Apprentissage associatif aversif et formation de la mémoire par appariement de deux produits chimiques chez Caenorhabditis elegans

L’apprentissage et la mémoire sont essentiels à la survie et à la reproduction des animaux en naviguant efficacement dans des environnements en constante évolution. C’est aussi l’un des principaux sujets étudiés en neurosciences. Caenorhabditis elegans est un organisme attrayant pour l’étude de l’apprentissage et de la mémoire en raison de la simplicité de son système nerveux.

Ses schémas de câblage chimique et électrique sont également entièrement reconstruits. L’analyse comportementale de Caenorhabditis elegans est extrêmement délicate et est affectée par un certain nombre de paramètres tels que les contraintes chimiques, mécaniques et thermiques. Pour commencer, préparez un milieu de croissance de nématodes de six centimètres, ou plaques NGM, en étalant 0,2 millilitre d’une culture liquide E. coli OP50 dans un milieu Luria-Bertani et en les incubant à température ambiante pendant 24 heures au maximum.

Le premier jour, cueillez et placez cinq animaux gravides bien nourris sur chaque plaque NGM de six centimètres avec un cueilleur de vers en platine et laissez-les pondre environ 50 œufs pendant trois heures à température ambiante pour obtenir une population synchronisée d’animaux adultes. Pour arrêter la ponte, retirez les animaux parents des assiettes avec un cueilleur de vers en platine. Cultivez les animaux à température ambiante pendant environ cinq jours pour atteindre le stade adulte mature, et non le stade de jeune adulte.

Après cinq jours, collectez environ 200 animaux adultes dans un collecteur d’animaux en lavant chaque assiette avec un millilitre de gélatine aqueuse à 0,25%, ce qui empêchera l’adhérence des animaux à la surface des plastiques, tels que les pointes de pipettes. Ensuite, lavez les animaux en déplaçant doucement le collecteur de haut en bas deux fois dans 10 millilitres d’eau distillée double. Répétez le processus deux fois.

Immergez délicatement le collecteur d’animaux contenant environ 200 animaux dans 40 millilitres d’un mélange de 1%1-propanol et d’acide chlorhydrique à pH 4 dans une capsule de cristallisation pendant une seconde. Lavez les animaux dans le collecteur en immergeant très doucement le collecteur une fois dans un puits de sa plaque de culture tissulaire à 6 puits contenant 10 millilitres d’eau distillée double. Ensuite, placez le collecteur sur une pelouse E. coli OP50 sur une plaque NGM de six centimètres pendant 10 minutes pour que les animaux se reposent.

Ensuite, lavez les animaux dans le collecteur avec 10 millilitres d’eau distillée double en déplaçant doucement le collecteur de haut en bas. Répétez ce lavage trois fois et passez au dosage de chimiotaxie. Lavez séquentiellement les animaux dans un collecteur avec un mélange de propanol et de l’eau distillée double, une fois chacun, comme démontré précédemment.

Ensuite, placez le collecteur sur une pelouse E. coli OP50 sur une gélose NGM dans une boîte de Petri de six centimètres pendant 10 minutes pour que les animaux se reposent. Ensuite, lavez les animaux trois fois en déplaçant doucement le collecteur de haut en bas deux fois dans 10 millilitres d’eau distillée double pour éviter la contamination bactérienne et passez au test de chimiotaxie. Préparer des plaques de tarière pour le test de chimiotaxie dans des boîtes de Petri en plastique de six centimètres.

Utilisez ensuite une pointe de pipette sciée ayant une ouverture de plus d’un millimètre pour transférer les animaux du collecteur vers un tube microcentrifuge de deux millilitres contenant un millilitre de gélatine aqueuse à 0,25%. Une fois que les animaux se sont installés au fond du tube par gravité, retirez le surnageant du tube. Remettez les animaux en suspension dans un millilitre de tampon de dosage de chimiotaxie et laissez-les s’installer par gravité au fond du tube pendant environ une minute.

Ensuite, retirez autant de surnageant que possible en pipetant. Ensuite, repérez en diagonale quatre microlitres de 1-propanol aqueux à 5% à deux endroits, puis repérez quatre microlitres d’eau distillée double à deux autres endroits dans la plaque de Petri. Utilisez ensuite une pointe de pipette sciée avec une ouverture d’un millimètre pour repérer six microlitres de la suspension animale dans un tampon de dosage de chimiotaxie contenant environ 60 animaux au centre de trois plaques.

Retirez le liquide autant que possible avec une mèche de tissu de laboratoire sans toucher les animaux. Placez un couvercle sur l’assiette et laissez les animaux se déplacer librement sur l’assiette pendant 10 minutes à température ambiante. Pour arrêter la chimiotaxie, transférer cette assiette dans une boîte de Petri en verre sur glace pendant trois minutes.

Ensuite, placez l’assiette dans un réfrigérateur jusqu’à compter le nombre d’animaux sur l’assiette. Comptez le nombre d’animaux dans quatre sections, à l’exception de ceux du cercle central, sous un stéréomicroscope, et calculez l’indice de chimiotaxie à l’aide de l’équation. À partir des valeurs de l’indice de chimiotaxie, calculez les valeurs de l’indice d’apprentissage comme la différence entre la valeur de l’indice de chimiotaxie des animaux de référence et la valeur de l’indice de chimiotaxie des animaux conditionnés.

Dans le test de chimiotaxie, les animaux conditionnés avec le mélange de 1-propanol et d’acide chlorhydrique, nous ne sommes pas attirés par le 5%1-propanol repéré sur des plaques de gélose, alors que les animaux naïfs et de référence ont été attirés par le 5%1-propanol. Les animaux conditionnés par l’entraînement espacé avec un mélange aqueux de 1-propanol et d’acide chlorhydrique n’étaient plus attirés par le 5%1-propanol comparativement aux animaux traités avec du 1%1-propanol ou de l’acide chlorhydrique, ou de l’eau distillée double seulement. L’étude de l’effet des mutations sur la mémoire a révélé que la formation de la mémoire à court et à long terme dépendait du rôle essentiel des gènes dans le conditionnement classique des animaux.

Après chaque conditionnement, les animaux ne doivent être lavés doucement qu’une seule fois avec de l’eau distillée double. Une fois la mémoire à long terme formée à l’aide de la procédure, l’imagerie calcique et l’électrophysiologie peuvent identifier les circuits neuronaux responsables de la mémoire. Grâce à des analyses génétiques et à un seul neurone, les processus de stockage et de récupération de la mémoire peuvent être abordés aux niveaux moléculaire et unicellulaire.