Microdissection laser industrialisée guidée par l’intelligence artificielle pour l’analyse protéomique à micro-échelle du microenvironnement tumoral

Ce protocole intègre l’analyse d’images basée sur l’IA pour la segmentation des tissus. Avec l’histologie, la récolte sélective par microdissection laser nous rapproche de la réalité de la pathomique. Prédéfinir le retour sur investissement des tissus à l’aide de l’IA, limiter le temps de séjour des lames de tissu à température ambiante, réduire l’effort de main-d’œuvre pour effectuer ces récoltes et diminuer la variabilité de l’opérateur.

Cette technique est largement applicable à toute recherche basée sur la maladie ou la pathologie impliquant la collecte ou l’enrichissement de populations cellulaires spécifiques à partir d’échantillons de tissus. Cette méthode est simple pour les utilisateurs ayant des connaissances de base en histopathologie et une expérience de la LMD. La clé est de vous assurer de couper l’étalonneur propre pour les cellules et de bien entraîner le classificateur.

Pour commencer, assurez-vous que la lame est complètement sèche avant de couper les fiducials d’étalonnage de référence. Ouvrez le logiciel Laser Microdissection et ouvrez le fichier sld de points d’étalonnage par défaut sous l’option Importer des formes. Chargez la glissière avec le tissu tourné vers le bas et le côté de l’étiquette plus près de l’opérateur.

Dans le support de diapositive de l’étage de microdissection laser, sélectionnez l’option de mise au point automatique avant découpe. À l’aide du microscope laser et du fichier sld de points d’étalonnage par défaut, découpez les fiducials d’étalonnage dans la membrane PEN. Pour les collections enrichies en microdissection laser uniquement, ouvrez le logiciel d’analyse d’images.

Sélectionnez les images ouvertes et, dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez le fichier image point svs généré par l’analyse de la diapositive. Accédez à l’onglet Annotations, sélectionnez et utilisez l’outil d’annotation rectangulaire pour dessiner une zone autour du tissu. Sélectionnez l’annotation de la boîte et faites un clic droit sur l’image.

Sélectionnez le menu déroulant avancé, puis cliquez sur l’option de partitionnement. Définissez la taille et l’espace de la vignette entre 500 et 40 respectivement, puis sélectionnez OK pour générer les vignettes. Sélectionnez et supprimez l’annotation de zone de périmètre utilisée pour générer les vignettes.

Sélectionnez le menu déroulant Actions de calque, puis cliquez sur Exporter pour enregistrer les annotations en mosaïque en tant que fichier d’annotation de points. Placez une copie enregistrée de l’algorithme Python dapa, développé pour fusionner les couches d’annotation classées AI dans le même dossier que le fichier d’annotations en mosaïque. Copiez le nom du fichier d’annotation en mosaïque.

Ouvrez le programme Python à l’aide de l’environnement de développement intégré inactif et collez le nom du fichier d’annotation en mosaïque entre les guillemets au bas du programme. Sélectionnez le menu déroulant d’exécution, puis cliquez sur Exécuter le module. Attendez qu’un fichier soit généré qui aura toutes les annotations en mosaïque fusionnées sous un seul calque.

Ouvrez le logiciel d’analyse d’images et accédez à l’onglet Annotations. Sélectionnez le menu déroulant Actions de calque, puis cliquez sur Supprimer tous les calques pour supprimer toutes les annotations de l’image. Sélectionnez le menu déroulant Actions de calque, puis cliquez sur Importer un fichier d’annotation local.

Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez le fichier d’annotation de points fusionné généré par le script. Assurez-vous que toutes les vignettes importées se trouvent sous le même calque d’annotation. À partir de l’onglet classificateur, suivez les instructions du fabricant pour mettre en évidence les zones représentatives des zones représentatives de la tumeur, du stroma et des retours d’ordre d’arrière-plan de diapositive en verre vierge.

Avant d’exécuter le classificateur, cliquez sur Options avancées du classificateur, sélectionnez le calque d’annotation souhaité en cochant la case ROI ou les cases de l’onglet Annotations. Utilisez l’option de calque d’annotation du menu Actions du classificateur pour exécuter le classificateur. Une fois l’analyse du classificateur terminée, accédez à l’onglet Annotations et sélectionnez la couche d’annotation générée à partir de l’analyse.

Sélectionnez le menu déroulant Actions de calque, puis cliquez sur Supprimer tous les calques mais actuels pour supprimer tous les autres calques d’annotation de l’image. Ensuite, sélectionnez le menu déroulant Actions de calque, puis cliquez sur Exporter pour enregistrer les annotations en tant que fichier d’annotation de points. Créez un dossier pour la session ou le projet et enregistrez le fichier d’annotation de points dans un sous-dossier.

Étiqueté avec l’identificateur unique de la diapositive. Accédez à l’onglet Annotations, sélectionnez la liste déroulante Actions de calque, puis cliquez sur Supprimer tous les calques pour supprimer toutes les annotations de l’image. Sélectionnez l’outil plume et tracez une courte ligne à partir de chaque fiducial d’étalonnage.

Tracez des lignes à partir des marques dans l’ordre suivant. En haut à gauche, en haut à droite, en bas à droite. Sélectionnez le menu déroulant Actions de calque, puis cliquez sur Exporter pour enregistrer les annotations en mosaïque en tant que fichier d’annotation do.

Ajoutez un calib de soulignement au nom de fichier et placez le fichier dans le sous-dossier qui contient les coordonnées des formes en mosaïque. Copiez l’adresse du projet principal. Ouvrez le malliateur de script de génération d’importation XML à l’aide de l’environnement de développement intégré inactif, puis collez l’adresse du dossier du projet entre les guillemets au bas du script.

Sélectionnez le menu déroulant Exécuter, puis cliquez sur Exécuter le module pour exécuter le script. Chargez la lame de membrane marquée avec le tissu tourné vers le bas et le côté de l’étiquette plus près de l’opérateur dans le support de lame sur l’étage du microscope laser. Sélectionnez Importer des formes dans le menu déroulant Fichier.

Sélectionnez le fichier d’importation XML et LMD généré pour la diapositive. Sélectionnez non dans la fenêtre contextuelle pour éviter de charger des points de référence à partir d’un fichier, et non dans la deuxième fenêtre contextuelle pour éviter d’utiliser des points de référence précédemment stockés pour l’étalonnage. Suivez les instructions de l’application de micro-dissection laser et alignez la croix d’étalonnage sur chacune des trois fiduciales d’étalonnage sur la diapositive.

Recherchez les fiducials d’étalonnage qui apparaissent en haut à gauche, en haut à droite et en bas à droite de l’image de la diapositive. Dans le logiciel d’analyse d’images qui correspondra aux points de référence de la lame de microdissection laser inversée sur l’étage du microscope. Basculez entre l’utilisation de la lentille subjective 5x pour localiser et la lentille subjective 63x pour aligner chaque fiducial d’étalonnage.

Sélectionnez non dans la fenêtre contextuelle pour éviter d’enregistrer les points de référence dans un fichier, et ok dans la deuxième fenêtre contextuelle pour confirmer que la diapositive est insérée. Déplacez l’objectif subjectif 5x en position et sélectionnez oui dans la fenêtre contextuelle pour utiliser le grossissement réel. Une fois que les formes importées apparaissent, concentrez l’appareil photo sur le tissu.

Mettez en surbrillance et sélectionnez toutes les formes dans la fenêtre de liste des formes. Faites-les glisser en place à l’aide d’une ou deux annotations dans le champ de vision comme références et alignez l’axe Z vertical pour la découpe avec le laser. Chargez les tubes dans un support de tube universel conçu pour les microtubes PCT.

Examinez les formes importées et affectez-les à la position de tube appropriée pour la collecte. Appuyez sur Démarrer la découpe pour démarrer le laser. Déchargez et fermez le tube d’échantillonnage avec des tissus LMD et mettez-le sur de la glace carbonique.

Après thermocyclage et centrifugation, le LMD a prélevé des échantillons de tissus, retiré et jeté les microcaps des microtubes PCT. Ajouter la trypsine, ajouter un rapport d’un microgramme par tissu carré de 30 millimètres. Et insérez un micro pilon dans le micro tube à l’aide de l’outil microcap.

Transférez les microtubes dans une cartouche de cycle de barillet et assemblez la cartouche complète. Placez la cartouche dans la chambre de pression du cycle du canon et fixez le couvercle. Cycle du baril à 45 000 PSI pendant 50 secondes et pression atmosphérique à 10 secondes à 50 degrés Celsius pendant 60 cycles.

Pour l’analyse LC-MS MS, chargez les flacons d’échantillonneur automatique dans les positions appropriées dans l’échantillonneur automatique de chromatographie liquide. Fermez l’échantillonneur automatique et analysez les fractions individuelles avec une méthode de spectrométrie de gradient et de masse appropriée. Regroupement hiérarchique non supervisé utilisant les 100 protéines les plus variables.

Il en a résulté la ségrégation des types histo de cancer de l’ovaire séreux de haut grade et de carcinome à cellules claires de l’ovaire à partir d’échantillons de tumeurs entières enrichies par microdissection laser. En revanche, la microdissection laser a enrichi des échantillons de stroma provenant à la fois d’un cancer de l’ovaire séreux de haut grade et d’un carcinome à cellules claires de l’ovaire. Regroupés ensemble et indépendamment de la microdissection laser enrichie des échantillons de tumeurs et de tumeurs entières.

Parmi les 5 971 protéines quantifiées, 215 ont été significativement modifiées entre des collections entières de tumeurs provenant d’un cancer de l’ovaire séreux de haut grade et des échantillons de carcinome à cellules claires de l’ovaire. Sur les 76 protéines de signature quantifiées par Hughes, 57 ont été co-quantifiées dans cet ensemble de données et étaient fortement corrélées L’entraînement du classificateur est la partie la plus difficile. En suivant les instructions du logiciel Indica Lab et en affinant le classificateur, les résultats ont été reproduits les plus précis.

Tout le reste est standardisé. Les tissus prélevés à l’aide de ce flux de travail LMD piloté par l’IA sont compatibles avec une variété d’applications analytiques en aval, y compris la protéomique basée sur la spectrométrie de masse décrite ici ou les analyses génomiques, transcriptomiques ou autres analyses omiques.