Technique d’injection d’embryons pour l’édition de gènes chez la tique à pattes noires, Ixodes scapularis

Il s’agit du premier protocole d’injection d’embryons pour une espèce de Celicérata. La possibilité d’injecter des embryons de tiques ouvrira de nombreuses pistes de recherche, en particulier des études sur la fonction des gènes des tiques et les interactions entre les tiques et les agents pathogènes. Cette technique permet de futurs travaux sur les études fonctionnelles des gènes des tiques et fournit une base pour le contrôle de la population de tiques en utilisant des systèmes de forçage génétique.

Cette méthode facilitera la compréhension de l’interaction entre les tiques et les agents pathogènes qu’elles hébergent au niveau moléculaire. Cela nous permettra d’identifier les protéines qui peuvent être utilisées pour le développement de vaccins contre la maladie de Lyme et d’autres agents pathogènes. Bien que plusieurs domaines de recherche tels que les interactions entre les tiques et les agents pathogènes et la transmission des agents pathogènes aux hôtes par les tiques pendant l’alimentation bénéficieront de ces travaux.

Des questions plus fondamentales telles que la façon dont les tiques échappent-elles à la réponse immunitaire de l’hôte et les différences dans les mécanismes de réparation de l’ADN peuvent également être comprises maintenant. Il y a quelques aspects de la biologie des tiques qui doivent être compris avant d’effectuer cette procédure. La pression interne élevée de l’embryon conduit à l’éclatement lorsqu’il est touché par une aiguille.

Il est très important de préparer les embryons pour l’injection. Pour commencer, transférez les femelles de quatre degrés Celsius à un incubateur de 27 degrés Celsius pour l’initiation de la ponte une semaine avant les injections. Après trois à quatre jours, lorsque les femelles commencent à pondre des œufs, retirez tous les œufs à l’aide d’un pinceau à pointe fine tout en préparant les femelles à l’ablation des organes de Gene.

Pour vider la glande, disposez la tique gravide sur une lame de verre sous un microscope de manière à ce que les pièces buccales soient visibles sur les côtés ventral et dorsal. Ensuite, percez soigneusement la zone située derrière les pièces buccales du côté dorsal et appliquez une pression sur la face ventrale à l’aide d’une pince. Placez le bord d’une lingette non pelucheuse et retirez la cire liquide sortant du site de ponction.

Alternativement, au lieu de vider la glande par dissection, des colles telles que de l’adhésif tissulaire peuvent être utilisées autour des pièces buccales de la tique. Lorsque les femelles recommencent à pondre, utilisez un pinceau fin pour recueillir les œufs fraîchement déposés et placez-les dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ajouter environ 200 microlitres d’eau de chlorure de benzalkonium à 5 % dans le tube contenant des œufs âgés de zéro à 18 heures.

Remuez doucement les œufs avec le pinceau pendant cinq minutes pour éviter qu’ils ne se déposent au fond du tube et retirez le surnageant à l’aide d’une micropipette, en laissant les œufs dans le tube. Ajouter environ 200 microlitres d’eau distillée dans le tube contenant les œufs. Tourbillonner avec un pinceau et retirer l’eau du tube microcentrifuge à l’aide d’une micro-pipette.

Après le lavage à l’eau distillée, ajoutez environ 200 microlitres de chlorure de sodium à 5% et agitez doucement avec un pinceau pendant cinq minutes. Ensuite, retirez la solution du tube après cinq minutes et lavez les œufs deux fois avec de l’eau distillée. Ensuite, ajoutez environ 100 microlitres de solution de chlorure de sodium à 1% dans le tube de microcentrifugation contenant des œufs.

Tout d’abord, collez deux lames de microscope en verre ensemble, en laissant un espace d’environ 0,5 centimètre pour soutenir l’alignement des œufs à l’aide d’un ruban adhésif double face, et appliquez un morceau de pansement de film transparent sur le ruban double face dans l’espace entre les lames. Alignez ensuite huit à 10 œufs à la fois sur la configuration de la diapositive à l’aide d’un pinceau. Placez ensuite la lame avec les œufs alignés sur la scène d’un microscope composé et retirez la solution de chlorure de sodium à 1% à l’aide d’un morceau de lingette non pelucheux dans lequel ils sont stockés.

Fixez l’aiguille d’injection remplie à un micro-injecteur relié à un micromanipulateur. Ensuite, ouvrez l’aiguille en la frottant doucement contre la surface de l’œuf à l’aide d’un réglage haute pression sur le micro-injecteur. Une fois l’aiguille ouverte, réduisez la pression du micro-injecteur en fonction de l’ouverture de l’aiguille.

Ensuite, injectez tous les œufs sur la lame à un angle de 10 à 15 degrés le plus rapidement possible, appuyez rapidement sur la pédale et déplacez immédiatement la lame dans des conditions d’humidité élevée dans une boîte de Petri avec une serviette en papier humide. Après cinq à six heures de placement de la lame contenant les embryons injectés dans une grande boîte de Petri tapissée de papier filtre humide, ajoutez une petite goutte d’eau distillée au pansement transparent avec les embryons injectés attachés. Ensuite, déplacez doucement les œufs à l’aide d’un pinceau.

Ensuite, transférez les œufs dans une petite boîte de Petri et plongez-les dans de l’eau distillée. Gardez les œufs immergés dans l’eau, placez la boîte de Petri dans une boîte en plastique de six pintes dans un incubateur à 27 degrés Celsius à plus de 90% d’humidité relative. Lorsque la larve commence à éclore des embryons injectés 21 à 25 jours après l’injection, vérifiez-les quotidiennement et transférez toutes les larves écloses dans des flacons en verre avec un écran sur le dessus.

Les résultats ont démontré que l’injection des œufs au début de l’embryogenèse âgée de 12 à 18 heures et l’alignement de l’axe le plus long de l’œuf perpendiculairement au bord de la lame entraînent un taux de survie plus élevé des œufs injectés. De tous les œufs injectés, jusqu’à 8,5% ont survécu et la larve a éclos. Avant de commencer cette procédure, il est important de se rappeler les étapes 2.4, retrait de la cire de la tique mère, et les étapes 3.1 à 3.4, ramollissement du chorion de l’embryon avec du chlorure de benzalkonium et dessiccation de l’embryon avec des solutions de chlorure de sodium pour permettre une injection embryonnaire réussie.

Cette méthode a été développée principalement pour l’édition de gènes de tiques, ce qui nous permettra de faire des knockouts et des knock-ins qui nous aideront à comprendre la fonction du gène de la tique. Cette technique permettra d’utiliser des outils d’édition de gènes disponibles pour de nombreux autres organismes à appliquer à la recherche sur les tiques. Et cela accélérera la recherche sur la biologie moléculaire des tiques.