Isolement de cellules endothéliales glomérulaires de souris immortalisées conditionnellement avec des mitochondries fluorescentes

Les cellules endothéliales glomérulaires immortalisées avec des mitochondries fluorescentes stables sont un excellent outil pour examiner l’effet de différents stimuli sur la structure mitochondriale in vitro. La méthode décrite dans le présent article produit un nombre élevé de cellules endothéliales glomérulaires. En testant de petites molécules sur un GEC, nous pourrions dépister en monothérapie pour la maladie rénale diabétique où les GEC sont affectés.

La méthode décrite est facile à réaliser et ne nécessite pas d’équipement spécifique. Cependant, il est important de suivre les étapes décrites et de stériliser l’équipement pour éviter toute contamination. Pour commencer, placez les matériaux de perfusion et d’isolement nécessaires pour isoler les cellules glomérulaires rénales sur un espace de travail.

Filtrez la solution saline équilibrée Hanks' fraîchement préparée, ou HBSS, avec un filtre de 0,2 micron, et gardez-la sous le capot pour éviter toute contamination. Ensuite, mélangez 200 microlitres de billes magnétiques avec 20 millilitres de HBSS. Préchauffer le RPMI avec 10% FCS et milieu de culture de cellules endothéliales dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Ensuite, pré-enduisez deux puits d’une plaque à six puits avec deux millilitres de 10 microgrammes par millilitre de collagène IV pendant 45 minutes à température ambiante. Lavez la plaque deux fois avec du PBS pour éliminer l’acide acétique utilisé pour diluer le collagène. Utilisez les plaques enduites immédiatement ou conservez-les à une température de deux à huit degrés Celsius jusqu’à quatre semaines.

Nettoyez les instruments chirurgicaux et l’espace de travail avec de l’éthanol à 70%. Ensuite, autoclaver les instruments chirurgicaux pendant 30 minutes. Après avoir ouvert l’abdomen d’une souris anesthésiée, insérez une aiguille papillon dans le ventricule gauche.

Pour injecter 100 microlitres de la solution de billes pour élargir la circulation sanguine, cassez soigneusement la veine cave inférieure sous les reins avec une aiguille de calibre 19 et continuez la perfusion de la solution de billes. Ensuite, retirez doucement le tissu adipeux avec une pince à épiler, excisez les deux reins avec de minces ciseaux chirurgicaux C et placez-les sur une assiette avec un millilitre de HBSS sur de la glace. Hacher le rein avec un scalpel stérile en petits morceaux d’un millimètre.

Incuber le rein émincé avec un millimètre de collagénase de type II fraîchement préparée pendant 35 minutes à 37 degrés Celsius en inclinant doucement sur un agitateur horizontal. Après la digestion, ajoutez quatre millilitres de RPMI avec 10% FBS pour neutraliser la collagénase. Filtrer le tissu digéré à travers une passoire cellulaire stérile de 100 microns dans un tube de 50 millilitres.

Utilisez le fond d’un tube stérile de 1,5 millilitre pour remuer le tissu digéré contre la passoire, permettant ainsi aux glomérules de passer. Rincez la passoire cellulaire avec 15 millilitres de HBSS. Ensuite, centrifuger le flux continu à 200 XG pendant cinq minutes à température ambiante.

À ce stade, le tube contient trois couches. La couche supérieure contient des structures plus petites telles que des tubules, la couche intermédiaire est constituée de perles avec des glomérules et la couche inférieure contient des débris. Aspirez soigneusement le surnageant et la couche blanche supérieure.

Ensuite, remettez en suspension la pastille contenant des billes portant les glomérules et les débris dans 1,5 millilitre de HBSS et transférez-la dans un tube de deux millilitres. Placez le tube dans un concentrateur magnétique et aspirez le surnageant avant de laver les billes deux fois avec un millilitre de HBSS. Placez 20 microlitres de suspension cellulaire sur une lame.

Ensuite, observez la lame au microscope pour détecter la présence de glomérules. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans un milieu de croissance des cellules endothéliales et transférez la suspension dans un tube de deux millilitres. Ajouter un microlitre d’interféron gamma pour chaque trois millilitres de milieu et placer les cellules dans une plaque de six puits pour l’incubation à 33 degrés Celsius.

Après trois jours de culture, remplacez soigneusement le milieu d’un millilitre par un milieu frais. À ce stade, les cellules sont hétérogènes avec un mélange de cellules glomérulaires. Après sept jours, remplacez le milieu par deux millilitres de milieu de croissance de cellules endothéliales fraîches, complété par de l’interféron gamma pour commencer la prolifération cellulaire.

Après 10 jours, lorsque les cellules atteignent 80% de confluence, les faire passer à l’aide de trypsine et les transférer dans une fiole T-25 recouverte de collagène IV.Après 21 jours de culture, transférer les cellules dans une fiole T-75. Ajouter trois millilitres de trypsine à 0,25% dans une fiole de T-75 et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, neutralisez la trypsine avec trois millilitres de milieu de croissance endothéliale et transférez la suspension dans un tube de 15 millilitres pour la centrifugation à 200 XG pendant cinq minutes.

Aspirer le surnageant et laver les cellules dans un millilitre de PBS contenant 1% de BSA, deux millimolaires d’EDTA, 1% de pénicilline / streptomycine. Encore une fois, centrifugez et remettez en suspension la pastille dans 200 microlitres de billes enrobées d’anticorps CD31 et 800 microlitres de PBS. Incuber les cellules pendant 45 minutes en agitant continuellement à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.

Ensuite, placez le tube dans le concentrateur magnétique et lavez les cellules quatre fois avec du PBS contenant du BSA, de l’EDTA et de la pénicilline / streptomycine. Après le dernier lavage, remettez les cellules en suspension dans trois millilitres de milieu de croissance endothéliale, complétés par de l’interféron gamma. Plaque de 1,5 millilitre de cellules par puits dans des puits recouverts de collagène IV sur une plaque de six puits et culture dans des conditions permissives à 33 degrés Celsius.

Après quatre jours, remplacez 750 microlitres du milieu par un milieu de croissance endothélial frais, complété par de l’interféron gamma. Après 10 à 14 jours de culture, à l’aide d’un microscope à épifluorescence avec un filtre de 488 nanomètres, observer la croissance de cellules endothéliales glomérulaires CD31 positives, ou GEC, colonies qui expriment des mitochondries fluorescentes. Après 21 jours, ou lorsque les cellules ont atteint 80 à 90% de confluence, transvasez-les dans une fiole T-25.

Maintenir la culture avec un milieu de croissance RPMI contenant 10% FCS. Alternativement, les cellules peuvent être cryoconservées. Cellules de passage utilisant la trypsine, comme démontré précédemment.

Ensuite, centrifugez les cellules et remettez la pastille en suspension dans trois millilitres de milieu de congélation. Aliquote les cellules dans des tubes cryo et les stocker dans de l’azote liquide, température de vapeur. Ce protocole décrivait une méthode d’isolement des cellules endothéliales glomérulaires.

À partir des glomérules isolés, les cellules ont commencé à croître lentement après trois jours de culture. Après sept jours, les cellules semblaient hétérogènes et présentaient d’autres types de cellules glomérulaires, telles que les podocytes, les cellules pariétales, épithéliales et mésangiales. Après avoir atteint 70 à 80% de confluence, d’autres cellules glomérulaires ont été retirées en utilisant une sélection positive de cellules endothéliales.

Les GEC MitoDendra2 exprimaient CD31 et étaient négatifs pour le marqueur podocytaire, comme le montre la coloration négative à la synaptopodine. L’effet de la concentration de glucose sur la structure des mitochondries a été examiné. Par rapport aux mitochondries allongées visibles dans les cellules sous glucose normal, un glucose élevé a induit une fragmentation ou une fission des mitochondries, comme observé par les mitochondries proéminentes en forme de sphéroïde.

De plus, un laser de 405 nanomètres a été utilisé pour photoconvertir une sous-population sélectionnée de mitochondries en un seul GEC MitoDendra2 vivant. Une photocommutation réussie des mitochondries du vert au rouge dans la zone sélectionnée pour les cellules traitées à concentration normale et élevée de glucose est montrée. Cette commutation a permis d’assister aux événements de fusion dans les GEC MitoDendra2.

Sous glucose normal, une fluorescence verte et rouge fusionnée jaune a été observée en raison de la fusion de la matrice mitochondriale. En revanche, dans les GEC traités à haute teneur en glucose, les mitochondries étaient principalement fragmentées. Placer les cellules dans un puits de plaque de six puits avec un petit volume de milieu de croissance est essentiel pour permettre aux cellules de se fixer à la boîte.

Les cellules endothéliales isolées pourraient être utilisées pour effectuer des études de fonction mitochondriale et structurelles. L’utilisation de cellules endothéliales immortalisées avec des caractéristiques mitochondriales fluorescentes ouvrira la voie à la découverte de médicaments. Les petites molécules pourraient être testées sur les cellules, et l’imagerie en direct est effectuée pour examiner leur effet sur la fonction mitochondriale.