Transformation induite par un médiateur de phospholipides dans des cultures tridimensionnelles

Nos cultures d’essais 3D modifiées peuvent être utilisées pour étudier le rôle de divers composants dans un microenvironnement cancéreux, ce qui conduit à l’identification de nouveaux biomarqueurs et cibles médicamenteuses. Cette méthode permet d’étudier les changements dans le phénotype cellulaire et la signalisation moléculaire qui ressemblent étroitement au système immunitaire. Il peut également être modifié pour répondre aux exigences spécifiques d’une étude.

Cette méthode peut aider à identifier de nouveaux biomarqueurs qui peuvent aider à la détection précoce du cancer du sein. En outre, les connaissances moléculaires peuvent être utilisées pour identifier de nouvelles cibles médicamenteuses. Cette méthode peut être utilisée pour étudier à la fois la tumorigenèse et la morphogenèse après perturbation du ou des gènes qui peuvent donner un aperçu du rôle joué par le ou les gènes.

Pour commencer, trypsiniser les cellules en aspirant le milieu et en les lavant avec 2 millilitres de PBS. Ajouter 900 microlitres de trypsine-EDTA à 0,05% et incuber à 37 degrés Celsius pendant environ 15 minutes ou jusqu’à ce que les cellules soient complètement trypsinisées. Préparer un lit de lrECM dans huit puits d’une lame de verre à couvercle chambré en recouvrant chaque puits de 60 microlitres de lrECM.

Placez-le dans un incubateur à dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant un maximum de 15 minutes. Pour préparer la suspension cellulaire, ajoutez 5 millilitres de milieu de remise en suspension pour éteindre l’activité de la trypsine et faites tourner les cellules à 112 fois g pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius. Aspirer le milieu usé et remettre les cellules en suspension dans 2 millilitres de milieu de dosage.

Bien mélanger la suspension pour assurer la formation d’une suspension unicellulaire. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et calculer le volume de suspension cellulaire nécessaire pour ensemencer 6 000 cellules dans chaque puits. Selon le nombre de puits requis, diluer la suspension cellulaire dans le milieu de recouvrement.

Ajouter 400 microlitres de la suspension cellulaire diluée aux lrECM préparés, en veillant soigneusement à ne pas perturber le lit lrECM. Incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone. Après 3 heures, ajoutez 200 nanomoles de PAF à chaque puits.

Ajoutez la même concentration de PAF lors de chaque changement de milieu et reconstituez les cellules avec du milieu frais tous les 4 jours. Après 20 jours de culture, pipeter soigneusement le milieu de chaque puits et laver les puits avec 400 microlitres de PBS préchauffé. Fixez les structures acineuses en ajoutant 400 microlitres de paraformaldéhyde à 4% fraîchement préparé et en incubant pendant 20 minutes à température ambiante.

Rincez les puits une fois avec du PBS glacé et perméabilisez avec du PBS contenant 0,5% de Triton X-100 pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Après 10 minutes, épongez soigneusement la solution de Triton X-100 et rincez avec 400 microlitres de glycine PBS fraîchement préparée. Ajouter 400 microlitres de la solution de blocage primaire comprenant 10% de sérum de chèvre dans un tampon d’immunofluorescence et incuber à température ambiante pendant 60 minutes.

Retirez la solution de blocage primaire, ajoutez 200 microlitres d’anticorps bloquant secondaire à 2% préparé dans la solution de blocage primaire et laissez-la à température ambiante pendant 45 à 60 minutes. Préparer l’anticorps primaire dans une solution d’anticorps bloquant secondaire à 2% dans une dilution 1:100. Retirez la solution de blocage secondaire, ajoutez l’anticorps fraîchement préparé et incuber pendant la nuit à 4 degrés Celsius.

Pipeter soigneusement la solution d’anticorps primaire et la laver trois fois avec 400 microlitres de tampon d’immunofluorescence. Ensuite, préparez une dilution 1:200 de l’anticorps secondaire conjugué au fluorophore dans la solution de blocage primaire et incuber les lames dans la solution d’anticorps secondaire pendant 40 à 60 minutes à température ambiante. Rincer les lames avec 400 microlitres de tampon d’immunofluorescence pendant 20 minutes, suivies de deux lavages avec du PBS pendant 10 minutes chacun.

Contre-colorer les noyaux avec du PBS contenant 0,5 nanogramme par millilitre de coloration nucléaire pendant 5 à 6 minutes à température ambiante. Lavez les lames trois fois avec 400 microlitres de PBS pour enlever l’excès de tache. Extraire soigneusement le PBS entier et assurer l’élimination de la solution résiduelle.

Ajoutez ensuite une goutte de réactif de montage dans chaque puits et laissez-le reposer à température ambiante pendant la nuit. Enfin, imagez les lames avec un grossissement de 40x ou 63x au microscope confocal, en prenant des coupes Z optiques de 0,6 millimètre de taille. Les images représentent les noyaux de cellules en acini colorés avec une coloration nucléaire.

La construction 3D de l’acini et l’image de contraste de phase de MCF10A acini cultivé sur lrECM pendant 20 jours sont montrées ici. La section la plus centrale montre la présence d’une lumière creuse. PAF perturbe la polarité et induit des changements de type EMT dans les acini mammaires MCF10A.

Les cellules MCF10A ont été cultivées en 3D sur des cultures supérieures en lrECM. Les cultures ont été traitées avec PAF les jours 0, 4, 8, 12 et 16. Les cultures ont été maintenues pendant 20 jours, puis immunocolorées pour l’alpha6-intégrine et la coloration nucléaire, GM130, un marqueur de polarité apicale, et Vimentin, un marqueur EMT.

La pile la plus centrale des acini respectifs a été montrée ici. Les données représentatives concernent 40 à 50 acini provenant de trois expériences biologiquement indépendantes. Le lit lrECM doit être soigneusement fait de manière à être réparti uniformément sans bulles d’air.

En outre, la suspension cellulaire doit être mélangée uniformément et ajoutée lentement pour éviter l’agglutination. On peut obtenir des protéines et de l’ARN à partir des cultures 3D qui peuvent ensuite être utilisés pour étudier les différentes voies moléculaires.