Préparation et évaluation structurale de monocouches de cellules épithéliales dans un dispositif de culture microfluidique de taille physiologique

Ce protocole sert à abaisser une barrière à l’entrée pour l’expérimentation en culture cellulaire et permet aux chercheurs d’évaluer et de caractériser les monocouches cellulaires adhérentes cultivées dans des environnements microfluidiques dynamiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une évaluation qualitative et quantitative des caractéristiques de la monocouche cellulaire pour servir de base à d’autres expériences dépendantes de la monocouche. Cette méthode permet la récapitulation d’un épithélium alvéolaire in vitro, permettant d’explorer les réponses dynamiques au cours du syndrome de détresse respiratoire aiguë, SDRA, ainsi que des lésions pulmonaires induites par la ventilation, VILI.

Pour commencer, procurez-vous un tableau de flux monocanal. Nettoyez la surface du verre de couverture dans un bain à ultrasons. Plongez le verre de couverture dans la poly-d-lysine à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, séchez-le à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, apposez des adhésifs double face dans des entretoises Mylar. Découper au laser comme décrit dans le manuscrit sur le verre de couverture et s’assurer que les découpes du canal sont alignées avec précision.

Fixez un verre à couvercle rectangulaire sur la bande adhésive la plus basse. Utilisez les papiers adhésifs pelés pour couvrir les parties d’adhésif encore exposées. Une fois l’assemblage terminé, appliquez une pression ferme et égale à la construction.

À l’aide d’une seringue remplie d’eau désionisée, rincer le canal. Stérilisez l’enceinte du canal dans un stérilisateur ultraviolet pendant 30 minutes. À l’aide d’une technique stérile, traiter le canal avec une solution de fibronectine humaine préparée dans du PBS et incuber pendant au moins 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Dans la hotte laminaire stérile, préparer la suspension cellulaire NCI H441 en utilisant un milieu RPMI 1640 avec 10% FBS. Utilisez 0,25 millilitre de cette suspension cellulaire pour remplir le canal et une partie des ports. À l’aide de la microscopie à fond clair, vérifier que les cellules ont été réparties uniformément dans les canaux.

Ajoutez le réservoir de média et le robinet d’arrêt au canal. Commencez à cultiver le canal à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Utilisez une pompe à seringue programmable pour aspirer les fluides usés du canal et les fluides frais dans le canal à partir d’un réservoir de média stérile fixé à l’entrée du canal.

Dans une hotte chimique, diluer une solution de formaldéhyde à 4% dans du DPBS pour créer une solution à 1% et stocker dans un tube correctement étiqueté. Préparez la solution de formaldéhyde à 2% de la même manière. Transférer les solutions de formaldéhyde dans des seringues de cinq millilitres correctement étiquetées.

Aspirez 20 millilitres de DPBS dans une seringue séparée de 20 millilitres qui sera utilisée pour les étapes de lavage. Ensuite, retirez le canal microfluidique de l’appareil de culture et fixez-le dans la hotte chimique. Pour assembler l’appareil de fixation et de coloration, fixez un segment de tube de transfert à l’orifice latéral d’un robinet d’arrêt à trois voies via un adaptateur de barbe de verrouillage Luer mâle à boyau.

Connectez ensuite le robinet d’arrêt au port d’entrée du réseau de flux. Fixez un autre segment de tube de transfert à l’orifice de sortie du robinet d’arrêt existant à l’aide du même type d’adaptateur barbe de tuyau. Enfin, fixez les extrémités libres des deux tubes de transfert maintenant désignés comme conduites de déchets dans un conteneur à déchets adapté aux risques chimiques et biologiques.

Assurez-vous que le robinet d’arrêt bloque l’orifice d’entrée du réseau d’écoulement et rincez la conduite de déchets avec DPBS. Ensuite, tournez le robinet d’arrêt pour bloquer la ligne de déchets et lavez lentement les cellules avec deux millilitres de DPBS. Poussez lentement deux millilitres de fixateur à 1% à travers le canal.

Laisser reposer pendant cinq minutes et répéter avec 2% fixatif. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec du DPBS frais comme démontré précédemment. Préparer la solution de saponine à 0,1% comme décrit dans le manuscrit.

Aspirez des DPBS supplémentaires dans une seringue de 20 millilitres pour une utilisation dans les étapes de lavage. Couvrir le tube avec du papier d’aluminium. Ajouter le réactif filamenteux de coloration à l’actine phalloïdine et un réactif Hoechst colorant le noyau à la solution de saponine à 0,1%.

Transférer ensuite la solution dans une seringue recouverte d’une feuille d’aluminium. Rincer la conduite de déchets avec une petite quantité de solution de perméabilisation et de coloration. Introduisez ensuite deux millilitres de la solution dans le canal microfluidique.

Couvrez le canal avec du papier d’aluminium pour bloquer la lumière. Après 30 minutes, rincer la solution perméabilisante avec deux millilitres de DPBS deux fois pendant cinq minutes chacun avant de sécher doucement le canal. À l’aide d’une micropipette, introduire une quantité minimale d’un support anti-décoloration souple dans le canal microfluidique en veillant à couvrir complètement la surface inférieure.

Scellez ensuite l’extrémité du canal. À l’aide d’un microscope à fond clair, vérifiez rapidement l’intégrité de la couche cellulaire avant de stocker le canal dans un récipient pour le protéger de la lumière. Testez les emplacements d’imagerie en prenant des scans de référence et des piles z jusqu’à ce que les paramètres et conditions d’image souhaités soient satisfaits.

En utilisant la plaque de base du réseau d’écoulement comme référence, construisez des piles z à différents endroits le long du canal. Enfin, analysez les données transversales, les données de carte de profondeur et toute autre caractéristique pertinente pour évaluer les propriétés de la couche cellulaire. L’utilisation réussie de la technique est démontrée dans l’environnement de culture dynamique microfluidique par acquisition d’images à au moins un centimètre de l’entrée et de la sortie.

Dans une expérience représentative de durée de culture, une production monocouche réussie a été observée lorsque les cellules ont été cultivées pendant 24 heures. Cependant, lors de la culture pendant 48 heures, une formation multicouche indésirable a été observée. Les données recueillies à chacun des cinq emplacements d’imagerie des canaux microfluidiques révèlent également la relation entre l’augmentation de la durée de culture et l’augmentation de la section transversale, ce qui suggère que la formation inégale ou la prolifération de couches se produit dans les 48 heures suivant la culture.

La carte de profondeur d’un emplacement central dans le canal microfluidique cultivé pendant 24 heures a été obtenue, ce qui est utile pour l’évaluation qualitative des caractéristiques de la couche. Les trois aspects les plus cruciaux de ce protocole sont la construction correcte du canal, des conditions précises de culture et de flux de fluide, ainsi qu’une utilisation prudente de l’appareil de fixation et de coloration. Suite à cette procédure, d’autres méthodes peuvent être utilisées en parallèle pour valider la viabilité expérimentale des monocouches cellulaires produites telles que la détection d’impédance cellule-substrat électrique, ECIS, ou résistance électrique transépithéliale, TEER.