyez ensuite la bibliothèque finale préparée à l’installation de séquençage. Pour l’analyse de séquençage, les séquences ont été démultiplexées par l’installation de séquençage.

Supprimez les adaptateurs de séquençage et les amorces de sélection à l’aide du programme de ligne de commande Cutadapt. Utilisez ensuite le programme FASTX-Toolkit pour supprimer les séquences de faible qualité. Fusionnez ensuite les fichiers de séquence dans le sens inverse avec ceux dans le sens avant à l’aide de la fonction FASTX-Toolkit FASTX_reverse_ complément sur les fichiers de sens inverse.

Utilisez ensuite le programme de TAO intégré pour fusionner les fichiers en un seul fichier. Utilisez la boîte à outils d’analyse FASTAptamer pour analyser l’enrichissement des séquences dans différents pools de sélection. Tout d’abord, utilisez les fonctions de cluster FASTAptamer count et FASTAptamer pour regrouper des séquences similaires en clusters.

Ensuite, utilisez la fonction d’enrichissement FASTAptamer pour obtenir des informations sur l’enrichissement des séquences et des clusters. Identifier les séquences aptamères candidates à partir des informations d’enrichissement obtenues par analyse de séquence. Sélectionnez plusieurs séquences d’aptamères et effectuez un dépistage initial à l’aide d’un test de liaison.

Dans cette analyse, la qPCR a été utilisée pour surveiller la progression de SELEX des aptamères infectieux spécifiques du SARS-CoV-2. Le rendement d’élution a d’abord augmenté à chaque cycle de SELEX et s’est stabilisé aux huitième et neuvième tours. En comparant les courbes de fusion, on a observé un décalage du pic à une température de fusion élevée de 77 à 79 degrés Celsius.

De plus, lors des deux derniers tours, un pic à basse température de fusion a été observé. L’abondance relative en lectures par million pour le SARS2 AR10 séquencé obtenu au cours de cycles de sélection consécutifs est montrée. La structure prédite du SARS2 AR10 a montré une structure secondaire structurée contenant une région de boucle souche qui pourrait être impliquée dans la reconnaissance du virus.

Une fois les aptamères obtenus, ils peuvent être incorporés dans des optiques électriques, un autre type de capteurs, pour développer un test de détection de virus portail et rapide qui peut informer l’infectiosité du virus. Nous envisageons que des aptamères spécifiques à différentes variantes ou stéréotypes du virus puissent être obtenus, ce qui permet une surveillance rapide des variantes qui constituent la plus grande menace pour la société.