Isolement du mésenchyme intestinal murin entraînant un rendement élevé en télocytes

Notre protocole d’isolement du mésenchyme intestinal se traduit par un rendement élevé en télocytes. Cette méthode offre une plate-forme initiale pour étudier l’interaction cellule-cellule impliquant les télocytes dans l’homéostasie et la maladie. Les télocytes sont des cellules uniques sensibles aux protocoles de dissociation tissulaire disponibles.

Par conséquent, le principal avantage de cette technique est l’isolement du mésenchyme, y compris les télocytes viables enrichis. Le mésenchyme, y compris le ténocyte, peut servir de source pour les molécules de signalisation et les facteurs de croissance nécessaires à une croissance organisée ex vivo. Pour commencer, lavez l’intestin, séparé d’une souris euthanasiée, dans une boîte de Petri contenant du PBS froid et stérile.

Placez l’intestin dans une boîte de Pétri. Et à l’aide de ciseaux à bout de bille, ouvrez le tube intestinal longitudinalement et lavez les matières fécales. Transférer l’intestin dans un nouveau plat contenant du PBS frais et froid.

Après avoir lavé l’intestin une fois de plus, coupez l’intestin grêle en segments d’un centimètre de long et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres rempli de huit millilitres de PBS. Secouez le tube manuellement à un ou deux cycles par seconde pendant une minute. Versez la solution dans une boîte de Pétri.

Et à l’aide de forceps, transférez le segment dans un tube conique de 50 millilitres rempli de 20 millilitres de Solution A.Placez les tubes dans un incubateur à agitateur orbital à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après l’incubation, secouez vigoureusement le tube à la main à quatre ou cinq cycles par seconde pendant une minute pour dissocier l’épithélium. Répétez cette étape une fois de plus.

Après avoir coupé et lavé les fragments comme démontré précédemment, transférez-les dans un nouveau tube de 50 millilitres rempli de 10 millilitres de PBS stérile et inversez le tube à un ou deux cycles par seconde pendant une minute. Verser la solution dans une boîte de Pétri. Transférez les segments dans un nouveau tube de 15 millilitres rempli de 10 millilitres de PBS stérile et inclinez-les doucement de haut en bas à un ou deux cycles par seconde pendant deux minutes.

Sous une enceinte de biosécurité, utilisez des pinces pour placer les segments sur une lingette de laboratoire stérile afin de les sécher. Une fois séchés, coupez les segments en morceaux. Transférer les morceaux coupés à l’aide d’une pince dans une plaque de six puits remplie de quatre millilitres de solution de digestion préchauffée par puits.

Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 50 minutes et agiter doucement la plaque manuellement toutes les 20 minutes. Ensuite, transférez les morceaux à l’aide d’une pipette Pasteur dans un tube conique de 15 millilitres rempli de quatre millilitres de DMEM. Secouez le tube manuellement à quatre ou cinq cycles par seconde pendant une minute pour obtenir une suspension à une seule cellule.

Filtrez la suspension à travers une crépine de 100 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifuger le filtrat à 700 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant par aspiration et remettre en suspension la pastille de cellule dans cinq millilitres de FBS / PBS à 2%.

Après avoir centrifugé la suspension une fois de plus à 700 g pendant cinq minutes, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 12 millilitres de milieu de culture. Enfin, ensemencez la suspension cellulaire dans des plaques à six puits. Après la dissociation des mésenchymes, les télocytes perdent leurs caractéristiques cellulaires, montrant une morphologie cellulaire ronde, et réfléchissent moins de cellules GFP-positives le premier jour par rapport aux jours suivants.

Quelques jours plus tard, les télocytes présentent une petite morphologie cellulaire étirée avec des processus cellulaires courts. Après sept à 10 jours d’ensemencement, les télocytes retrouvent leurs caractéristiques cellulaires, montrant une morphologie cellulaire grande et étirée avec de longs processus cytoplasmiques. La cytométrie en flux révèle la composition cellulaire.

Dans l’ensemble, 69% des cellules isolées étaient viables sur la base de la coloration DAPI. Et parmi ceux-ci, 60,9% représentaient la contamination épithéliale et les cellules immunitaires et endothéliales. La fraction ténoticytaire dispersée au-dessus de 100k et 70k FSC et SSC, respectivement, et représentait près de 10% du mésenchyme fermé.

L’analyse FACS a révélé que le sous-ensemble des télocytes peut être défini par une coloration positive à CD201 et GP38. L’immunomarquage de mésenchymes cultivés d’un jour à l’aide de ces marqueurs a montré l’expression de ces marqueurs moléculaires, bien que les cellules ne présentent pas leurs caractéristiques cellulaires. Cette procédure aboutit à une suspension unicellulaire viable de cellules stromales, qui peut être utilisée non seulement pour la culture 2D, mais pour toute autre application, telle que la co-culture 3D avec organoïdes ou la bio-impression.