Name: Imagerie des lymphocytes B CD19+ dans un modèle murin expérimental d’encéphalomyélite auto-immune à l’aide de la tomographie par émission de positons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T12:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Découvrez une technique d'imagerie TEP pour quantifier les lymphocytes B CD19+ dans le système nerveux central et les tissus périphériques à l'aide d'un modèle murin d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale.

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Nous sommes reconnaissants du soutien de l’installation d’imagerie des petits animaux SCi3 à Stanford et du Dr Frezghi Habte pour son assistance technique avec la TEP/TDM. La LC-MS est réalisée par le personnel de base de l’installation centrale de spectrométrie de masse de l’Université de Stanford (SUMS) et nous remercions le personnel d’avoir fourni ce service. Nous remercions Horizon Therapeutics d’avoir très gentiment fourni le hCD19-mAb et Jodi Karnell en particulier pour ses conseils techniques et son soutien. Ces travaux ont été financés par le NIH NINDS (1 R01 NS114220-01A1).

<ol><li>Dobson, R., Giovannoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis - a review.</a> European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).</li>
<li>Karussis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+multiple+sclerosis+and+the+various+related+demyelinating+syndromes%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review.</a> Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+depletion+with+Rituximab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">B-cell depletion with Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis.</a> The New England Journal of Medicine. 358 (7), 676-688 (2008).</li>
<li>Chen, D., Gallagher, S., Monson, N. L., Herbst, R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inebilizumab%2C+a+B+cell-depleting+anti-CD19+antibody+for+the+treatment+of+autoimmune+neurological+diseases%3A+Insights+from+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inebilizumab, a B cell-depleting anti-CD19 antibody for the treatment of autoimmune neurological diseases: Insights from preclinical studies.</a> Journal of Clinical Medicine. 5 (12), 107(2016).</li>
<li>Stevens, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+CD19+PET+tracer+for+detecting+B+cells+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Development of a CD19 PET tracer for detecting B cells in a mouse model of multiple sclerosis.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 275(2020).</li>
<li>Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+imaging+of+neuroinflammation+using+%5B11C%5DDPA-713+in+a+mouse+model+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PET imaging of neuroinflammation using [11C]DPA-713 in a mouse model of ischemic stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57243(2018).</li>
<li>Lyons, J. -A., Ramsbottom, M. J., Cross, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+antigen-specific+antibody+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+induced+by+recombinant+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Critical role of antigen-specific antibody in experimental autoimmune encephalomyelitis induced by recombinant myelin oligodendrocyte glycoprotein.</a> European Journal of Immunology. 32 (7), 1905-1913 (2002).</li>
<li>Haugen, M., Frederiksen, J. L., Degn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell+follicle-like+structures+in+multiple+sclerosis-With+focus+on+the+role+of+B+cell+activating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">cell follicle-like structures in multiple sclerosis-With focus on the role of B cell activating factor.</a> Journal of Neuroimmunology. 273 (1-2), 1-7 (2014).</li>
<li>James, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+B+cells+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis+using+64Cu-Rituximab+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging B cells in a mouse model of multiple sclerosis using 64Cu-Rituximab PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1845-1851 (2017).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-mediated+methodology+for+the+site-specific+radiolabeling+of+antibodies+based+on+catalyst-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).</li>
<li>Lyons, J. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+are+critical+to+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+by+protein+but+not+by+a+short+encephalitogenic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells are critical to induction of experimental allergic encephalomyelitis by protein but not by a short encephalitogenic peptide.</a> European Journal of Immunology. 29 (11), 3432-3439 (1999).</li>
</ol>

L’anticorps CD19 a été fourni par Horizon Therapeutics.

Cet article décrit une méthode simplifiée d’imagerie des lymphocytes B CD19+ humains dans un modèle murin de SEP à l’aide de CD19-PET. En raison de la présentation hétérogène de la SEP et des réponses variables aux traitements, sa prise en charge en clinique peut être difficile et de nouvelles approches pour la sélection et le suivi des thérapies sont grandement nécessaires. L’imagerie TEP pourrait servir d’outil puissant pour surveiller la progression de la maladie et la réponse individuelle au traitement d’appauvrissement des cellules B. En plus de la SEP, l’imagerie TEP-CD19 pourrait être utilisée pour surveiller l’épuisement des lymphocytes B après le traitement de sous-types de lymphomes et de leucémies ou d’autres maladies à médiation par les lymphocytes B. Ce protocole et des données représentatives montrent l’utilité de l’imagerie des lymphocytes B dans les maladies neurologiques.
Pour étudier les lymphocytes B CD19+ humains dans le contexte de la SEP, nous avons choisile modèle 7 de l’EAE MOG1-125 dépendant des lymphocytes B. Semblable à d’autres modèles EAE, ce modèle présente des symptômes de paralysie progressive et d’infiltration de cellules immunitaires dans le SNC. Cependant, le modèle MOG1-125 est unique en ce sens qu’il s’agit d’un modèle piloté par les cellules B : les souris contiennent un nombre variable de cellules B dans l’espace sous-arachnoïdien des méninges, du tronc cérébral, du parenchyme et des ventricules. Ces lymphocytes peuvent être dispersés dans ces régions et/ou former des structures de type follicule, qui sont également observées chez les humains atteints de SEP 8,9. En plus d’utiliser des souris naïves comme témoins, il est possible d’utiliser un kit d’induction complet contenant uniquement un adjuvant de Freund (CFA) (c’est-à-dire une émulsion d’induction identique à celle administrée aux souris EAE sans la protéine MOG). Dans le modèle murin EAE, la barrière hémato-encéphalique (BHE) est dysfonctionnelle et permet à des entités plus grandes, telles que les anticorps, de se croiser. Le radiotraceur CD19-mAb ne se liera et ne restera dans le SNC que si des lymphocytes B sont présents ; le traceur circulera à nouveau dans le pool sanguin si les lymphocytes B ne sont pas présents. Nous l’avons démontré en utilisant le comptage gamma et l’autoradiographie ex vivo des tissus du SNC par perfusion avant de mesurer les niveaux de radioactivité dans les tissus. Nous l’avons également démontré dans des publications antérieures faisant état de l’utilisation de radiotraceurs TEP à base d’ORPC (c’est-à-dire des approches d’imagerie immunoTEP) pour détecter les lymphocytes B dans le SNC 1,2.
Le chélateur DOTA a été utilisé depuis qu’il a été utilisé dans l’imagerie clinique TEP avec des peptides et des anticorps marqués au cuivre-64, et nous visons à traduire le hCD19-mAb pour l’imagerie clinique des patients atteints de SEP. DOTA a une affinité de liaison adéquate avec le cuivre-64 in vivo. La stabilité in vivo est très importante car le 64Cu libre va au foie et peut obscurcir le signal du radiotraceur lié ; Ainsi, il est important de mesurer le signal dans le foie pour calculer le signal relatif par rapport à d’autres organes. Le muscle est généralement pris comme tissu témoin, mais dans le cas de l’EAE, il peut y avoir une inflammation présente dans les muscles. La demi-vie de 64Cu est de 12,7 h, ce qui laisse suffisamment de temps au DOTA-hCD19-mAb pour se lier à sa cible tout en garantissant que le signal peut être mesuré par TEP. Lors de la préparation du conjugué, des réactions d’essai à petite échelle (75-125 μg) doivent être effectuées pour déterminer la quantité de DOTA à ajouter aux anticorps monoclonaux pour produire le rapport DOTA/anticorps monoclonaux souhaité (par exemple, une réaction de 6 à 10 fois plus d’ester DOTA-NHS par mAb molaire peut donner un conjugué de 1 à 2 anticorps monoclonaux à base de DOTA/anticorps monoclonaux). Le temps de réaction et la température (par exemple, 2-4 h ou la nuit à 4 °C ou à température ambiante) influencent également le rapport DOTA/mAb et doivent être optimisés. Un titrage avec du cuivre non radioactif peut être effectué pour calculer le nombre de DOTA par mAb ; cependant, nous recommandons d’effectuer une MALDI-MS et/ou une LC-MS pour obtenir des résultats plus fiables et plus précis.
Le ratio DOTA/mAb calculé est une valeur moyenne pour un échantillon particulier et une certaine variation est attendue. Pour MALDI, plusieurs injections sont effectuées par échantillon pour les anticorps monoclonaux conjugués et non conjugués. Nous calculons ensuite le rapport entre le conjugué et le non conjugué pour déterminer le nombre moyen de DOTA/mAb. Le rapport DOTA/anticorps monoclonaux est important car un trop grand nombre de chélateurs perturbera la liaison aux anticorps et un nombre insuffisant entraînera un radiomarquage incohérent et un signal faible. Le rapport doit être très serré entre les lots de conjugués pour maintenir une intensité du signal et une cinétique de liaison constantes ; Idéalement, le même lot de conjugué devrait être utilisé pour toutes les expériences d’une étude particulière. Une technique prometteuse pour réduire les effets potentiels sur l’immunoréactivité dus à une éventuelle surconjugaison consiste à utiliser la conjugaison spécifique au site10 , dans laquelle la conjugaison chélatrice est sélective sur les glycanes à chaîne lourde de l’anticorps, garantissant ainsi l’ajout de 1 chélateur par anticorps monoclonal.
Les conditions de réaction de radiomarquage doivent être optimisées pour assurer l’efficacité et le rendement de marquage les plus élevés, car les différences d’anticorps, de rapport DOTA/mAb et d’activité molaire de 64Cu, entre autres conditions, auront un impact sur le radiomarquage. L’utilisation du rapport conjugué optimal de 64Cu/mAb peut permettre d’utiliser le radiotraceur sans purification, ce qui réduit le temps nécessaire au radiomarquage et les pertes dues à la colonne d’écoulement gravitaire et à la désintégration radioactive. Une activité molaire cohérente et fiable peut également être obtenue lorsque le même rapport conjugué 64Cu/mAb est utilisé, ce qui est particulièrement important lors de la comparaison des résultats de plusieurs cohortes de souris ou d’études d’imagerie. Les conditions ITLC peuvent également être modifiées pour convenir à chaque utilisateur. Si une purification est nécessaire, une aliquote doit être conservée pour la spectrophotométrie HPLC et/ou UV/Vis afin que l’activité molaire puisse être calculée.
Il est important de noter que l’utilisation d’anticorps radiomarqués pour l’imagerie peut être difficile. Il est essentiel que l’anticorps utilisé pour le radiotraceur soit biologiquement inerte afin de ne pas avoir d’effet physiologique. De plus, étant donné que les anticorps ont une longue résidence dans le sang, il faut attendre suffisamment longtemps pour la circulation, la liaison et la clairance d’un anticorps monoclonal donné pour assurer un signal de fond approprié sans compromettre la qualité de l’image. En règle générale, il suffit d’attendre 20 à 48 h pour obtenir un anticorps monoclonal marqué au Cu 64, mais il faut prendre une image 2, 4, 6, 12, 24ou 48 h après l’injection lors de l’évaluation d’un nouveau traceur TEP anticorps monoclonal afin de déterminer le meilleur moment pour l’imagerie dans un modèle de rongeur donné. Il en va de même pour l’acquisition d’images ARG avec le rapport signal/bruit de fond le plus élevé. Les images représentatives de ce protocole ont été prises 18 à 20 h après l’injection, bien que d’autres points temporels puissent être utilisés en fonction du radio-isotope utilisé. Différents anticorps se liant à différents épitopes de CD19 produiront des résultats variables et doivent être rigoureusement caractérisés.
Lors de l’analyse du signal de la moelle épinière, il est important de positionner les souris sur le dos dans le lit de balayage pour réduire les mouvements causés par la respiration. De plus, le placement en décubitus dorsal peut aider à redresser la colonne vertébrale chez les souris qui ont une courbure accrue de la colonne vertébrale en raison de la progression de la maladie EAE. Un autre aspect important à prendre en compte lorsque l’on cherche à détecter un signal dans la colonne vertébrale et la moelle épinière est d’éviter d’injecter MOG1-125 sur le flanc, car les sites d’injection peuvent lier le traceur en raison de la réponse immunitaire associée dans ces zones. La proximité du site d’injection peut interférer avec l’analyse de la moelle épinière ; Ainsi, les injections dans le thorax sont préférables pour l’application décrite ici.
Les techniques d’analyse d’images utilisées sont spécifiques à l’imagerie du SNC. Un outil d’atlas cérébral intégré au logiciel d’analyse d’images permet d’obtenir des résultats reproductibles et fiables tant que l’enregistrement de la TEP et de la TDM est précis. L’utilisation de l’atlas cérébral 3D semi-automatisé et son ajustement pour qu’il s’adapte au crâne de chaque souris permettent d’obtenir des retours sur investissement cohérents entre les animaux. Étant donné qu’il n’existe actuellement aucune approche automatisée ou semi-automatisée pour analyser le signal dans la moelle épinière, des ROI manuels doivent être établis. Notamment, lors de la quantification des lymphocytes B CD19+ (ou de tout type de cellule présent à la fois dans la moelle osseuse et la moelle épinière), il est essentiel d’éliminer autant que possible le signal provenant de la colonne vertébrale et de la moelle osseuse. La raison en est que les souris naïves sont connues pour contenir plus de lymphocytes B CD19+ dans leur moelle osseuse que les souris EAE, chez lesquelles les lymphocytes B quittent la périphérie pour infiltrer le SNC 5,11. Ce signal de la moelle osseuse peut obscurcir le véritable signal dans la moelle épinière.
Pour délimiter le signal réel de la moelle épinière tout en minimisant la contribution du signal de la colonne vertébrale et de la moelle osseuse, le seuillage Otsu de l’image CT peut être utilisé pour obtenir un retour sur investissement immuable pour la colonne vertébrale. Un ROI séparé de la moelle épinière peut alors être facilement dessiné dans la colonne vertébrale. La même technique peut également être appliquée pour mesurer la moelle osseuse dans le fémur. Il s’agit d’une méthode très utile pour mieux comprendre la liaison du traceur dans la moelle épinière. Cependant, en raison de la résolution spatiale relativement faible de la TEP et des problèmes liés à l’effet de volume partiel lors du balayage de petites régions anatomiques de souris, l’utilisation de techniques de confirmation ex vivo supplémentaires (par exemple, le comptage gamma, ARG) permet de valider la liaison des radiotraceurs dans la moelle épinière sans la présence de sang, de liquide céphalo-rachidien ou de signal de débordement de la colonne vertébrale.
Le signal dans la moelle épinière cervicale/thoracique a tendance à varier chez les souris EAE en fonction de la gravité de la maladie et du nombre de lymphocytes B qui s’infiltrent au cours de la réponse immunitaire adaptative. Cette variation du nombre de lymphocytes B qui s’infiltrent, ainsi que la faible quantité de lymphocytes B dans le SNC par rapport à ceux de la moelle osseuse pelvienne/spinale de souris naïves, peuvent rendre difficile la quantification in vivo du tissu de la moelle épinière chez la souris. Compte tenu de la résolution spatiale de la TEP dans l’imagerie des petits animaux, le signal de la moelle osseuse peut se répercuter sur le signal de la moelle épinière. La biodistribution ex vivo et l’autoradiographie réalisées ici aident à valider le signal TEP des vertèbres par rapport au tissu de la moelle épinière. Les souris sont perfusées avant la dissection pour éliminer tout traceur non lié dans la piscine de sang afin que les résultats de la numération gamma et de l’autoradiographie reflètent le traceur qui est réellement lié dans chaque organe plutôt que le traceur qui se trouve dans la piscine de sang de cet organe.
Les radiotraceurs circulent dans le sang, et avec les traceurs d’anticorps, en particulier, il y a souvent un radiotraceur non lié présent dans le sang pendant des semaines après l’injection initiale. Étant donné que nous imageons le cerveau et la moelle épinière, qui ont de nombreux vaisseaux sanguins, il est important de comprendre quelle partie du signal est vraiment due à la liaison du traceur dans le cerveau/tissu d’intérêt par rapport à celle présente dans le pool sanguin. Il est donc nécessaire de diviser le signal cérébral par signal dans le pool cœur/sang. En milieu clinique, les mêmes techniques d’analyse d’images que le seuillage Otsu des vertèbres et les ROI des tissus de la moelle épinière peuvent être utilisées pour la quantification. Compte tenu des volumes de tissus plus importants chez l’homme que chez la souris, il devrait y avoir beaucoup moins d’impact des effets de volume partiel, ce qui améliorerait la précision et annulerait le besoin de techniques ex vivo pour confirmer les résultats in vivo . L’utilisation de la TEP en clinique permettra aux cliniciens de personnaliser le traitement pour chaque patient en fonction de sa charge individuelle en lymphocytes B.
L’ARG est particulièrement utile pour l’acquisition d’images à haute résolution afin de permettre une délimitation plus précise de l’emplacement spatial de la liaison du traceur dans de petites régions telles que le tronc cérébral et le cervelet. Les mêmes sections et/ou les sections adjacentes peuvent être conservées pour les colorations immunohistochimiques afin de confirmer la présence de lymphocytes B. Nous avons précédemment coloré les tissus du SNC avec CD45R/B220 (Figure supplémentaire S1) pour corréler le nombre de lymphocytes B avec le signal TEP et ARG 5,9. La coloration peut ensuite être comparée spatialement aux résultats de l’ARG pour vérifier que le signal du radiotraceur correspond au motif de coloration. Les lymphocytes B peuvent être présents en grappes ou de manière diffuse dans tout le tronc cérébral ; La sensibilité TEP est suffisamment élevée pour mesurer le signal, ce qui est encourageant pour la traduction clinique. Dans le cas de l’ARG de la moelle épinière, l’ablation de la moelle épinière des vertèbres garantit que le signal mesuré est dû à la liaison du traceur dans le tissu de la moelle épinière plutôt que dans la moelle osseuse et/ou le sang, ce qui peut obscurcir les images TEP en raison d’effets de volume partiel.
À l’instar de l’ARG, le comptage gamma ex vivo permet de quantifier le signal radioactif dans des organes individuels. Pour cette technique particulière, il est important de mesurer le poids humide des tissus et de s’assurer qu’ils sont au fond de leurs tubes respectifs avant de placer les tubes dans le compteur gamma. Les tubes doivent être étiquetés avec le numéro de la souris et le tissu, afin que le bon tube soit utilisé ; Le tube est ensuite pesé sur une balance calibrée et les organes sont insérés au dixième de microgramme (0,0001 mg) près. Certains tissus sont extrêmement petits et la différence de masse du tube avant et après sera de l’ordre de 0,0001 mg. Les tissus doivent être pesés immédiatement après la dissection pour éviter la perte d’humidité, ce qui entraîne une masse plus faible. Après la pesée, les tubes du cerveau et de la moelle épinière doivent être remplis de PBS pour éviter qu’ils ne sèchent avant de congeler ces tissus pour l’ARG.

La SEP est un trouble neurologique à médiation immunitaire ; La présentation unique de chaque patient peut rendre la prise en charge difficile pour les patients et les cliniciens1. La maladie elle-même se caractérise par la présence de lésions démyélinisantes et d’infiltration de cellules immunitaires dans le cerveau et la moelle épinière, entraînant des troubles physiques et cognitifs2. Le paradigme traditionnel selon lequel la SEP est une maladie à médiation par les lymphocytes T a été remis en question pour la première fois dans le cadre d’un essai clinique historique de phase II sur le rituximab3, un traitement ciblant le sous-ensemble CD20+ des lymphocytes B. Depuis, d’autres thérapies à base de lymphocytes B ont été mises au point pour cibler CD194, un biomarqueur pan-lymphocytaire B qui s’exprime sur une gamme plus large de lymphocytes B, ce qui peut être avantageux à la fois sur le plan diagnostique et thérapeutique. De plus, les méthodes existantes d’évaluation de l’efficacité du traitement (c’est-à-dire la surveillance du nombre de poussées et de l’activité de l’imagerie par résonance magnétique [IRM]) ne permettent pas de mesurer précocement la réponse, ce qui expose les patients à un risque important de lésions du SNC en raison d’une sélection et d’une optimisation thérapeutiques sous-optimales. Par conséquent, il est essentiel de mettre en place des stratégies pour surveiller des cellules immunitaires spécifiques, telles que les lymphocytes B CD19+ , en temps réel dans le SNC et à la périphérie des patients atteints de SEP.
L’imagerie TEP est une technique d’imagerie robuste qui permet de visualiser in vivo le corps entier d’une cible d’intérêt donnée, telle que CD19. Alors que les prises de sang, les enregistrements des taux de rechute et la surveillance des lésions par IRM fournissent des instantanés de l’efficacité du traitement, l’imagerie TEP peut permettre aux chercheurs et aux cliniciens de surveiller l’efficacité d’un traitement sur l’ensemble du corps. Cette approche proactive de la surveillance thérapeutique permet aux cliniciens d’évaluer l’efficacité des médicaments en temps réel, ce qui permet des ajustements rapides au besoin. La surveillance de l’emplacement et de la densité des populations cellulaires associées à la maladie permet également une évaluation longitudinale de la gravité à l’aide d’informations anatomiques spécifiques au patient. Il est donc essentiel de mettre en place des méthodes analytiques reproductibles pour exploiter de manière fiable tout le potentiel de l’imagerie TEP dans des contextes cliniques et précliniques.
Cet article décrit les méthodes (Figure 1) permettant d’effectuer l’imagerie TEP, le comptage gamma ex vivo et l’autoradiographie (ARG) des lymphocytes B CD19+ avec un anticorps monoclonal (mAb) anti-CD19 humain marqué au 64 Cu, connu sous le nom de 16C4-TM (64Cu-hCD19-mAb), dans le modèle murin expérimental d’encéphalomyélite auto-immune (EAE) de SEP induite chez des souris transgéniques exprimant le CD19 humain (hCD19) à l’aide de la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline recombinante humaine 1-125 (MOG1-125). Nous fournissons également des méthodes permettant d’évaluer la liaison des radiotraceurs de manière précise et reproductible dans le cerveau et la moelle épinière, deux sites critiques de pathogenèse souvent gravement affectés dans ce modèle et dans d’autres modèles neurodégénératifs. Ces techniques permettent d’étudier de manière non invasive le rôle des lymphocytes B dans la pathologie de la maladie et ont le potentiel d’être traduites cliniquement pour évaluer l’efficacité des thérapies anti-lymphocytes B dans la SEP.

<table><tbody><tr><td>0,5 mL 50 kDa MWCO Filtre centrifuge</td><td>MiliporeSigma</td><td>UFC505008</td><td>filtre centrifuge</td></tr><tr><td>64Cu-CuCl3</td><td>Washington University à St. Louis ; l’Université de Wisonsin, Madison ; ou un autre fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AR-2000 Radio-TLC Imaging Scanner</td><td>Eckert & Ziegler</td><td>AR-2000</td><td></td></tr><tr><td>Cassette d’autoradiographie</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-21700-34</td><td>Aluminium, 8 » x 10 »</td></tr> <tr><td>Film d’autoradiographie</td><td>&nbsp ; GE Life Sciences</td><td>28-9564-78</td><td>Écran de stockage au phosphore BAS-IP SR 2025 E Super Résolution, 20 x 25 cm, écran seul</td></tr><tr><td>Cathéter à aiguille papillon</td><td>SAI Technologies de perfusion</td><td>BLF-24</td><td></td></tr><tr><td>DOTA-NHS-ester</td><td>Macrocycliques</td><td>B-280</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’induction EAE</td><td>Hooke Laboratories</td><td>EK-2160</td><td></td></tr><tr><td>Compteur Geiger</td><td>Ludlum</td><td>14C</td><td></td></tr><tr><td>GNEXT PET/CT Scanner</td><td>Sofie</td><td>GNEXT</td><td></td></tr><tr><td>Hidex Compteur gamma automatique</td><td>Hidex</td><td>AMG</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Column</td><td>Phenomenex</td><td>&nbsp ; 00H-2146-K0</td><td>5 &mu ; m SEC-s3000 400 & Aring ;, 300 x 7,8 mm</td></tr><tr><td>Illustra NAP-5 colonne</td><td>Cytiva</td><td>17085301</td><td>DNA Gravity</td></tr><tr><td>License Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>ARG Logiciel d’analyse</td></tr><tr><td>Tubes collecteurs à faible liaison protéique (1,5 mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI90410</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop Lite</td><td>Micro/nanophotomètre Thermo Scientific 840281400 UV-Vis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes PCR 0,2 ml, pour imageur</td> phosphorescent <td>Eppendorf</td><td>30124707</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon de qualité ADN 9410</td><td>GE Healthcare</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>VivoQuant</td><td>Invicro</td><td>Version 4 Patch 3</td><td>Logiciel d’analyse TEP ; doit acheter l’add-on Brain atlas</td></tr><tr><td>Colonnes de dessalage Zeba Spin, 7K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI89882</td><td>Colonne de dessalage</td></tr></tbody></table>

imagerie des lymphocytes b cd19+ dans un modèle murin expérimental d’encéphalomyélite auto-immune à l’aide de la tomographie par émission de positons

Imaging CD19+ B Cells in an Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mouse Model using Positron Emission Tomography

La sclérose en plaques (SEP) est la maladie démyélinisante du système nerveux central (SNC) la plus courante chez les jeunes adultes, entraînant souvent des déficits neurologiques et une invalidité au fur et à mesure que la maladie progresse. Les lymphocytes B jouent un rôle complexe et essentiel dans la pathologie de la SEP et sont la cible de plusieurs traitements dans le cadre d’essais cliniques. À l’heure actuelle, il n’existe aucun moyen de sélectionner avec précision les patients pour des thérapies anti-lymphocytes B spécifiques ou de quantifier de manière non invasive les effets de ces traitements sur la charge des lymphocytes B dans le SNC et les organes périphériques. L’imagerie par tomographie par émission de positons (TEP) a un énorme potentiel pour fournir des informations quantitatives très spécifiques sur la distribution spatio-temporelle in vivo et la charge des lymphocytes B chez les sujets vivants.
Cet article présente des méthodes de synthèse et d’utilisation d’un traceur TEP spécifique des lymphocytes B CD19+ humains dans un modèle murin bien établi de SEP piloté par les lymphocytes B, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), qui est induite par la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline recombinante humaine 1-125. Des techniques optimisées sont décrites ici pour détecter et quantifier les lymphocytes B CD19+ dans le cerveau et la moelle épinière à l’aide de l’imagerie TEP in vivo . De plus, cet article présente des méthodes simplifiées pour le comptage gamma ex vivo d’organes pertinents pour la maladie, y compris la moelle osseuse, la moelle épinière et la rate, ainsi qu’une autoradiographie à haute résolution de la liaison du traceur CD19 dans les tissus du SNC.

Le mAb hCD19 a été conjugué à la DOTA et radiomarqué avec 64Cu, comme le montre la figure 2. Les EAE et les souris naïves ont subi une TEP/TDM (Figure 3) 18 à 24 h après l’injection de 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. Les images TEP/TDM ont été co-enregistrées à l’aide du logiciel d’analyse TEP, et les tissus du SNC ont été analysés à l’aide de ROI manuels ou d’un atlas cérébral 3D semi-automatisé. La liaison des radiotraceurs dans les ROI (Figure 4) était plus élevée chez les souris EAE que chez les souris naïves. Le comptage gamma ex vivo et l’ARG ont montré une liaison accrue dans la moelle épinière (segments thoraciques lombaires et cervicaux) et le cerveau (ARG uniquement) des souris EAE par rapport aux souris naïves (Figure 5 et Figure 6). Le comptage gamma ex vivo de souris perfusées a également montré une diminution de la liaison des radiotraceurs dans les organes périphériques, y compris la rate, le fémur et la moelle osseuse (Figure 5), ce qui correspond au fait que les lymphocytes B quittent la périphérie et infiltrent le SNC dans ce modèle EAE.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig02.jpg"> Figure 2 : Schéma de conjugaison et de radiomarquage pour la génération de 64 anticorps monoclonaux CD19 spécifiques à l’homme, 16C4-TM mAb (64Cu-DOTA-hCD19-mAb), en plus des données de contrôle dela qualité. (A) Réaction de l’ester DOTA-NHS avec l’anticorps monoclonal hCD19 pour produire le conjugué hCD19-DOTA (pas à l’échelle) et radiomarquage avec 64 Cu-CuCl3 pour produire 64anticorps monoclonaux Cu-DOTA-hCD19. (B) Chromatographe représentatif de l’ITLC. Le pic à 40-60 cm est l’anticorps radiomarqué ; 64Cu-CuCl3 non lié se déplace avec la phase mobile et serait présent de 200 à 240 cm. Il n’y a pas de 64Cu-CuCl3 libre détectable dans ce chromatographe. (C) Les spécifications de contrôle de la qualité de l’anticorps radiomarqué. Abréviations : ester DOTA-NHS = ester d’acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétraacétique mono-N-hydroxysuccinimide ; ITLC/HPLC = chromatographie instantanée sur couche mince/chromatographie liquide à haute performance ; MALDI/LC-MS = désorption/ionisation/chromatographie liquide assistée par laser matriciel-spectrométrie de masse ; CPM = nombre de points par minute. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig03.jpg"> Figure 3 : Photographies montrant comment fixer des souris dans un lit imprimé en 3D à l’intérieur du scanner TEP pour permettre une imagerie de haute qualité de la moelle épinière et du cerveau tout en minimisant les mouvements. (A) Lit de scanner à quatre souris imprimé en 3D (également connu sous le nom d'« hôtel à souris ») équipé d’éléments chauffants et d’une tubulure d’anesthésie. (B) Souris anesthésiées en position couchée sur le dos pour maximiser la rectitude de la colonne vertébrale ; La position du lit de chaque souris est enregistrée. (C) Des souris collées solidement sur leur tête pour minimiser les mouvements dans le cerveau et sur le ventre pour minimiser les mouvements de la respiration, sans affecter la respiration. (D) Lit de souris positionné à l’intérieur du scanner et collé au lit de numérisation. La tubulure d’anesthésie a été connectée du scanner au lit et l’isoflurane a été réglé à 2 %. La respiration de la souris a été surveillée pour s’assurer que le niveau d’isoflurane était approprié avant de fermer la porte du scanner. Abréviation : TEP = tomographie par émission de positons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig04.jpg"> Figure 4 : Image de la moelle épinière et analyse du cerveau et résultats à l’aide d’un logiciel d’analyse TEP. (A) i) ROI (rose et feu) dessiné sur la colonne vertébrale pour séparer les vertèbres lombaires des vertèbres thoraciques et cervicales et préparer l’image pour le seuillage Otsu. ii) Les vertèbres vertébrales (turquoise et rouge) ont été segmentées à l’aide du seuillage Otsu. iii) Les vertèbres ont ensuite été rendues immuables dans le menu ROI 3D, et la moelle épinière divisée en ROI cervical/thoracique (violet) et lombaire (marine). iv) Le ROI vertébral a été supprimé, laissant les ROI de la moelle épinière et l’atlas représentatif du cerveau appliqués. (B) Analyse représentative des résultats de TEP de diverses régions du SNC représentées en % ID/g normalisés au ROI du cœur chez chaque animal. L’acquisition de la TEP a consisté en un balayage statique de 10 minutes par imagerie TEP/TDM. Régions cérébrales quantifiées à l’aide d’une approche semi-automatisée de l’atlas cérébral, illustrée dans le panneau A. iv) Les résultats représentatifs montrent soit une augmentation significative de la liaison des traceurs dans le cerveau et la moelle épinière thoracique, soit une tendance à une augmentation significative. Statistiques réalisées à l’aide du test t de Student (* : p &lt; 0,0332). Abréviations : TEP = tomographie par émission de positons ; ROI = régions d’intérêt ; SNC = système nerveux central ; TDM = tomodensitométrie ; %ID/g = pourcentage de dose injectée par gramme de tissu ; EAE = encéphalomyélite auto-immune expérimentale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig05.jpg"> Figure 5 : Quantification représentative du comptage gamma ex vivo dans divers organes chez l’EAE et la souris naïve, exprimée en %ID/g. Après la TEP, des souris ont été perfusées avec du PBS pour éliminer le radiotraceur présent dans le sang, libre ou lié aux lymphocytes B CD19+ résidents dans le sang, et les organes ont été rapidement disséqués et pesés pour avoir un poids précis de chaque organe. La liaison du traceur est significativement diminuée dans la rate et la moelle osseuse chez les souris EAE par rapport aux souris naïves. Une augmentation de la liaison des radiotraceurs est observée dans les segments de la moelle épinière lombaire et cervicale/thoracique des souris EAE. Le cerveau ne montre pas d’augmentation significative du signal radiotraceur, bien qu’il ait tendance à augmenter de manière significative. Statistiques réalisées à l’aide du test t de Student (* : p &lt; 0,0332 ; **** : p &lt; 0,0001). Abréviations : TEP = tomographie par émission de positons ; %ID/g = pourcentage de dose injectée par gramme de tissu ; EAE = encéphalomyélite auto-immune expérimentale ; PBS = solution saline tamponnée au phosphate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig06.jpg"> Figure 6 : Les images ex vivo de l’ARG montrent la liaison de 64Cu-DOTA-hCD19-mAb dans des coupes cérébrales sagittales et des moelles épinières entières de l’EAE par rapport à des souris naïves. Les films numériques de stockage de phosphore ont été scannés à l’aide d’un imageur au phosphore après avoir été exposés à des échantillons de tissus radioactifs pendant environ 10 demi-vies (127 h ou 5 jours). Les images résultantes révèlent un signal visuellement plus élevé dans le cerveau des souris EAE par rapport aux coupes cérébrales des souris naïves, ce qui est attendu en raison des régions connues pour contenir des cellules B dans ce modèle5. Plus précisément, il y a une augmentation du signal de traceur dans le tronc cérébral, le cervelet et les ventricules des sections cérébrales de souris EAE. Cette augmentation du signal pour les coupes cérébrales de souris EAE reflète ce qui a été trouvé dans la quantification TEP du cerveau entier détaillée ci-dessus. De même, il y a une augmentation de la liaison des radiotraceurs dans les segments cervicaux/thoraciques et lombaires de la moelle épinière par rapport aux moelles épinières naïves, ce qui reflète ce qui a été trouvé en utilisant le comptage gamma ex vivo. Abréviations : TEP = tomographie par émission de positons ; EAE = encéphalomyélite auto-immune expérimentale ; Évent = ventricules ; Cb = cervelet ; BS = tronc cérébral ; TSc = moelle épinière thoracique et cervicale combinée ; LSc = moelle épinière lombaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire S1 : Coloration des tissus du SNC des tissus cérébraux de souris naïves et EAE avec CD45R/B220. Les lymphocytes B sont observés dans le tronc cérébral, les méninges et la substance blanche des souris EAE (n = 7 EAE, n = 5 souris naïves, en moyenne quatre tranches par animal). Ce chiffre est tiré de 5. Barres d’échelle = 5 mm (faible grossissement [1x]) dans les images cérébrales sagittales, 100 μm (fort grossissement [20x]) dans le tronc cérébral, les méninges et la substance blanche cérébelleuse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/Suppl%20Fig%201.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Cet article détaille la méthodologie de radiomarquage d’un anticorps monoclonal anti-CD19 spécifique à l’homme et comment l’utiliser pour quantifier les lymphocytes B dans le système nerveux central et les tissus périphériques d’un modèle murin de sclérose en plaques à l’aide d’approches d’imagerie TEP in vivo, de comptage gamma ex vivo et d’autoradiographie.

Imagerie des lymphocytes B CD19+ dans un modèle murin expérimental d’encéphalomyélite auto-immune à l’aide de la tomographie par émission de positons

Multiple sclerosis (MS) is the most common demyelinating central nervous system (CNS) disease affecting young adults, often resulting in neurological ...

Cette technique utilise l’imagerie TEP pour élucider la distribution et la dynamique in vivo des lymphocytes B dans le système nerveux central. Notre approche est bénéfique pour l’étude des maladies neurologiques, où la moelle épinière affectée rend l’analyse plus difficile. Il y a donc quelques avantages principaux à notre technique.Tout d’abord, nous avons créé un nouvel outil pour suivre un biomarqueur pan de cellules B qui nous permet de capturer une gamme de sous-ensembles de cellules B et de les visualiser in vivo. Deuxièmement, notre méthode d’analyse de la moelle épinière permet une quantification très précise et reproductible des signaux TEP dans cette région. Ce qu’il y a de bien avec notre technique, c’est qu’elle est indépendante de la maladie.Il peut être utilisé de l’imagerie TEP préclinique à clinique dans n’importe quel scénario, où les cellules B et/ou la moelle épinière sont d’intérêt. 18 à 24 heures après le radiomarquage et l’injection de l’anticorps dans la souris, préparez la souris pour le balayage en appliquant un gel oculaire sur les yeux. Assurez-vous que le lit de numérisation pour quatre souris est équipé d’un coussin chauffant avec de l’isoflurane réglé de 1,5 à 2 %Placez la souris en position couchée sur le dos sur le lit de numérisation et tirez doucement sur la queue de la souris pour redresser la colonne vertébrale.Une fois que la souris est en position couchée sur le dos, collez-la solidement avec du ruban adhésif souple sur la tête et le ventre pour minimiser le mouvement de la respiration. Notez la position de numérisation de chaque souris dans un cahier de laboratoire. Après avoir sécurisé le premier groupe, fermez le lit et vérifiez l’emplacement du lit en exécutant une tomodensitométrie.Cliquez sur Champ de vision central de la tomodensitométrie, et une fois que le lit est en position, exécutez le test de tomodensitométrie pour vous assurer que le placement est correct. Répétez l’opération jusqu’à ce que la position du lit soit satisfaisante. Placez un petit ruban adhésif blanc sur le lit du scanner pour marquer l’emplacement correct du lit pour le reste de l’étude.Ouvrez le menu Motion Controller et cliquez sur Champ de vision du centre PET pour déplacer les souris dans l’anneau PET. Une fois que le lit est dans l’anneau TEP, lancez la séquence de balayage en cliquant sur Exécuter, et attendez que le scanner termine automatiquement le TEP, puis passez de l’anneau TEP à la tomodensitométrie pour l’acquisition de la tomographie par émission de positons. Étant donné que les souris expérimentales ont une courbure prononcée de la colonne vertébrale en raison de la progression de la maladie, les scanner sur le dos aide à redresser la colonne vertébrale.Faites une incision sur la face dorsale de l’animal et retirez la peau et la fourrure pour exposer la colonne vertébrale. Coupez le long de trois plans transversaux à travers la colonne vertébrale au niveau du cou, directement sous la cage thoracique et au sommet du bassin pour séparer les régions lombaires des régions cervicales et thoraciques. Retirez délicatement la colonne vertébrale segmentée pour obtenir deux morceaux, lombaire et cervical thoracique.Isolez ensuite la colonne vertébrale lombaire en coupant soigneusement la colonne vertébrale de l’extrémité pelvienne jusqu’à ce que la moelle épinière lombaire soit visible. Pour expulser la moelle épinière lombaire, utilisez une seringue à embout coulissant remplie de PBS et créez un joint entre la seringue et la colonne vertébrale à l’aide du pouce et de l’index. Poussez doucement le PBS à travers la seringue pour expulser la moelle épinière sur un tampon absorbant, et répétez l’opération pour la moelle épinière cervicale thoracique en insérant la seringue du côté cervical.Placez les tissus de la moelle épinière dans un tube de comptage gamma. Enregistrez le poids sec et ajoutez du PBS pour vous assurer que le tissu est au fond du tube pour éviter qu’il ne se dessèche. Placez le tube sur de la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à compter.Pour commencer l’analyse des régions d’intérêt de la moelle épinière, ouvrez l’outil Région d’intérêt 3D dans le menu de navigation. Sous l’en-tête Régions d’intérêt, utilisez le signe plus en bas du menu pour créer six régions d’intérêt, région lombaire d’intérêt, région thoracique cervicale d’intérêt, squelette lombaire, squelette thoracique, moelle épinière lombaire, moelle épinière thoracique. Pour éviter les interférences visuelles du signal PET, cliquez sur F3 pour désactiver le PET.Allez en haut de l’opérateur de l’outil Région d’intérêt 3D et cliquez sur le point plein à droite du symbole du curseur pour ouvrir le mode Peinture 3D et le menu Éroder/Dilater. Sélectionnez Sphère et définissez la taille sur 20 pixels. De même, réglez dilate à plus cinq.Avant d’aller plus loin, allez au bas du menu et assurez-vous que la région lombaire qui vous intéresse est sélectionnée. Sur le scanner, trouvez la vertèbre L6 de la colonne vertébrale. En commençant par une vertèbre au-dessus de L6, dessinez une région lombaire rugueuse d’intérêt sur les cinq vertèbres au-dessus des hanches.Ensuite, passez à la région thoracique cervicale d’intérêt et tracez le reste de la colonne vertébrale jusqu’à la base du crâne. Après avoir dessiné les régions d’intérêt généralisées, allez en haut de l’opérateur et sélectionnez le menu Algorithmes de segmentation. Dans le menu déroulant, sélectionnez Otsu Thresholding, puis sélectionnez la région lombaire d’intérêt pour l’entrée, et assurez-vous que le squelette lombaire est choisi en bas du menu.Dans le menu déroulant à côté de Image, assurez-vous que la tomodensitométrie est sélectionnée, indiquée ici par le chiffre zéro. Cliquez sur Appliquer et répétez la procédure pour la région thoracique cervicale d’intérêt et le squelette thoracique. Après avoir utilisé le seuillage Otsu pour créer les régions squelettiques qui vous intéressent, revenez au menu Navigation et supprimez la région d’intérêt, ou cochez la colonne H pour les régions lombaires et cervicales thoraciques d’intérêt afin de les masquer.Cochez la colonne I pour les deux régions squelettiques d’intérêt, afin qu’elles ne puissent pas être modifiées. Enfin, revenez en haut de l’opérateur de l’outil Région d’intérêt 3D et accédez au menu Peinture 3D pour dessiner les régions de la moelle épinière qui vous intéressent. Sélectionnez à nouveau l’outil Sphère et tracez la moelle épinière dans le squelette pour les lombaires et les thoraciques, en veillant à ce que la bonne région d’intérêt soit sélectionnée en bas du menu.Pour effacer une zone d’intérêt, cliquez sur Commande/Contrôle et dessinez sur la partie à effacer. Vérifiez la région de la moelle épinière d’intérêt à partir des trois plans pour vous assurer qu’aucune région d’intérêt n’est dessinée à l’extérieur de la colonne vertébrale. Si le signal PET a été désactivé, appuyez sur F3 après que les régions de la moelle épinière d’intérêt ont été dessinées pour réactiver le TEP, ou sélectionnez le contrôleur visuel, puis cliquez sur la barre PET.Revenez au menu de navigation. Cliquez sur l’icône Grille pour afficher le tableau. Copiez le tableau dans un tableur et enregistrez le fichier.L’imagerie TEP a révélé une liaison élevée des radiotraceurs dans le cerveau et la moelle épinière thoracique des souris EAE par rapport aux souris naïves. Le comptage gamma ex vivo a montré une liaison accrue dans les segments rachidiens thoraciques lombaires et cervicaux, et dans le cerveau des souris EAE par rapport aux souris naïves. Les images d’autoradiographie ex vivo ont montré une augmentation de la liaison des radiotraceurs dans les sections cérébrales sagittales, en particulier dans le tronc cérébral, le cervelet et les ventricules des souris EAE par rapport aux souris naïves.De même, une augmentation de la liaison des radiotraceurs a été observée dans les segments de la moelle épinière cervicale, thoracique et lombaire des souris EAE par rapport aux moelles épinières naïves. Après l’imagerie TEP et le comptage gamma, nous pouvons étudier la relation entre le signal TEP et la cible d’intérêt grâce à des techniques de biologie moléculaire, telles que la cytométrie en flux et l’immunohistochimie. Notre technique a ouvert la voie aux chercheurs pour poser des questions sur le rôle in vivo des lymphocytes B dans de multiples domaines pathologiques, notamment les accidents vasculaires cérébraux, la sclérose en plaques, d’autres maladies auto-immunes et le cancer.

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