Name: Principes de base de l’histologie et détection de la mort cellulaire dans les tissus d’abeilles mellifères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Découvrez les méthodes immunohistochimiques pour détecter l'apoptose et la nécrose dans les tissus d'abeilles mellifères. Cette technique permet d'évaluer les effets cellulaires des pesticides sur la santé des pollinisateurs.

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Je remercie l’Agence slovène de recherche, subvention n° P4-133, pour son soutien.

1. Histologie de base pour la recherche sur les abeilles mellifères
<ol><li>Dissection de tissus d’abeilles mellifères REMARQUE : Pour la dissection des abeilles ouvrières, utilisez un microscope à dissection muni d’une source lumineuse DEL. Le grossissement le plus utile est ~20x.<ol><li>Manipulation et dissection<ol><li>Prendre soigneusement une abeille ouvrière avec une pince et la mettre sur de la glace (ou au congélateur à -20 °C) pendant 2 min pour l’immobiliser22. Épinglez l’abeille sur la boîte de Petri en diagonale à travers la partie supérieure arrière du thorax deux fois, de gauche à droite et de droite à gauche.</li>
			<li>Versez une solution saline d’insecte pour couvrir le corps. Placez la boîte de Petri sous le microscope, faites la mise au point et ajustez.</li>
			<li>Préparez les instruments (voir le tableau des matériaux).</li>
		</ol></li>
		<li>Dissection de l’intestin moyen<ol><li>Commencez par l’abdomen en insérant un point des ciseaux sous le tergite A5 (Figure 1) au centre du côté droit du corps de l’abeille. Couper au tergite A2.</li>
			<li>Gardez la lame interne des ciseaux parallèle au côté du corps pour éviter d’endommager les organes internes. Tournez les ciseaux vers la gauche et faites une coupe; Tournez à droite et faites une autre coupe. Ouvrez doucement la partie gauche de l’abdomen et épinglez-la. Répétez de l’autre côté.</li>
			<li>À l’aide d’une pince, tirez doucement l’estomac de l’abeille vers le haut et, avec des ciseaux dans l’autre main, coupez à la toute extrémité de l’œsophage. Retirez l’estomac et l’intestin moyen de l’abdomen et coupez le rectum. Utilisez une pipette avec une solution saline d’insectes et retirez les matières fécales ou les parties du tissu.</li>
		</ol></li>
		<li>Dissection des HPG<ol><li>Immobiliser une abeille ouvrière sur la glace comme décrit à l’étape 1.1.1. Coupez la tête et placez-la sur la plus petite assiette avec les antennes tournées vers le haut. Fixez la tête avec deux broches: une à travers l’œil composé gauche et la seconde à travers l’œil composé droit.</li>
			<li>Faites une incision sur le premier œil composé sur la face interne des broches, continuez jusqu’au labrum, puis faites une autre coupe de l’autre côté à travers le deuxième œil composé (Figure 2).</li>
			<li>Coupez les antennes. Soulevez le masque et coupez là où il est encore attaché. Prenez les forceps et retirez soigneusement les glandes ainsi que le cerveau et une partie des yeux composés.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Fixation, déshydratation et encastrement de paraffine REMARQUE : Portez des gants de protection.<ol><li>Placez le mouchoir dans des flacons de pénicilline, remplis aux 3/4 avec 10% de formol. Conserver au réfrigérateur à 4 °C.</li>
		<li>Après 24 h, déshydrater le tissu dans une série d’alcools: 70%, 80%, 90%, 100%, pendant 1 h chacun, 100% 2-propanol pendant 1 h, 100% 2-propanol pendant 12 h, et enfin 100% 2-propanol pendant 1 h.</li>
		<li>Placer le tissu dans des histocassettes; marquez-les et placez-les dans les chambres vitrées avec du 2-propanol et de la paraffine (1:1) dans un incubateur à 60 °C pendant 24 h.</li>
		<li>Déplacer les histocassettes dans une autre chambre avec de la paraffine (I.) pendant encore 24 h. Répétez la procédure avec de la paraffine fraîche deux fois de plus (II. et III.), les deux pendant 24 h.</li>
		<li>Enfin, préparez la station de montage et commencez à incorporer le tissu dans de la cire.<ol><li>Ouvrez chaque histocassette et retirez le couvercle. Remplissez le moule avec de la cire et placez soigneusement le mouchoir avec une pince chaude au milieu du moule.</li>
			<li>Placez l’histocassette sur le moule et recouvrez-la légèrement de cire. Placez immédiatement le moule sur la surface froide de la station de montage pendant quelques secondes, puis placez-le sur la plaque froide pendant quelques minutes jusqu’à ce que la cire durcisse et se sépare du moule et de l’histocassette.</li>
		</ol></li>
		<li>Conservez les échantillons finis dans une boîte, à l’abri de la poussière et de la chaleur.</li>
		<li>Couper des sections minces de 4 μm sur un microtome: d’abord, deux sections attachées l’une à l’autre, puis une séparément. Transférer les sections à l’aide d’une pince et les laisser flotter sur de l’eau distillée (42 °C), puis les recueillir sur des lames propres en plaçant deux sections ensemble sur le côté gauche du verre de l’objectif et la troisième sur le côté droit, en restant nettement séparées. Laissez les lames marquées pendant la nuit sur l’appareil de chauffage et enfin rangez-les dans une boîte dédiée aux échantillons d’histologie.</li>
	</ol></li>
	<li>Déparaffinage et réhydratation REMARQUE : Portez des gants de protection.<ol><li>Préparer neuf pots Coplin et placer les sections dans une série d’agents de compensation (I., II., III.) pendant 5 minutes chacun.</li>
		<li>Mettre dans le 2-propanol, l’éthanol 96% (I., II.), l’alcool 90% et 80%, et l’eau distillée pendant 3 min chacun.</li>
	</ol></li>
	<li>Teinture à l’hématoxyline et à l’éosine REMARQUE : Portez des gants de protection.<ol><li>Préparez six pots Colin.</li>
		<li>Pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H &amp; E), mettez les sections déparaffinées et réhydratées dans de l’hématoxyline pendant 5 minutes, puis placez-les soigneusement sous l’eau courante du robinet pendant 2 minutes. Ensuite, mettez-les dans de l’eau distillée pendant 1 min et de l’éosine pendant 4 min (pour l’éosine, le pot Coplin n’est pas nécessaire).</li>
		<li>Placer les lames dans de l’éthanol à 96% pendant 1 min, puis 2-propanol pendant 2 min, et enfin dans l’agent de nettoyage pendant 2 min.</li>
		<li>Ajoutez un support de montage et un verre de couverture et laissez-les sécher. Observez au microscope optique.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64141/64141fig01.jpg"> Figure 1 : Vue dorsale du corps de l’abeille. A1-A7 tergites. Les instructions détaillées sur la dissection des abeilles mellifères se trouvent dans Carreck et coll.24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64141/64141fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64141/64141fig02v2.jpg"> Figure 2 : Vue dorsale des HPG, parties des yeux composés attachées au cerveau (non visible). Une jeune abeille ouvrière âgée de 5 à 6 jours a des HPG dodus et blanc crème. Les acini sont situés sur le cerveau et remplissent la zone de la tête avec des branches atteignant l’arrière du cerveau. Chez les abeilles butineuses, ces glandes sont considérablement rétrécies et ne laissent que de minces restes filiformes. Pour cette raison, il est préférable d’enlever les glandes avec le cerveau pour faciliter les procédures ultérieures afin d’éviter de perdre le tissu. Barre d’échelle = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64141/64141fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
2. Détection de la mort cellulaire dans les coupes tissulaires
<ol><li>Kit de détection de l’apoptose (Dosage A) REMARQUE : Suivez le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).<ol><li>Préparez les pots de Coplin.</li>
		<li>Après déparaffinage et réhydratation (voir étape 1.3), immerger les lames dans une solution de NaCl à 0,85 %, puis dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (5 min).</li>
		<li>Mettre les lames dans 4% de paraformaldéhyde 2 x 15 min.</li>
		<li>Placez les lames à plat dans le récipient et ajoutez 100 μL d’une solution de protéinase K (20 μg/mL), puis laissez-les pendant 10 à 30 minutes.</li>
		<li>Placez les diapositives dans PBS (5 min).</li>
		<li>Placer les lames dans du paraformaldéhyde à 4% dans du PBS (5 min).</li>
		<li>Immergez les diapositives dans PBS (2 x 5 min).</li>
		<li>Placez les lames à plat dans le récipient, ajoutez 100 μL de tampon d’équilibrage et laissez-les pendant 5-10 min.</li>
		<li>Ajouter 100 μL de mélange réactionnel TdT. Mettez des serviettes en papier à l’intérieur du récipient, autour des lames, humidifiez les serviettes avec de l’eau, puis recouvrez-les d’une pellicule de plastique. Incuber les toboggans pendant 60 min à 37 °C.</li>
		<li>Replacez les lames dans la grille de coloration et plongez dans 2x citrate de sodium salin (SSC) pendant 15 min.</li>
		<li>Immergez les diapositives 3 x 5 min dans du PBS, puis dans du peroxyde d’hydrogène à 0,3 % pendant 3 à 5 min, puis à nouveau dans du PBS, 3 x 5 min.</li>
		<li>Encore une fois, placez les lames à plat dans le récipient, ajoutez 100 μL de streptavidine HRP (peroxydase de raifort) et laissez reposer 30 minutes (couvrir d’une pellicule de plastique).</li>
		<li>Immergez les diapositives 3 x 5 min dans PBS.</li>
		<li>Placer les lames à plat dans le récipient et ajouter 100 μL de solution de 3,3'-diaminobenzidine (DAB). Recherchez un fond brun clair.</li>
		<li>Remettez les lames sur la grille et lavez-les plusieurs fois à l’eau (double distillation).</li>
		<li>Montez les glissières sous des lamelles de verre dans un support de montage et laissez sécher à plat.</li>
		<li>Observez au microscope optique.</li>
	</ol></li>
	<li>Kit de détection de l’apoptose (Dosage B) REMARQUE : Suivez le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).<ol><li>Préparez les pots Colin.</li>
		<li>Préparer la protéinase K (20 μg/mL dilués dans du PBS).</li>
		<li>Après avoir déciré et réhydraté les sections (étape 1.3), placez les lames dans PBS pendant 5 min.</li>
		<li>Placer les lames à plat dans le récipient et ajouter la protéinase K (20 μg/mL, 60 μL par échantillon de 5 cm²).</li>
		<li>Laver les lames 2 x 2 min à l’eau distillée.</li>
		<li>Tremper dans la peroxydase endogène (dans 3% d’hydrogène peroxydase) à température ambiante.</li>
		<li>Rincer les lames 2 x 5 min avec du PBS ou de l’eau.</li>
		<li>Placer les lames à plat dans le récipient et appliquer un tampon d’équilibrage (75 μL/5 cm2) pendant 10 s à température ambiante.</li>
		<li>Essuyez soigneusement autour du tissu.</li>
		<li>Ajouter l’enzyme TdT (désoxynucléotidyl transférase terminale) à chaque section et incuber dans une chambre humidifiée pendant 1 h à 37 °C. Mettez des serviettes en papier à l’intérieur du plateau, autour des diapositives, humidifiez les serviettes avec de l’eau et recouvrez-les d’une pellicule de plastique.</li>
		<li>Après l’incubation, mettre les échantillons dans la grille et les laisser dans un tampon d’arrêt/lavage (10 min).</li>
		<li>Réchauffer le conjugué anti-digoxigénine à température ambiante.</li>
		<li>Lavez les lames dans PBS (3 x 1 min).</li>
		<li>Essuyez soigneusement autour du mouchoir.</li>
		<li>Ajouter deux gouttes de conjugué anti-digoxigénine-peroxydase (65 μL/5 cm²) aux sections et incuber pendant 30 min dans un récipient humidifié.</li>
		<li>Après le lavage dans PBS 4 x 2 min, préparer le substrat de peroxydase de résistance au travail, puis tapoter doucement l’excès de liquide et aspirer autour de la section.</li>
		<li>Couvrir les sections avec un substrat de peroxydase (75 μL/5 cm²) et colorer pendant 5 min. Placez une lame sous le microscope et déterminez le temps de coloration optimal.</li>
		<li>Laver les lames dans une grille de coloration dans de l’eau distillée (3 x 1 min).</li>
		<li>Incuber les lames dans de l’eau distillée pendant 5 min.</li>
		<li>Contre-coloration à l’aide d’hématoxyline pendant 2 min.</li>
		<li>Placez la toboggan sous l’eau courante du robinet pendant 3 min.</li>
		<li>Lavez la lame à l’eau distillée.</li>
		<li>Montez les glissières sous des lamelles de verre dans un support de montage et laissez sécher à plat.</li>
		<li>Observez au microscope optique.</li>
	</ol></li>
	<li>Kit de détection de l’apoptose (Dosage C) REMARQUE : Suivez le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).<ol><li>Préparez les pots de Coplin.</li>
		<li>Décirer et réhydrater les sections de tissu (voir étape 1.3).</li>
		<li>Incuber le tissu avec la protéinase K (15-30 min à 37 °C).</li>
		<li>Replacez les lames sur la grille et rincez 2x dans PBS.</li>
		<li>Couvrir de 50 μL de « mélange réactionnel TUNEL ». Placez les serviettes en papier humides à l’intérieur du récipient, recouvrez-les d’une pellicule plastique et laissez-les pendant 60 min à 37 °C.</li>
		<li>Rincer 3x avec du PBS.</li>
		<li>Placez les lames dans le récipient et séchez la zone autour de l’échantillon de tissu.</li>
		<li>Ajouter 50 μL de Converter-AP à l’échantillon et incuber dans un récipient humidifié pendant 30 min à 37 °C.</li>
		<li>Rincer 3x dans PBS.</li>
		<li>Ajouter 50-100 μL de solution de substrat et laisser reposer 10 min dans l’obscurité. REMARQUE: Observez la coloration au microscope optique.</li>
		<li>Rincez les lames 3x avec du PBS.</li>
		<li>Contre-colorer en transférant les sections dans l’hématoxyline pendant 2 min, puis rincer soigneusement à l’eau courante du robinet pendant 5 min.</li>
		<li>Montez les glissières sous des lamelles de verre dans un support de montage aqueux et laissez-les à plat pour sécher.</li>
		<li>Observez au microscope optique. Évaluer les cellules affectées (positives) en comptant 70 à 100 cellules dans chaque échantillon de l’intestin moyen ou HPG au microscope optique.</li>
	</ol></li>
</ol>

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L’auteur n’a pas de conflits d’intérêts.

Dans les organismes vivants, la mort cellulaire est définie comme l’apoptose ou la nécrose25 et peut être accompagnée d’autophagie26. La différence entre les cellules apoptotiques et nécrotiques est que l’apoptose est une forme de mort cellulaire programmée et apparaît dans les cellules normales, alors que la nécrose se produit en raison de conditions mortelles (p. ex. accident, maladie)27,28. L’apoptose peut être d...

Les abeilles mellifères (Apis mellifera L.) sont, entre autres pollinisateurs sauvages, les pollinisateurs les plus importants des plantes agricoles. Pendant des milliers d’années, l’environnement changeant a incité les abeilles à adapter leur morphologie, leur physiologie, leur comportement et leur tolérance à plusieurs agents pathogènes et parasites. Par conséquent, les abeilles mellifères ont développé une gamme très diversifiée d’espèces et de sous-espèces dans le mondeentier 1. Ces résultats sont cohérents avec les résultats précédents, qu’il existe une variation génétique dans la structure du tube digestif de l’abeille, mais suggèrent également que les altérations de l’intestin moyen sont dues à des facteurs environnementaux 2,3.
Le tube digestif de l’abeille a trois parties principales: l’intestin antérieur, l’intestin moyen (ventriculus) et l’intestin postérieur4. Le ventriculus est un organe essentiel pour la digestion du pollen et du nectar/miel ; Dans l’intestin postérieur, le contrôle osmotique a lieu par absorption d’eau et d’ions2. Les glandes hypopharyngées (HPG) des ouvrières apicoles sont situées dans la tête et synthétisent et sécrètent des composants de gelée royale pour nourrir la couvée, la reine et les membres de la colonie. Leur taille change avec l’âge et les tâches et dépend d’une bonne nutrition (pollen de qualité). Les infirmières et infirmiers âgés de 6 à 18 jours effectuent l’élevage des couvées, et la taille des HPG augmentede 5,6. Chez les abeilles butineuses, les HPG dégénèrent et ne sécrètent que les enzymes importantes pour convertir les sucres complexes en sucres simples (α-glucosidases, leucine arylamidase, invertase) dans le miel7.
Les abeilles mellifères sont exposées à plusieurs facteurs de stress biotiques et abiotiques8, et le tube digestif peut être affecté par plusieurs stimulants négatifs. La première barrière qui protège l’organisme contre les agents pathogènes est la membrane péritrophique de l’intestin moyen, constituée de muqueuse intestinale pour protéger contre les agents pathogènes4. Le développement et la fonction des HPG dépendent de l’alimentation, de l’âge et de l’état de la colonie9, et sont affectés par les insecticides, les acaricides 10 et les agents pathogènes11,12,13. Les résidus d’acaricides dans la ruche dus au traitement de lutte contre le varroa et aux pesticides de l’environnement affectent les abeilles butineuses et les abeilles nourrices14,15. La plus grande menace pour les colonies d’abeilles mellifères est l’acarien Varroa destructor, à la fois en tant que vecteur de virus contribuant aux pertes de colonies16 et en tant que consommateur du corps adipeux de l’hôte (un organe vital important chez les abeilles mellifères), ce qui affecte par conséquent le corps de l’individu et les fonctions de la colonie17.
Cependant, les habitats agricoles intensifs peuvent fournir un approvisionnement alimentaire à court terme pour les abeilles mellifères. Par conséquent, les programmes agroenvironnementaux devraient améliorer la disponibilité des fleurs mellifères dans les paysages agricoles18. Pour évaluer la morphologie de différentes sous-espèces 6,19,20,21 ou les effets sublétaux de ces facteurs au niveau des cellules ou des tissus, en particulier l’intestin moyen et les HPG, les méthodes histologiques et immunohistochimiques sont pratiques et suffisamment précises pour être utilisées dans la recherche histologique sur les abeilles.

<table><tbody><tr><td>2-Propanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApopTag Peroxydase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7100</td><td>Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE ; Contrôles positifs inclus dans le S7101</td></tr><tr><td>Couvre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>l’impasse Système colorimétrique TUNEL</td><td>Promega</td><td>G7360</td><td>Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360</td></tr><tr><td>Microscope de dissection. (pour la dissection des abeilles)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau distillée</td> Cassette d’enrobage <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EnVision System Kit phosphatase alcaline</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alcoolique Éthanol</td><td></td><td></td><td>95 % (ou moins pur), 90 %, 80 %</td></tr>Milieu <tr><td></td> de montage Faramount, aqueux <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dako</td><td></td><td>support de montage</td></tr><tr><td>Table d’aplatissement</td><td>Leica</td><td>HI1220</td><td></td></tr><tr><td>Forceps&nbsp ; (pour la dissection des abeilles)</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>11294-00</td><td>Standard #4</td></tr><tr><td>Formol 10 %</td><td></td><td></td><td>Formaldéhyde</td></tr><tr><td>Hématoxyline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoChoice Agent nettoyant</td><td>Sigma-Aldrich Agent nettoyant Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrogène peroxydase 3 %</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Épingles à insectes&nbsp; (pour la dissection des abeilles)</td><td>Entosphinx</td><td>44594</td><td>Épingles à insectes acier inoxydable &ndash ; blanc, taille 2</td></tr><tr><td>ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase)</td><td>Roche</td><td>11684809910</td><td>Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lab horloge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Lames La</td><td></td><td></td><td>boîte contenant les lames doit être conservée dans un emballage plastique pour éviter la poussière</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Station modulaire d’enrobage de tissus</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde 4 %</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Paraplast</td><td>Pipettes</td> Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur</td><td>1,5 mL ; 3 mL</td>Boîte de Pétri PBS&nbsp ;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> (pour la dissection des abeilles)</td><td></td><td></td><td>Rempli de silicium à condensation&nbsp ; (Xantoprène L bleu et activateur universel liquide plus)</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Merck</td><td>21627</td><td></td></tr><tr><td>Solution de Ringers&nbsp ; (pour la dissection des abeilles)</td><td></td><td></td><td>7,5 g de NaCL, 2,38 g de Na2HPO4, 2,72 g de KH2PO4, 1 L d’eau</td></tr><tr><td>distilléeCiseaux&nbsp ; (pour la dissection des abeilles)</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>1406-09, 14061-09</td><td>Droit et courbé, 9 cm</td></tr><tr><td>Liquide universel plus activateur&nbsp ; (pour la dissection des abeilles)</td><td>Kulzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horloger' s pince (pour la dissection des abeilles)</td><td>Outils de science fine</td><td>91100-12</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinceau</td><td></td><td></td> aquarelle <td>2x</td></tr><tr><td>Xantoprène L bleu&nbsp ; (pour la dissection des abeilles)</td><td>Kulzer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

principes de base de l’histologie et détection de la mort cellulaire dans les tissus d’abeilles mellifères

Histology Basics and Cell Death Detection in Honeybee Tissue

Les abeilles mellifères (Apis mellifera L.) à l’intérieur de la ruche (ouvrières nourricières et autres abeilles de la ruche) et à l’extérieur de la ruche (butineuses) sont exposées aux changements climatiques et météorologiques, à divers pesticides, agents pathogènes et à la malnutrition, pénétrant principalement par la bouche et affectant principalement le tube digestif des abeilles adultes. Pour comprendre et prévenir les effets de ces facteurs de stress externes et internes sur les abeilles, une méthode de recherche utile est la méthode immunohistochimique. Un protocole de base est décrit pour préparer l’intestin moyen (ventriculus) et les glandes hypopharyngées (HPG) des abeilles adultes pour l’analyse histologique. Une méthodologie détaillée est décrite pour évaluer le niveau de dommages cellulaires et distinguer la nécrose de la mort cellulaire programmée (apoptose) en tant que processus naturel de régénération tissulaire. Les résultats du traitement des abeilles adultes avec de l’acide oxalique et des pesticides (insecticide et acaricide) et la détermination de la mort cellulaire dans le ventriculus et les HPG sont présentés. Les avantages et les inconvénients de la méthodologie sont également discutés.

Détection de la mort cellulaire dans l’intestin moyen Les abeilles ouvrières (Apis mellifera carnica) nouvellement issues du rucher expérimental de l’Institut agricole de Slovénie à Ljubljana ont été traitées individuellement avec de l’acide oxalique (OA) à 3 %23. L’arthrose est fréquemment utilisée en apiculture pour lutter contre Varroa destructor . Après le traitement, les abeilles ouvrières (trois de chaque groupe) ont été immobilisées sur de la glace. L’i...

Les méthodes immunohistochimiques sont utiles dans la recherche sur les abeilles mellifères pour détecter et évaluer le niveau d’apoptose et de nécrose dans l’intestin moyen et les glandes hypopharyngées des abeilles adultes.

Principes de base de l’histologie et détection de la mort cellulaire dans les tissus d’abeilles mellifères

Honeybees (Apis mellifera L.) inside the hive (nurse workers and other hive bees) and outside the hive (foragers) are exposed to climate and weather ...

Ce protocole est utile dans de nombreuses études biologiques et toxicologiques sur les abeilles mellifères traitées avec des pesticides. Il aide à détecter les réponses cellulaires des tissus d’abeilles mellifères des acaricides qui sont utilisés dans les colonies d’abeilles pour le traitement contre les acariens Varroa. C’est un outil puissant pour la détection de sous-petits effets sur les tissus en combinaison avec le comportement des abeilles ou d’autres insectes utiles.Pour commencer, prenez soigneusement une abeille ouvrière avec une pince et mettez-la sur de la glace ou un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant deux minutes pour l’immobiliser. Épinglez l’abeille sur la boîte de Petri en diagonale à travers la partie postérieure supérieure du thorax deux fois de gauche à droite et de droite à gauche. Pauvre insecte salin pour couvrir le corps.Placez la boîte de Petri sous le stéréomicroscope, faites la mise au point et ajustez. Pour disséquer l’intestin moyen, commencez par l’abdomen en insérant un point des ciseaux sous le tergite A5 au centre du côté droit du corps de l’abeille. Couper au tergite A2. Gardez la lame interne des ciseaux parallèle au côté du corps pour éviter d’endommager les organes internes.Tournez les ciseaux vers la gauche et coupez. Ouvrez doucement la partie gauche de l’abdomen et épinglez-la. À l’aide d’une pince, tirez doucement l’estomac de l’abeille vers le haut et, avec des ciseaux dans l’autre main, coupez à la toute extrémité de l’œsophage.Retirez l’estomac et l’intestin moyen de l’abdomen et coupez le rectum. Utilisez une pipette avec une solution saline d’insectes et retirez les matières fécales ou les parties du tissu. Pour la dissection des glandes hypopharyngées, immobiliser une abeille ouvrière sur la glace comme décrit précédemment.Coupez la tête et placez-la sur une plaque plus petite avec l’antenne tournée vers le haut. Fixez la tête avec deux épingles, l’une à travers l’œil composé gauche et la seconde à travers l’œil composé droit. Faites une coupe à travers le premier œil composé sur le côté interne des épingles, continuez jusqu’au labrum, puis faites une autre coupe de l’autre côté à travers le deuxième œil composé.Coupez les antennes. Soulevez le masque et coupez là où il est encore attaché. Prenez les forceps et retirez soigneusement les glandes ainsi que le cerveau et une partie des yeux composés.Pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, mettez les sections déparaffinées et réhydratées dans de l’hématoxyline pendant cinq minutes. Ensuite, placez-les soigneusement sous l’eau courante du robinet pendant deux minutes. Ensuite, mettez-les dans de l’eau distillée pendant une minute et de l’éosine pendant quatre minutes.Placez les lames d’éthanol à 96% pendant une minute, puis le 2-propanol pendant deux minutes, et enfin dans l’agent de compensation pendant deux minutes. Ajoutez un support de montage et un verre de couverture et laissez-les sécher. Observez au microscope optique.Préparez les pots Colin. Préparer la protéinase-K. Après avoir déciré et réhydraté les sections, placez les lames dans PBS pendant cinq minutes.Placez les lames à plat dans le récipient et ajoutez la protéinase-K. Lavez les lames à l’eau distillée. Tremper dans la peroxydase endogène à température ambiante.Rincez les lames avec du PBS ou de l’eau. Placez les lames à plat dans le récipient et appliquez un tampon d’équilibrage pendant 10 secondes à température ambiante. Après avoir essuyé le tissu, ajoutez l’enzyme désoxynucléotidyltransférase terminale à chaque section et incuber dans une chambre humidifiée pendant une heure à 37 degrés Celsius.Avant l’incubation, placez des serviettes en papier humidifiées à l’intérieur du plateau autour des lames et recouvrez-les d’une pellicule de plastique. Après l’incubation, placez les échantillons sur la grille et laissez-les dans un tampon de lavage d’arrêt. Après avoir lavé les lames dans du PBS et essuyé les tissus, ajouter deux gouttes de conjugué anti-digoxigénine peroxydase chaud aux sections et incuber pendant 30 minutes dans un récipient humidifié.Après le lavage au PBS, préparer le substrat de peroxydase de résistance au travail, couvrir les sections avec le substrat de peroxydase et colorer pendant cinq minutes. Placez la lame sous le microscope et déterminez le temps de coloration optimal. Après avoir lavé les lames dans une grille de coloration et de l’eau distillée, incuber les lames dans de l’eau distillée pendant cinq minutes.Contre-coloration à l’aide d’hématoxyline pendant deux minutes. Lavez les lames en les plaçant sous l’eau courante du robinet pendant trois minutes, puis dans de l’eau distillée. Montez les glissières sous les lames de couvercle en verre et le support de montage et laissez sécher à plat.Observez au microscope optique. Le pourcentage de cellules affectées a été calculé à l’aide d’un microscope optique. Les résultats ont indiqué que le traitement à l’acide oxalique affectait de manière significative les cellules de l’intestin moyen.L’immunomarquage a montré des produits de réaction rouges ou bruns positifs dans les noyaux apoptotiques des glandes hypopharyngées. Le produit de réaction positive après un traitement par imidaclopride ou coumaphos a été déterminé dans la majorité des cellules glandulaires. Lors du soulèvement du masque de la tête d’abeille, veillez à ne pas endommager ou arracher les parties des glandes hypopharyngées.Cette technique détecte les changements subcliniques chez les abeilles et convient également à la détection d’autres effets environnementaux sur les abeilles et certains autres organismes vivants.

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JoVE Journal

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Biologie

Les abeilles peuvent être conditionnés dans un paradigme d'apprentissage olfactif appétitif (PER-conditionné). L'utilisation des odeurs comme stimuli, nous avons établi une méthode dans laquelle le comportement est enregistré pendant l'imagerie calcique simultanée est utilisée pour mesurer l'activité d'odeur évoquée dans les neurones du corps de...

In vivo Ca 2 + - Imagerie des neurones du corps champignons Pendant l&#39;apprentissage olfactif dans le Honey Bee

Nous présentons un protocole simple de visualiser les régions de la mort cellulaire programmée (PCD) dans des embryons de souris et la différenciation de cellules souches embryonnaires cultures (ES) en utilisant un colorant hautement soluble appelée Lysotracker.

L&#39;utilisation de Lysotracker pour détecter la mort cellulaire programmée dans les embryons et la différenciation des cellules souches embryonnaires

Chez les travailleurs d'abeilles, le vieillissement dépend de comportements sociaux plutôt que sur l'âge chronologique. Ici, nous montrons comment les travailleurs-types avec des modèles très différents de vieillissement peuvent être obtenues et analysées pour la sénescence cellulaire.

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Microparticules membranaires hangar cellulaires (PM) sont des vésicules biologiques actifs qui peuvent être isolés et leurs effets physiopathologiques étudiés dans différents modèles. Nous décrivons ici un procédé pour générer PM dérivées de lymphocytes T (PMT) et pour mettre en évidence leur effet pro-apoptotique sur les cellules epitheliales des voies respiratoires.

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Le tissu adipeux (AT) peut influencer l’homéostasie de l’ensemble du corps, il est donc important de comprendre les mécanismes moléculaires de la différenciation et de la fonction des adipocytes. Nous fournissons un protocole pour acquérir de nouvelles connaissances sur ces processus en analysant l’homéostasie des adipocytes, la différenciation et l’exposition à l’hypoxie comme modèle de l’apoptose adipocytaire induite.

Mécanisme de règlement des numéros adipocytes dans les organismes adultes grâce à la différenciation et l&#39;apoptose homéostasie

Drosophile est largement utilisé en tant que système modèle pour étudier la neurodégénérescence. Ce protocole décrit un procédé par lequel une dégénérescence, comme déterminé par la formation de vacuoles dans le cerveau, peuvent être quantifiés. Il minimise également les effets dus à la procédure expérimentale par le traitement et le contrôle sectionner et les mouches expérimentales comme un échantillon.

Mass histologie à Quantifier neurodégénérescence<em&gt; Drosophila</em

Le vaisseau dorsal abdominal de l’abeille et d’autres insectes sert d’équivalent fonctionnel du cœur de mammifère et joue un rôle important dans le transport des nutriments, l’élimination des déchets, la fonction immunitaire, etc. Nous décrivons ici un protocole pour la visualisation et la manipulation pharmacologique de la fréquence cardiaque des abeilles.

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Pour tester les effets inhibiteurs des agents pharmacologiques sur la phospholipase C (PLC) dans différentes régions du cerveau de l’abeille, nous présentons une analyse biochimique pour mesurer l’activité du PLC dans ces régions. Cet essai pourrait être utile pour comparer l’activité PLC entre les tissus, ainsi que chez les abeilles présentant des comportements différents.

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Taille d’acinus glandes hypopharyngiennes est une mesure fiable d’infirmière nutrition de miel abeille. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la dissection, coloration, imagerie et mesurer les acini de glande infirmière abeille laryngée.

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Présenté ici est un protocole pour utiliser le système CRISPR-Cas9 pour réduire la production d'une protéine dans le cerveau adulte d'abeille de miel pour tester la spécificité d'anticorps.

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Découvrez les méthodes immunohistochimiques pour détecter l'apoptose et la nécrose dans les tissus d'abeilles mellifères. Cette technique permet d'évaluer les effets cellulaires des pesticides sur la santé des pollinisateurs.

Principes de base de l’histologie et détection de la mort cellulaire dans les tissus d’abeilles mellifères

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