Name: Isolement en douceur des noyaux du tissu cérébral d’un poisson turquoise africain adulte, un modèle naturellement éphémère pour la recherche sur le vieillissement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Découvrez un protocole doux d'isolement de noyaux de cerveau de Nothobranchius furzeri pour le séquençage à noyau unique. Cette méthode permet d'étudier le vieillissement cérébral au niveau cellulaire.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole présenté ici peut être utilisé pour générer de manière reproductible des noyaux de haute qualité à partir de cerveaux de killifish. Ce protocole devait être spécialement conçu pour le cerveau des killifish, car les protocoles d’isolement des noyaux cérébraux typiques des mammifères appliqués aux cerveaux de killifish entraînaient systématiquement une mauvaise qualité des noyaux entre nos mains. Nous soupçonnons que cela est dû à la teneur relative en myéline plus faible du cerveau du killifish par rapport à leurs homologues mammifères, qui se lyseraient et s’agglutineraient en réponse aux conditions difficiles requises pour la lyse des cellules cérébrales des mammifères. Ce protocole est une avancée dans les domaines du vieillissement et du killifish, car il facilite l’exploration du vieillissement cérébral au niveau de la cellule unique dans un modèle rentable et rapide du vieillissement du cerveau des vertébrés. 
Ce protocole est robuste pour les échantillons frais ou congelés, bien qu’il faille tenir compte des applications en aval lors de l’utilisation de tissus frais ou congelés. Les tissus congelés sont souvent pratiques car ils peuvent être prélevés et stockés pendant des mois pendant que les échantillons sont collectés. De tels échantillons peuvent être utilisés en toute sécurité pour des applications telles que le snRNA-seq. Cependant, la congélation des échantillons peut perturber la structure nucléaire et donc la capacité de mesurer avec précision le paysage chromatinique par ATAC-seq21. Ainsi, pour les applications en aval telles que l’ATAC-seq en vrac ou le snATAC-seq, il est recommandé d’utiliser des cerveaux fraîchement disséqués au lieu de cerveaux congelés. De plus, comme toutes les étapes suivant l’homogénéisation du cerveau peuvent être effectuées en parallèle, ce protocole se prête à l’exécution de plusieurs échantillons dans un délai raisonnable, limitant ainsi la dégradation de l’ARN causée par une incubation prolongée sur la glace.
De plus, il est impératif de préparer des tampons frais (dans les heures qui suivent l’extraction des noyaux). Nous avons constaté que des détergents ainsi que du BSA doivent être ajoutés aux tampons immédiatement avant le début du protocole. Les tampons contenant uniquement des sels (PBS, NaCl, etc.) peuvent être fabriqués sous forme de concentrés, stérilisés par filtre (0,22 μm) et stockés indéfiniment à température ambiante. Les solutions mères de BSA peuvent être préparées, stérilisées et stockées à 4 °C dans les jours suivant l’extraction des noyaux (si elles sont préparées à partir d’une poudre), mais elles doivent toujours être ajoutées aux tampons utilisés dans ce protocole immédiatement avant d’entreprendre le protocole. Cependant, nous recommandons de préparer les solutions BSA le jour du protocole. Si vous utilisez des solutions BSA préfabriquées d’un tiers, il est conseillé d’utiliser des bouteilles fraîches et non ouvertes. L’utilisation de BSA frais entraîne généralement une réduction de la teneur en débris dans les préparations des noyaux.
Que des échantillons frais ou congelés soient utilisés comme intrants, il est important d’évaluer la qualité des noyaux après l’isolement des noyaux. Bien que ce protocole soit spécifiquement conçu pour éviter la surlyse, c’est la cause la plus fréquente de perte de qualité des noyaux. La surlyse peut résulter d’un temps trop long passé dans le tampon de lyse, d’une manipulation trop brutale des noyaux telle qu’un pipetage excessif avec une pointe de pipette d’alésage standard, ou d’un temps excessif passé entre l’isolement des noyaux et les applications en aval (>1 h). Les noyaux trop lysés auront souvent des périphéries nucléaires endommagées, qui fuient l’ADN et provoquent des agglutinations (Figure 2B). Cela conduira à un nombre accru de multiplets et contribuera aux acides nucléiques de fond qui interféreront avec les applications en aval, en particulier le séquençage de l’ARNn. Les deux qualités peuvent être évaluées par microscopie après isolement des noyaux. Si une agrégation nucléaire excessive est observée, nous recommandons d’essayer de raccourcir l’incubation de l’étape de lyse pour réduire le risque de surlyse. Comme méthode alternative pour augmenter les singulets des noyaux, le tri cellulaire assisté par fluorescence (FACS) peut être utilisé pour enrichir les singulettes en aval de ce protocole. Cependant, nous notons que, lorsque l’on travaille avec des noyaux déjà fragiles provenant de tissus congelés, la contrainte de cisaillement survenant lors du tri peut entraîner une rupture nucléaire accrue et donc une augmentation de l’ARN/ADN ambiant. De plus, nous notons que le temps requis pour effectuer un tri du rendement FACS pour les noyaux lors du traitement de plusieurs échantillons exigerait que tous les échantillons de noyaux restent sur la glace pendant des heures, tandis que d’autres échantillons sont triés. Ainsi, l’augmentation des temps d’attente lors du traitement de plusieurs échantillons en parallèle avec l’approche FACS pourrait également entraîner une réduction globale de la qualité des noyaux et augmenter le risque de dégradation de l’ARN. Ainsi, si le FACS est souhaité pour un taux de doublet réduit, nous recommandons que la teneur en débris soit vérifiée à nouveau après le tri du rendement et que la qualité éventuelle réduite de l’ARN soit prise en compte pour les applications de séquençage d’ARN unicellulaire comme mise en garde potentielle. 
Une estimation précise du nombre de noyaux et de la proportion singulet est essentielle pour presque toutes les applications « omiques » en aval et est de la plus haute importance. En raison de la capacité de porter et de compter facilement les noyaux par taille, la cytométrie en flux est la méthode la plus précise de comptage des noyaux que nous ayons évaluée. Alternativement, on peut quantifier les noyaux en utilisant des compteurs de cellules tels que le compteur de cellules automatisé Countess 2 FL d’Invitrogen ou le compteur de cellules automatisé DeNovix CellDrop. À noter, le compteur automatisé de cellules Countess 2 FL d’Invitrogen et, dans une bien moindre mesure, le DeNovix, ont tendance à surestimer le nombre de noyaux en comptant les débris comme des noyaux, ce qui signifie que des contrôles manuels peuvent être nécessaires. De plus, le cytomètre en flux permet d’évaluer facilement la pureté des noyaux. On peut discerner la proportion relative de noyaux singulet par rapport aux noyaux multiplets d’une manière quantitative qui est difficile par microscopie. Ceci est vital pour snRNA-seq et snATAC-seq, car ces protocoles souffriront d’un surplus d’échantillons multiplet, qui doivent être exclus des analyses en aval. En plus des multisegments, la proportion relative de « débris » (noyaux fragmentés, débris cellulaires) peut être quantifiée par cytométrie de flux et doit être relativement faible, car ce matériau contient souvent des acides nucléiques contaminants qui peuvent contribuer à un signal de fond et corrompre les données « omiques » à noyau unique. 
Comme pour les protocoles d’isolement des noyaux décrits précédemment, les proportions de types de cellules dans le tissu d’origine peuvent ne pas être récapitulées fidèlement dans la préparation des noyaux19 et doivent donc être interprétées avec prudence. À noter, comme tous les téléostéens, les killifish turquoises africains ont des érythrocytes nucléés, qui devraient également être représentés dans la préparation des noyaux. Ces noyaux peuvent être identifiés dans les ensembles de données snRNA-seq et snATAC-seq par l’expression / accessibilité plus élevée des gènes de l’hémoglobine et peuvent être exclus par calcul si désiré.

Comprendre les mécanismes du vieillissement cérébral des vertébrés est essentiel pour lutter contre les maladies neurodégénératives liées à l’âge telles que la maladie d’Alzheimer et la démence1. Le killifish turquoise africain (Nothobranchus furzeri) est le vertébré ayant la plus courte durée de vie qui puisse être élevé en captivité, et en raison de sa courte durée de vie et de sa déficience cognitive associée à l’âge, c’est un excellent modèle de vieillissement cérébral 2,3,4,5. Récemment, l’avènement de technologies « omiques » unicellulaires, telles que le séquençage de l’ARN à noyau unique (snRNA-seq) et le dosage à noyau unique de la chromatine accessible par transposase avec séquençage (snATAC-seq), a permis aux chercheurs d’interroger le cerveau vieillissant à une résolution sans précédentde 6,7,8. Ces méthodes reposent sur l’isolement des noyaux, car la récupération des cellules cérébrales telles que les neurones est souvent trop difficile à isoler 6,7,8,9,10. Cependant, la plupart des protocoles d’isolement des noyaux publiés sont optimisés pour les organismes modèles de mammifères 11,12,13,14,15. Ainsi, comme il existe actuellement un besoin non satisfait d’isoler les noyaux cérébraux du killifish en tant que nouvel organisme modèle prometteur dans le domaine de la recherche sur le vieillissement2, l’objectif de ce protocole est d’établir une méthode pour isoler les noyaux de haute qualité des tissus cérébraux congelés.
Ici, un flux de travail rationalisé et robuste est établi qui utilise des matériaux couramment disponibles pour isoler des noyaux de haute qualité des cerveaux de killifish. Ce protocole a été modifié à partir d’un protocole de génomique 10x pour les cerveaux de souris afin de tenir compte de la faible teneur en myéline des killifish turquoises africains, de la fragilité des tissus congelés et de la nécessité de réduire la teneur en débris ambiants pour les applications liées au séquençage16. En effet, les protocoles précédemment optimisés pour les tissus cérébraux de mammifères17,18 conduisent à des noyaux de mauvaise qualité (c.-à-d. une surlyse) et / ou à une teneur élevée en débris lorsqu’ils sont utilisés sur des cerveaux de killifish congelés, ce qui les rend impropres à une utilisation avec le séquençage de l’ARNn selon les recommandations pour le séquençage de l’ARN à noyau unique utilisant la microfluidique (Figure supplémentaire 1).
En plus de l’isolement des noyaux, nous démontrons comment évaluer la qualité et le rendement des noyaux par microscopie et cytométrie en flux. Cet article fournit des exemples de résultats optimaux et sous-optimaux et traite du dépannage. Ce protocole a été conçu et optimisé pour les cerveaux de killifish congelés, mais peut également être utilisé sans modifications majeures sur des échantillons de killifish fraîchement disséqués. Les noyaux cérébraux de Killifish isolés à l’aide de cette méthode ont été optimisés pour une utilisation dans le séquençage de l’ARN à noyau unique (snRNA-seq) en tant qu’application en aval, mais devraient également pouvoir être utilisés dans snATAC-seq et ATAC-seq en vrac.

<table><tbody><tr><td>0,4 % Trypan Blue solution</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Bioland</td><td>PBS01-03</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conicle Centrifuge Tube</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Tissue Grinder</td><td>Kimble</td><td>885300-0002</td><td>Dounce Homogénéisateur</td></tr><tr><td>5 mL Polystyrène Tube à fond rond</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>5M Chlorure de sodium, Biologie moléculaire Qualité</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Solution de rinçage</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>Cela correspond à 1x PBS pH 7,2, 2 mM EDTA (utilisé pour la cytométrie en flux)</td></tr><tr><td>Solution d’élimination des débris</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-398</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBInd Tube</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Echo Revolve microscope (équipé d’un objectif 60x)</td><td>Echo</td><td>NA</td><td>: Pas de numéro de catalogue ; Utilisé pour inspecter visuellement les noyaux.</td></tr><tr><td>Falcon Tubes en polystyrène à fond rond, 5 mL</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td>FACS Tube FLOWMI</td></tr><tr><td>Cellules, 40 &mu ; M</td><td>SP Bel-Art</td><td>136800040</td><td>Appelés filtres à pointe dans le protocole</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258146-500 mL</td><td>Utilisé pour abaisser le pH TRIS de 8,0 à 7,4</td></tr><tr><td>Lunette de dissection Leica EZ4</td><td>Leica</td><td>NA</td><td>Sans numéro de catalogue</td></tr><tr><td>MACS BSA solution mère</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130091376</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (70 &mu ; M)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 Cytomètre en flux</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>NA</td><td>Sans numéro de catalogue</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium, hexahydraté, biologie moléculaire Qualité (poudre)</td><td>Millipore</td><td>442611</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 16R Centrifugeuse</td><td>ThermoScientific</td><td>75003629</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glass</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Micro Slides Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Substitut</td><td>Roche</td><td>(Roche) 11332473001/ Catalogue : 983739 P Code : -102368106 (Sigma Aldrich)</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Sans nucléase HyPure Molecular Biology Grade</td><td>Water HyClone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>NxGen RNase Inhibiteur (50 000 U)</td><td>Lucigen</td><td>30281-2</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’iodure de propidium</td><td>MBL</td><td>FP00010020</td><td></td></tr><tr><td>PureBlu DAPI Colorant de coloration nucléaire</td><td>Biorad</td><td>1351303</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT Pointes de pipette (Ultra faible rétention, filtrées) en 10 & micro ; L, 20 et micro ; L, 200 et micro ; L, et 1000 &micro ; Tailles L</td><td>USA Scientific</td><td>#1181-3810 ; #1180-1810 ; #1180-8810 ; #1182-1830</td><td></td></tr><tr><td>Tricaïne-S (MS 222)</td><td>Syndel</td><td>Tricaïne10G</td><td>Syndel est un fournisseur approuvé par la FDA pour la tricaïne de qualité pharmaceutique</td></tr><tr><td>TRIS, 1 M, pH 8.0</td><td>VWR</td><td>E199-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Embouts de pipette à alésage large</td><td>Axygen</td><td>T-1005-WB-C</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement en douceur des noyaux du tissu cérébral d’un poisson turquoise africain adulte, un modèle naturellement éphémère pour la recherche sur le vieillissement

Gentle Isolation of Nuclei from the Brain Tissue of Adult African Turquoise Killifish, a Naturally Short-Lived Model for Aging Research

L’étude du vieillissement cérébral à une résolution unicellulaire dans les systèmes de vertébrés reste difficile en raison des contraintes de coût, de temps et techniques. Ici, nous démontrons un protocole pour générer des bibliothèques de séquençage d’ARN mononoyau (snRNA-seq) à partir du cerveau du killifish turquoise africain naturellement éphébré Nothobranchius furzeri. Le killifish turquoise africain a une durée de vie de 4 à 6 mois et peut être hébergé de manière rentable, réduisant ainsi les obstacles de coût et de temps pour étudier le vieillissement cérébral des vertébrés. Cependant, des protocoles sur mesure sont nécessaires pour isoler des noyaux de qualité suffisante pour les expériences unicellulaires en aval du cerveau de poissons jeunes et âgés. Ici, nous démontrons un protocole empiriquement optimisé pour l’isolement de noyaux de haute qualité du cerveau de killifish turquoise africain adulte, une étape critique dans la génération de bibliothèques de noyaux uniques de haute qualité. De plus, nous montrons que les étapes visant à réduire l’ARN de fond contaminant sont importantes pour distinguer clairement les types de cellules. En résumé, ce protocole démontre la faisabilité de l’étude du vieillissement cérébral chez des organismes modèles de vertébrés non traditionnels.

Le protocole d’isolement des noyaux cérébraux des killifish décrit ici est optimisé spécifiquement pour le killifish et est résumé à la figure 1. En plus de l’extraction des noyaux, le protocole détaille différentes méthodes d’évaluation de la qualité et de la quantité des noyaux isolés. La figure 2 montre des exemples de noyaux sains (figure 2A) et malsains (figure 2B) évalués par microscopie optique. Les noyaux sains convenant à l’analyse en aval (figure 2A) se présentent sous forme de noyaux singulet avec des membranes intactes. Comme le montre la figure 2B, le mode de défaillance le plus courant de ce protocole (et d’autres protocoles d’isolement des noyaux) est la génération de noyaux surlysés, caractérisés par des membranes nucléaires endommagées. Cela conduit souvent à l’agglutination des noyaux et peut contribuer aux signaux de fond dans les applications en aval en raison de la fuite d’acides nucléiques des noyaux rompus. Si une agglutination excessive est observée, nous recommandons d’être plus doux pendant les étapes de rebond et / ou de réduire les temps d’incubation dans le tampon de lyse.
Ce protocole utilise la cytométrie en flux pour quantifier le nombre de noyaux isolés et déterminer la proportion relative de noyaux multiplets dans un échantillon. De plus, la cytométrie en flux peut être utilisée pour évaluer la teneur relative des débris contaminants, des fragments de noyaux souvent rompus et d’autres débris cellulaires qui peuvent nuire aux essais en aval dans l’échantillon de noyaux. Des données de débit représentatives sont présentées à la figure 3. Une procédure d’isolement des noyaux de haute qualité produira: 1) une petite fraction de débris et 2) une fraction élevée de noyaux singulet par rapport aux noyaux multiplets (&gt; 80% de la fraction des noyaux). L’utilisation de la coloration PI, qui colore les acides nucléiques, permet de séparer les noyaux singulet des débris et des noyaux multiplets. La figure 3A est un exemple de préparation contaminée par des débris, tandis que la figure 3B est un exemple d’expérience de haute qualité.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig01.jpg"> Figure 1 : Flux de travail d’isolement des noyaux cérébraux de Killifish. Flux de travail expérimental pour l’isolement des noyaux à partir de cerveaux de killifish congelés ou frais. Une fois isolés et évalués, les noyaux peuvent être utilisés pour diverses analyses « omiques » en aval. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig02.jpg"> Figure 2 : Évaluation de la qualité des noyaux par microscopie. Les noyaux ont été mélangés 1:1 dans une solution de bleu de trypan à 0,4% et visualisés sur un microscope Echo Revolve par imagerie en fond clair à 60x. (A) Un exemple de noyau de haute qualité. Le noyau est présent sous forme de singulet et la membrane nucléaire est intacte. (B) Un exemple de noyaux de mauvaise qualité. Les membranes nucléaires sont endommagées et les noyaux s’agglutinent en un doublet, probablement en raison d’une fuite d’ADN collant, qui peut être vu fuir du haut du noyau le plus haut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig03.jpg"> Figure 3 : Quantification des noyaux et évaluation de la pureté par cytométrie en flux. Les échantillons de noyaux ont été colorés avec une dilution de PI de 1:100 et exécutés sur un cytomètre en flux. Les noyaux sont présents sous forme singulet et multiplet dans le quadrant supérieur droit de (A, B) avec des singulets comme nuage inférieur d’événements suivis de doublets, triplets, etc. dans l’ordre croissant. Les débris sont marqués par les événements dans les deux quadrants les plus à gauche. (A) Un exemple de préparation de noyaux de mauvaise qualité, où l’étape d’enlèvement des débris a été omise et où les débris représentent &gt;40% des événements. (B) Un exemple d’échantillon de noyaux de haute qualité, avec l’étape d’enlèvement des débris incluse. Dans cet exemple, les débris représentent &lt;10% de tous les événements enregistrés par le cytomètre en flux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Type d’échantillon (2 cerveaux)</td>
			<td>Rendement moyen (4 préparations indépendantes)</td>
		</tr><tr><td>Cerveau masculin de 5 semaines</td>
			<td>3,59 ± 1,76 x 105</td>
		</tr><tr><td>Cerveau masculin de 10 semaines</td>
			<td>6,41 ± 1,33 x 105</td>
		</tr><tr><td>Cerveau masculin de 15 semaines</td>
			<td>14,59 ± 2,05 x 105</td>
		</tr><tr><td>Cerveau féminin de 5 semaines</td>
			<td>2,54 ± 0,75 x 105</td>
		</tr><tr><td>Cerveau féminin de 10 semaines</td>
			<td>4,66 ± 1,29 x 105</td>
		</tr><tr><td>Cerveau féminin de 15 semaines</td>
			<td>7,95 ± 3,51 x 105</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Rendements moyens attendus de deux cerveaux de killifish turquoise africain selon le sexe et l’âge. Les rendements moyens exprimés en 105 noyaux ±erreur type de la moyenne sur quatre préparations de noyaux indépendants dans chaque catégorie.
Figure supplémentaire 1 : Comparaison de la qualité de l’isolement des noyaux à l’aide de protocoles standard et de notre protocole optimisé sur les cerveaux de killifish congelés. (A) Évaluation de la qualité des noyaux par microscopie. Les noyaux ont été mélangés 1:1 dans une solution de bleu de trypan à 0,4% et visualisés au microscope par imagerie en fond clair à 60x. (B) Quantification des noyaux et de la charge de débris par cytométrie en flux. Les échantillons de noyaux ont été colorés avec une dilution de PI de 1:100 et exécutés sur un cytomètre en flux. (C) Résumé des paramètres d’évaluation de la qualité par microscopie et cytométrie en flux avec les différents protocoles étalonnés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/2022-07-06_FIgure_S1_v3.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 2 : Représentation schématique des étapes d’enlèvement des débris. (A) Schéma de stratification de la précentrifugation par enlèvement des débris. (B) Schéma d’élimination du surnageant après centrifugation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/2022-07-06_Figure_S2_JOVE_Revision.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Nous présentons ici un protocole pour isoler les noyaux du cerveau du modèle de vertébrés à courte durée de vie Nothobranchius furzeri pour des applications en aval telles que le séquençage de l’ARN mononucléeau ou le test mononucléique pour la chromatine accessible par transposase avec séquençage (ATAC-seq).

Isolement en douceur des noyaux du tissu cérébral d’un poisson turquoise africain adulte, un modèle naturellement éphémère pour la recherche sur le vieillissement

Studying brain aging at single-cell resolution in vertebrate systems remains challenging due to cost, time, and technical constraints. Here, we ...

Il s’agit du premier protocole optimisé pour isoler des noyaux de haute qualité pour des expériences de séquençage de noyaux uniques utilisant des cerveaux congelés de killifish turquoise africain, un modèle vertébré émergent pour la recherche sur le vieillissement. Ce protocole isole les noyaux très doucement, ce qui le distingue des protocoles plus durs optimisés pour d’autres organismes avec des cerveaux plus myélinisés, ce qui entraîne des noyaux dégradés lorsqu’ils sont utilisés chez le killifish. Cette méthode sera essentielle pour nous aider à comprendre le vieillissement cérébral au niveau d’une seule cellule.Il devrait bien se traduire dans d’autres tissus nécessitant une isolation plus douce des noyaux. Ce protocole est convivial. La tâche la plus exigeante est la centrifugation à gradient pour l’enlèvement des débris, dans laquelle il vaut mieux être lent et précis que rapide et salissant.Ari Adler et Brian Teefy, technicien de laboratoire de recherche et chercheur postdoctoral du laboratoire Benayoun, feront la démonstration de la procédure. Après avoir disséqué le killifish, décongelez le tissu cérébral congelé sur de la glace pendant 10 minutes et faites rebondir le cerveau dans un millilitre de tampon de lyse de noyaux glacés dans un homogénéisateur de boue de deux millilitres. Pendant la lyse de l’échantillon, gardez l’homogénéisateur sur de la glace et évitez de générer des bulles.Faire rebondir le tissu comme décrit dans le manuscrit et laisser reposer l’échantillon sur de la glace dans l’homogénéisateur de rebond pendant deux minutes. Ensuite, filtrez l’échantillon à travers un filtre cellulaire de 70 micromètres dans un tube conique de 15 millilitres préenduit de BSA à 5%. Ajouter quatre millilitres de tampon de lavage de noyaux à l’échantillon en pipetant le tampon de lavage sur le filtre cellulaire de 70 micromètres et mélanger en retournant doucement le tube cinq fois.À l’aide d’un rotor à godet oscillant, centrifuger l’échantillon à 500 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant en le versant délicatement dans un récipient à déchets liquides. Conserver l’échantillon à la verticale et retirer le tampon de lavage restant à l’aide d’une pipette P1000.Remettez immédiatement les noyaux en suspension dans un millilitre de tampon de lavage des noyaux avec un embout de pipette P1000 à large alésage. Ensuite, portez l’échantillon à cinq millilitres en ajoutant quatre millilitres de tampon de lavage des noyaux et mélangez comme démontré précédemment. Enduire la cellule par centrifugation.Jeter le surnageant et remettre les noyaux en suspension dans un millilitre de tampon de lavage des noyaux avec un embout de pipette à large alésage. Maintenant, transférez les noyaux dans un tube de cytométrie de flux. Ajouter 300 microlitres de solution d’élimination des débris à la suspension cellulaire et bien mélanger en pipetant avec une pointe de large alésage jusqu’à ce que le mélange soit homogène.Tenez le tube à un léger angle et superposez doucement un millilitre de tampon de lavage des noyaux sur la solution de noyaux à l’aide d’une pipette P1000. Centrifuger l’échantillon dans un rotor à godet oscillant à 3000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez complètement les deux phases supérieures à l’aide d’une pipette P1000.Transférer la couche inférieure dans un tube conique de 15 millilitres prérecouvert de 5% de BSA. Ensuite, portez le volume à 15 millilitres avec le tampon de lavage des noyaux et mélangez en retournant le tube trois fois. Centrifuger le tube à 1000G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius dans un rotor de godet oscillant.Retirez soigneusement le surnageant et remettez immédiatement la pastille en suspension dans 150 microlitres de tampon de lavage des noyaux à l’aide d’un embout de pipette à large alésage. Passez à un embout de pipette d’alésage standard réglé sur 300 microlitres. Pipeter l’échantillon entier, puis fixer un filtre de 40 micromètres à l’extrémité de la pointe.Filtrer l’échantillon en expulsant de force l’échantillon à travers le filtre dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre à faible liaison à l’ADN. Dans un tube FACS, remettre en suspension 10 microlitres de l’échantillon de noyaux filtrés dans 90 microlitres du tampon de cytométrie en flux recommandé. Colorer les échantillons avec de l’iodure de propidium à une concentration finale d’un microgramme par millilitre.Après avoir configuré l’espace de travail comme décrit dans le manuscrit, démarrez le flux en appuyant sur l’icône de lecture dans le coin inférieur droit. Vérifiez s’il y a des bulles d’air ou des amas dans l’échantillon en utilisant la zone de diffusion latérale par rapport au HDRT. Vérifiez également le nuage de points par rapport au nuage de points vers l’avant pour vérifier que les événements s’accumulent dans les limites de la fenêtre.Pour une vue agrandie, double-cliquez sur la zone de diffusion latérale par rapport au tracé PerCP-Vio700-A. Cliquez sur le bouton dans la barre d’outils supérieure gauche avec une ligne perpendiculaire pour sélectionner une porte quadrant. Ensuite, cliquez n’importe où dans la zone de diffusion latérale par rapport au tracé PerCP-Vio700-A, et les quadrants apparaîtront à l’intérieur du graphique.Cliquez n’importe où sur les lignes de séparation du quadrant et faites glisser le curseur pour modifier l’emplacement du quadrant. Placez les quadrants de telle sorte que le quadrant supérieur gauche contienne des débris et que le quadrant supérieur droit contienne des noyaux. Cliquez sur l’icône carré, gris, I pour ouvrir la fenêtre des propriétés.Accédez à l’onglet des fonctions de la région et assurez-vous d’avoir une coche verte à côté de l’élément supérieur, indiquant que le tracé entier est sélectionné. Sous la liste des fonctions, cliquez sur le nombre par microlitre pour produire une coche verte. Cliquez sur OK et chaque quadrant affichera un nombre par métrique de microlitre.Sélectionnez le nombre et le pourcentage total dans l’onglet Fonctions de la région pour afficher les nombres bruts et les pourcentages si vous le souhaitez. Dessinez une porte polygonale autour de cette population en cliquant sur le bouton polygonal dans la barre d’outils supérieure gauche. Ensuite, cliquez une seule fois et faites glisser la souris pour dessiner un segment linéaire de la porte.Cliquez à nouveau pour terminer et commencer le suivant, suivi d’un double-clic pour terminer la porte. Cliquez sur la bordure de la porte et faites glisser la souris pour repositionner la porte. Cliquez sur les sommets de la porte pour modifier la forme, et le nombre par microlitre de la population fermée apparaîtra.Les noyaux sains qui sont apparus comme des noyaux singulet avec des membranes intactes conviennent à l’analyse en aval. Cependant, les noyaux malsains sont caractérisés par des membranes nucléaires endommagées, ce qui entraîne l’agglutination des noyaux et peut contribuer aux signaux de fond dans les applications en aval. Les noyaux sont sous forme singulet et multiplet dans le quadrant supérieur droit, avec des singulets comme nuage d’événements le plus bas, suivis de doublets et de triplets dans l’ordre croissant.Les débris sont marqués par des événements dans les deux quadrants les plus à gauche dans une préparation de noyaux de faible qualité où l’étape d’enlèvement des débris a été omise. Les débris représentent plus de 40% des événements. Cependant, dans une expérience de haute qualité, les débris représentent moins de 15% de tous les événements.Il est impératif d’enlever complètement la couche intermédiaire après l’étape de centrifugation par enlèvement des débris pour réduire les noyaux d’ARN de fond contaminants isolés à l’aide de ce protocole peuvent être utilisés pour le séquençage de l’ARN à noyau unique ou le séquençage ATAC pour obtenir des informations transcriptomiques et épigénétiques au niveau de la cellule unique. Cette technique permettra aux chercheurs d’explorer la régulation des gènes du cerveau au niveau unicellulaire chez le killifish turquoise africain, un organisme modèle de vertébrés naturellement éphébré pour la recherche sur le vieillissement.

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