Name: Méthodes in ovo et ex ovo pour étudier le développement de l’oreille interne aviaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Découvrez les méthodes in ovo et ex ovo pour étudier le développement de l'oreille interne aviaire chez l'embryon de poulet. Ces protocoles permettent d'explorer les mécanismes moléculaires de régénération des cellules ciliées et d'évaluer les effets ototoxiques des médicaments.

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Nous remercions le NCBS, le TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB et le Royal National Institute for the Deaf. Nous tenons à remercier l’Organisation centrale de développement de la volaille et l’Institut de formation, Hesaraghatta, Bangalore. Nous sommes reconnaissants envers le CIFF et le soutien des installations et des laboratoires de la SEMU au NCBS. Nous remercions Yoshiko Takahashi et Koichi Kawakami pour les constructions Tol2-eGFP et T2TP, et Guy Richardson pour les anticorps HCA et G19 Pcdh15. Nous sommes reconnaissants envers les membres d’Earlab pour leur soutien constant et leurs précieux commentaires sur le protocole.

Les protocoles impliquant l’achat, la culture et l’utilisation d’œufs de poule fécondés et d’embryons non éclos ont été approuvés par le Comité institutionnel d’éthique animale du Centre national des sciences biologiques, Bengaluru, Karnataka.
1. Électroporation in ovo de précurseurs auditifs de poussins
<ol><li>Conception et clonage de sgRNA pour l’élimination du gène CRISPR/Cas9<ol><li>Pour créer des knockouts de gènes, la conception guide les ARN pour perturber les régions exon du gène, de préférence plus près de l’extrémité 5' de la région codante.</li>
		<li>Sélectionnez les ARN guides potentiels à l’aide d’un outil web CRISPOR23. Réglez les données du navigateur sur Gallus gallus et la séquence de motifs adjacents protospacer (PAM) sur 5'- NGG -3'. Le programme détermine les ARN guides à partir de la séquence d’entrée et attribue différents scores en fonction de l’activité sur cible et hors cible. Sélectionnez les quatre meilleurs guides pour d’autres études.</li>
		<li>Pour la conception d’oligos spécifiques au modèle pour la production guide d’ARN (g), supprimez la séquence PAM (5′- NGG -3′) de la sortie de l’outil de conception de l’ARNg. Il n’est pas nécessaire pour le ciblage, mais contient la séquence de reconnaissance de clivage Cas9. Synthétiser deux oligos complémentaires purifiés par HPLC avec un site de restriction BsmBI aux deux extrémités, pour chaque ARNg potentiel.</li>
		<li>Cloner la séquence guide dans le cadre avec un échafaudage tracrRNA d’un vecteur de choix (ici, pcU6_1sgRNA vecteur a été utilisé24).</li>
		<li>Dissoudre les oligonucléotides sgRNA à une concentration de 100 μM dans de l’eau exempte de DNase/RNase. Recuit des deux oligoguidages sens et antisens à l’aide d’un thermocycleur avec les paramètres suivants: 95 °C pendant 3 min, puis 37 °C pendant 15 min, puis diminuer à 4 °C.</li>
		<li>À l’aide des techniques standard de biologie moléculaire décrites aupoint 25, configurer la digestion de restriction des oligos recuits et du vecteur de clonage pcU6_1sgRNA avec l’enzyme BsmBI pendant la nuit. Configurez la ligature avec le vecteur pcU6_1sgRNA digéré par BsmBI linéaire purifié au gel et les oligos d’ARNg digérés. Transformez-la en une cellule compétente DH5-alpha et la séquence confirme le clone obtenu.</li>
	</ol></li>
	<li>Manipulation des œufs et fenêtrage<ol><li>Procurez-vous des œufs fraîchement pondus et nettoyez-les en les essuyant avec de l’éthanol à 70% pour éviter toute contamination. Incuber à 37-38 °C, avec 45% d’humidité pendant 3,5-4 jours.</li>
		<li>Après l’incubation, placez l’œuf sur le côté pendant au moins 5 minutes avant de l’ouvrir. Cela permet à l’embryon de se repositionner au sommet du jaune. Utilisez des pinces pour faire de petits trous au sommet et à l’extrémité émoussée de l’œuf de sorte qu’une aiguille 21G puisse passer à travers.</li>
		<li>Pour éviter les dommages pendant le fenêtrage, retirez l’albumine pour abaisser l’embryon loin de la coquille. Pour ce faire, utilisez une seringue de 5 mL et une aiguille de 21 G pour prélever soigneusement 2 mL d’albumine dans un trou situé à l’extrémité émoussée de l’œuf. Utilisez du ruban adhésif transparent pour couvrir le trou à l’extrémité émoussée.</li>
		<li>Pour créer la fenêtre de l’œuf, fixez du ruban adhésif transparent sur le dessus de la coquille d’œuf. Coupez une fenêtre d’environ 2 cm de long et 1,5 cm de large à l’aide de ciseaux à arc à ressort et exposez l’embryon. Utilisez des pinces pour ouvrir les membranes chorioniques recouvrant l’embryon, permettant ainsi l’accès à l’embryon.</li>
	</ol></li>
	<li>Microinjection de plasmides<ol><li>Pour l’expérience d’élimination génique, préparez deux solutions: le mélange knock-down contenant la protéine SpCas9 et le plasmide guide - pcU6_1sgRNA, et le mélange plasmidique traceur de T2K-eGFP (il s’agit d’un promoteur de la ß-actine de poussin entraînant une cassette GFP entourée par les sites de transposons de Tol2) avec la T2TP (la transposase Tol2 clonée dans Tol2 construit26,27). Le traceur est utilisé pour suivre l’efficacité de l’électroporation.</li>
		<li>Lors de l’électroporation de plusieurs plasmides, s’assurer que la concentration finale d’ADN est d’au moins 4 μg/μL. Mélanger les trois constructions, guider le plasmide - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP et T2TP, dans un rapport de 1:1:1 avec 1 μg de protéine SpCas9, 30% de saccharose et 0,1% de colorant vert rapide dans un volume final de 10 μL.</li>
		<li>Tirez des aiguilles pour microinjection à partir de capillaires en verre standard (longueur 3 po, OD 1,0 mm) à l’aide d’un extracteur de pipette vertical. Utilisez une pince fine pour briser l’extrémité capillaire après avoir tiré pour obtenir un diamètre d’extrémité d’environ 50 μm avec une extrémité effilée.</li>
		<li>Posez les embryons à E3.5 sur leur côté gauche avec la tête tournée vers la droite. De cette façon, seule la vésicule otique droite est accessible pour la micro-injection. Micro-injectez le mélange knock-down dans la vésicule otique. Injecter environ 200 nL de mélange de solution d’ADN pour remplir la vésicule otique.</li>
		<li>Déterminer l’efficacité du guide à l’aide d’un dosage de l’endonucléase T728.</li>
	</ol></li>
	<li>Électroporation<ol><li>Ajouter quelques gouttes de solution saline à 0,719% sur l’embryon avant l’électroporation pour réduire la résistance électrique et éviter la surchauffe de l’embryon.</li>
		<li>Placez l’électrode positive à travers le trou fait du côté émoussé de l’œuf lorsque l’albumine a été retirée. Manœuvrez l’électrode de manière à ce qu’elle soit sous le jaune. Placez l’électrode négative sur l’otocyste rempli.</li>
		<li>Utilisez l’électroporation pour transfecter les plasmides dans les cellules de l’embryon. Utilisez un générateur d’impulsions carré et appliquez cinq impulsions d’une durée de 25 V et 100 ms chacune, espacées de 50 ms. Déterminer les conditions empiriquement en fonction d’une configuration d’électroporation individuelle.</li>
		<li>Hydrater l’embryon après électroporation en ajoutant quelques gouttes de solution saline à 0,719%. Pour nettoyer l’albumine dénaturée de la surface des électrodes, rincez-la soigneusement à l’eau distillée. Refermez l’œuf avec du ruban adhésif transparent et retournez dans l’incubateur humidifié à 37-38 °C pour une incubation ultérieure. REMARQUE: Les embryons peuvent être cultivés jusqu’à l’éclosion après l’électroporation, mais il y a une forte réduction de la viabilité.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Dissection de la papille basilaire
<ol><li>Utilisez de l’éthanol à 70% pour désinfecter la table chirurgicale, la platine du microscope et la zone environnante. La chaleur ou l’alcool stérilisent l’équipement de microdissection qui comprend des ciseaux à ressort minimal, une micro-curette et deux paires de pinces fines.</li>
	<li>Préparez les plaques de dissection suivantes: une boîte de Petri en verre avec une base en silicium noir, une boîte de Petri en plastique de 90 mm et une boîte de Petri de 60 mm. Refroidir soit une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) pour les dissections.</li>
	<li>Casser doucement l’œuf dans la boîte de Petri de 90 mm. Identifiez l’oreille externe du poussin. Décapitater l’embryon en coupant le cou juste en dessous du niveau de la mâchoire inférieure à l’aide de ciseaux. Transférer la tête dans une boîte de Petri de 60 mm remplie de PBS glacé.</li>
	<li>Orientez l’embryon avec le haut du bec tourné vers l’expérimentateur et tenez le bec à l’aide de l’une des pinces #5. Retirez les yeux à l’aide de la deuxième pince #5. En passant de rostral à caudale, coupez le crâne le long de sa ligne médiane. Retirez le cerveau.</li>
	<li>Ajoutez plus de PBS ou HBSS glacé et localisez les deux structures brillantes, près du niveau du pavillon de l’oreille. Ce sont les otolithes de la lagène à l’extrémité du canal cochléaire et se trouvent près de la ligne médiane.</li>
	<li>Couper grossièrement entre les deux lagenas, et bien au-dessus et au-dessous de cette région pour isoler deux oreilles internes. Sous un éclairage oblique, visualisez le contour de l’oreille interne. Retirez les tissus étrangers et le vestibule.</li>
	<li>Transférer la cochlée isolée sur une plaque de base en silicone noir avec du PBS glacé. À l’aide d’une pince #5, retirez la capsule cochléaire cartilagineuse pour obtenir le canal cochléaire. Localisez la couche ondulée (tegmentum) du canal cochléaire et retirez-la à l’aide de la pince #55 pour exposer la PA. À l’aide de la pince #55, retirez la membrane tectoriale pour exposer les HC et les SC.</li>
</ol>3. Culture d’explants de papilles basilaires
<ol><li>Culture membranaire de la PA<ol><li>Prenez une plaque de culture tissulaire à six puits et disposez un insert de membrane de culture par puits.</li>
		<li>Recueillir la papille basilaire disséquée (explanter) dans une pipette de 200 μL avec 1x tampon HBSS et la transférer sur une membrane. Pour éviter que le tissu ne colle à la paroi de la pipette, aspirez un peu de média avant d’aspirer le tissu.</li>
		<li>Orientez l’explant de manière à ce que la papille basilaire soit orientée vers le haut, de sorte que les cheveux et les cellules de soutien soient visibles depuis les29 premiers. Une fois l’explant positionné, aspirer lentement le tampon HBSS de la surface de la membrane de culture. Dans ce processus, l’explant se fixera à la membrane de culture.</li>
		<li>Ajouter 1,2 mL de milieu de culture Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco entre l’insert membranaire et la paroi du puits pour remplir les puits de la plaque à six puits. Jusqu’à six explants peuvent être cultivés sur une seule membrane de culture de 30 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Culture de collagène du canal cochléaire<ol><li>Préparer le mélange de collagène en ajoutant 400 μL de collagène de queue de rat à 3 mg/mL, 50 μL de DMEM 10x, 30 μL de NaHCO3 à 7,5 % et 5 μL de HEPES dans une hotte de culture tissulaire.</li>
		<li>Prenez une assiette à quatre puits et ajoutez trois gouttes de mélange de collagène dans chaque puits. Transférer le canal cochléaire disséqué à chaque goutte de collagène. Incuber la plaque pendant 10 min à 37 °C, 5% de CO2 pour durcir la matrice de collagène.</li>
	</ol></li>
	<li>Traitement des cultures à petites molécules<ol><li>Préparer les milieux de culture (DMEM, supplément de N-2, pénicilline) avec le modulateur pharmacologique ou son solvant seul (à utiliser comme témoin). Remplacer le milieu de culture par 700 μL de milieu complété par l’inhibiteur. Culture des explants dans un incubateur à 37 °C, 5% CO2.</li>
		<li>Remplacer 50% des milieux de culture chaque jour. Après un temps d’incubation approprié, retirer les milieux de culture et utiliser les explants pour les dosages en aval.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Imagerie et analyse
<ol><li>Analyse immunofluorescente<ol><li>Retirer les milieux de culture des puits et laver les explants deux fois avec 1x HBSS. À l’aide d’une pipette, ajouter 1 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans le puits et incuber pendant 20 minutes à température ambiante.</li>
		<li>Retirez le PFA et lavez les explants trois fois avec 1x PBS à température ambiante. Pour recueillir les explants de la membrane de culture, faites une petite incision autour de la membrane contenant le morceau de tissu à l’aide de petits ciseaux à ressort et transférez le tissu avec la membrane dans une plaque de culture à 48 puits à l’aide d’une pince. REMARQUE: Si les tissus flottent après la fixation, aspirez avec une pipette de 200 μL et transférez-les dans des plaques à 48 puits pour un traitement ultérieur. Évitez le détachement forcé du tissu de la membrane.</li>
		<li>Pour la culture de gouttelettes de collagène, utilisez des pinces pour transférer toute la goutte de collagène sur une plaque de silicium. Ajouter 200 μL de 1x PBS et enlever le collagène à l’aide d’une pince, puis transférer le tissu dans une plaque de culture de 48 puits.</li>
		<li>Perméabiliser les explants avec 1 mL de 1x PBS supplémenté à 0,3% de Tween-20 (PBST) pendant 30 min à température ambiante. Incuber les explants avec 200 μL de tampon bloquant (10% sérum de chèvre + 1% albumine sérique bovine dans PBST) pendant 1 h à température ambiante.</li>
		<li>Incuber les explants avec 200 μL de solution d’anticorps primaires (1:300, dans un tampon de blocage) pendant une nuit à 4 °C. Retirer la solution d’anticorps primaires et laver soigneusement les explants 5 x 20 min avec PBST.</li>
		<li>Incuber les explants avec 200 μL de phalloïdine et une solution d’anticorps secondaire (dans un tampon de blocage) pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité. Retirer la phalloïdine et la solution d’anticorps secondaires et laver soigneusement les explants 5 x 20 min avec PBST. REMARQUE : La concentration d’anticorps secondaires et la durée de lavage doivent être déterminées pour chaque application d’imagerie. Pour l’imagerie utilisant la microscopie à super résolution, nous augmentons généralement la concentration de l’anticorps secondaire de 1:500 à 1:200 et augmentons la concentration de phalloïdine de 1:400 à 1:200.</li>
		<li>Incuber les explants avec une solution de DAPI (1:1000 dans PBST) pendant 15 min à température ambiante. Retirer la solution DAPI et laver les explants 3 x 5 min avec du PBST.</li>
		<li>Utilisez le support de montage pour monter les explants sur une glissière avec BP orienté vers le haut (contre la lamelle de couverture). Pour l’imagerie confocale, utilisez un support de montage antidécoloration. Laissez le support de montage sécher pendant la nuit à température ambiante dans l’obscurité. Imagez directement ou stockez les diapositives à 4 °C jusqu’à l’imagerie.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixation OTOTO pour l’analyse SEM<ol><li>Préparez toutes les solutions fraîches et manipulez-les conformément aux directives de sécurité locales. Fixer les explants cultivés sur membrane (à partir de l’étape 4.1.4) dans du glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,3) avec 3 mM de CaCl2. Effectuer la fixation à 4 °C pendant 24 à 72 h avec un changement de fixateur toutes les 24 h.</li>
		<li>Retirer le fixateur et laver le mouchoir avec du cacodylate de sodium 0,1 M 3 x 5 min à température ambiante. Correction secondaire avec 1% OsO 4 (dilué à partir d’un stock d’OsO 4 à4% à l’aide d’un tampon cacodylate de sodium 0,1 M) pendant 1 h à température ambiante. Effectuez cette étape et les suivantes jusqu’à déshydratation dans une hotte.</li>
		<li>Rincer à l’aide d’un tampon cacodylate de sodium 0,1 M 3 x 5 min à température ambiante. Puis rincer à l’eau bidistillée ou ultrapure 3 x 5 min à température ambiante.</li>
		<li>Préparer une solution à 0,5% de thiocarbohydrazide (TCH) dans de l’eau ultrapure. Remuer à 75 °C pendant 10 min et filtrer la solution lorsqu’elle a refroidi à température ambiante. REMARQUE: TCH est extrêmement dangereux. L’utilisation doit être approuvée par le comité de sécurité local et des précautions doivent être prises lors de la manipulation.</li>
		<li>Retirer de l’eau ultrapure de l’échantillon et ajouter 0,5% TCH goutte à goutte. Si la solution brunit, arrêtez et rincez l’échantillon à l’eau ultrapure, avant d’ajouter soigneusement la solution de TCH à 0,5%. Une fois que la solution est claire, remplacez-la par 0,5% TCH. Incuber à température ambiante pendant 20 min30,31.</li>
		<li>Rincer l’échantillon à l’eau ultrapure 3 x 5 min à température ambiante. Répétez les étapes 4.2.2, 4.2.3 et 4.2.5 deux fois de plus en terminant par l’incubation d’OsO4 suivie d’un rinçage.</li>
		<li>Déshydrater les échantillons d’une série d’éthanol à 100% éthanol anhydre (EtOH). Incuber d’abord dans 25% ETOH pendant 10 min, puis 50% ETOH pendant 10 min, 75% EtOH pendant 10 min, 95% ETOH pendant 10 min, avant d’incuber pour un total de 3x pendant 10 min chacun dans 100% ETOH.</li>
		<li>Effectuer le séchage au point critique à l’aide de CO2 liquide. Montez immédiatement les échantillons sur un stub SEM avec du ruban adhésif carbone double face. Procéder à la pulvérisation pour fournir 5-10 nm de revêtement. Si ce n’est pas l’imagerie immédiate, conservez les échantillons dans un dessiccateur sous vide.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à divulguer.

Le poussin est un ajout rentable et pratique aux organismes modèles qu’un laboratoire peut utiliser pour faire des recherches sur l’oreille interne. Les méthodes décrites ici sont couramment utilisées dans notre laboratoire et complètent les recherches en cours dans l’oreille interne des mammifères. L’électroporation in ovo est utilisée pour introduire des manipulations génétiques dans le génome du poussin. L’électroporation peut également être utilisée pour introduire des constructions qui codent pour des proté...

L’oreille interne de tous les vertébrés est dérivée d’un épithélium simple connu sous le nom de placode otique 1,2. Cela donnera naissance à tous les éléments structurels et aux types de cellules nécessaires pour transduire les informations mécanosensorielles associées à la perception de l’audition et de l’équilibre. Les cellules ciliées (HC), le capteur cilié de l’oreille interne, sont entourées de cellules de soutien (SC). Les HC transmettent l’information au cerveau postérieur auditif par l’intermédiaire des neurones du huitième nerf crânien. Ceux-ci sont également générés à partir du placode otique3. La transduction primaire du son est réalisée à la surface apicale du HC auditif, à travers un faisceau pileux mécaniquement sensible4. Ceci est médié par des protubérances modifiées à base d’actine appelées stéréocils, qui sont disposées dans un modèle d’escalier gradué5. De plus, un cil primaire modifié, appelé kinocilium, organise la formation de faisceaux de cheveux et est adjacent à la plus haute rangée de stéréocils 6,7,8. L’architecture des stéréocils est essentielle pour ce rôle dans la conversion des stimuli mécaniques dérivés de l’énergie acoustique en signaux neuronaux électriques9. Les dommages causés au HC auditif par le vieillissement, une infection, un traumatisme otoacoustique ou un choc ototoxique peuvent entraîner une perte auditive partielle ou complète qui, chez les mammifères, est irréversible10.
Des thérapies de remplacement cellulaire ont été proposées qui pourraient réparer ces dommages11,12. L’approche de cette recherche a été de comprendre le développement normal de la cellule ciliée des mammifères et de se demander si les programmes de développement peuvent être réinitiés dans les cellules de type progéniteur qui peuvent exister dans l’oreille interne13. Une deuxième approche a consisté à regarder en dehors des mammifères, vers les vertébrés non mammifères chez lesquels une régénération robuste des cellules ciliées auditives a lieu, comme les oiseaux14,15. Chez les oiseaux, la régénération des cellules ciliées se produit principalement par la dédifférenciation d’une cellule de soutien à un état de progéniteur, suivie d’une division mitotique asymétrique pour générer une cellule ciliée et une cellule de soutien16. De plus, une différenciation directe d’une cellule de soutien pour générer une cellule ciliée a également été observée17.
Bien que les mécanismes du développement auditif aviaire présentent des similitudes significatives avec celui des mammifères, il existe des différences18. La différenciation HC et SC chez le poussin BP est apparente dès le jour embryonnaire (E) 7, devenant plus nette au fil du temps. Par E12, une papille basilaire (BP) bien structurée et bien polarisée peut être visualisée, et par E17, des cellules ciliées bien développées peuvent être vues19. Ces points temporels fournissent des fenêtres sur les mécanismes de différenciation, de modelage et de polarité, ainsi que sur la maturation des cellules ciliées. Il est important de comprendre si de tels mécanismes sont conservés ou divergents, car ils permettent de mieux comprendre l’homologie profonde des origines des cellules ciliées mécanosensorielles.
Ici, nous démontrons un éventail de techniques effectuées aux stades embryonnaires précoces et tardifs pour étudier les processus cellulaires tels que la prolifération, la spécification du destin, la différenciation, la structuration et le maintien tout au long du développement de l’organe de l’oreille interne. Cela complète d’autres protocoles sur la compréhension du développement de l’oreille interne dans la culture explant20,21,22. Nous discutons d’abord de l’introduction d’ADN ou d’ARN exogène dans les précurseurs de la PA dans l’otocyste E3.5 en utilisant l’électroporation in ovo. Bien que les manipulations génétiques puissent fournir des informations précieuses, les phénotypes ainsi générés peuvent être pléiotropes et par conséquent confondants. Cela est particulièrement vrai au cours du développement ultérieur de l’oreille interne, où des processus fondamentaux tels que le remodelage cytosquelettique jouent de multiples rôles dans la division cellulaire, la morphogenèse tissulaire et la spécialisation cellulaire. Nous présentons des protocoles d’inhibition pharmacologique dans les explants cultivés, qui offrent des avantages dans le contrôle de la posologie et du moment et de la durée du traitement, offrant une manipulation spatio-temporelle précise des mécanismes de développement.
Différentes méthodes de culture d’organes peuvent être utilisées en fonction de la durée du traitement des petits inhibiteurs. Nous démontrons ici deux méthodes de culture d’organes qui permettent de mieux comprendre la morphogenèse épithéliale et la spécialisation cellulaire. Une méthode de culture 3D utilisant le collagène comme matrice pour cultiver le canal cochléaire permet une culture robuste et une visualisation en direct de la PA en développement. Pour comprendre la formation des stéréocils, nous présentons une méthode de culture membranaire telle que le tissu épithélial est cultivé sur une matrice rigide permettant aux protubérances d’actine de se développer librement. Les deux méthodes permettent un traitement en aval tel que l’imagerie de cellules vivantes, l’immunohistochimie, la microscopie électronique à balayage (MEB), l’enregistrement cellulaire, etc. Ces techniques fournissent une feuille de route pour l’utilisation efficace du poussin comme système modèle pour comprendre et manipuler le développement, la maturation et la régénération de l’épithélium auditif aviaire.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3</td><td>Technologies d’ADN intégrées</td><td>1081061</td><td>Haute fidélité Protéine Cas9</td></tr><tr><td>Anticorps anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td>Sérum de bovin polyclonal de lapin</td></tr><tr><td> Albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q12135</td><td></td></tr><tr><td>Collagène I, queue de rat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Sécheur à point critique Leica EM CPD300</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CUY-21 Électroporateur</td><td>Népagène</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DM5000B Microscope à grand champ</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, haute teneur en glucose, supplément GlutaMAX, pyruvate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>FLUOVIEW 3000 Microscope à balayage laser</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde (25 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps IgG Secondaire Anti-Souris IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre Anti-Souris IgG Secondaire Anticorps, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11032</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire IgG anti-lapin de chèvre, Alexa Fluor 488 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre Stérile filtré</td><td>HiMedia</td><td>RM10701</td><td>Heat inactivated</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>LSM980 Airyscan Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell Cell Cell Cell Culture Insert, 30 mm, PTFE hydrophile, 0,4 & micro ; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>MVX10 Stéréomicroscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MYO7A Anticorps</td><td>DSHB</td><td>138-1</td><td>Souris monoclonale à myosine-VIIa non conventionnelle</td></tr><tr><td>MZ16 Microscope de dissection</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Noyes Ciseaux, 14cm (5.5' ')</td><td>World Precision Instruments</td><td>501237</td><td></td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium (4 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PC-10 Extracteur</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pcU6_1sgRNA</td><td>Addgene</td><td>92395</td><td>Mini vecteur avec promoteur U6 de poulet modifié</td></tr><tr><td>Pénicilline G sel</td> <td>de sodiumSigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>SMZ1500 Microscope à dissection</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon cacodylate de sodium, 0,2M</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chlorure</td><td>HiMedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>Sputtre Coater K550X</td><td>Emitech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-3</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>The MERLIN Compact VP</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazide</td><td>Alfa Aesar</td><td>L01205</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr></tbody></table>

méthodes in ovo et ex ovo pour étudier le développement de l’oreille interne aviaire

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

L’oreille interne perçoit le son et maintient l’équilibre à l’aide de la cochlée et du vestibule. Il le fait en utilisant un type de cellule mécanosensorielle dédié connu sous le nom de cellule ciliée. La recherche fondamentale dans l’oreille interne a conduit à une compréhension approfondie du fonctionnement des cellules ciliées et de la façon dont la dérégulation peut entraîner une perte auditive et des vertiges. Pour cette recherche, la souris a été le système modèle prééminent. Cependant, les souris, comme tous les mammifères, ont perdu la capacité de remplacer les cellules ciliées. Ainsi, en essayant de comprendre les thérapies cellulaires pour restaurer la fonction de l’oreille interne, des études complémentaires chez d’autres espèces de vertébrés pourraient fournir des informations supplémentaires. L’épithélium auditif des oiseaux, la papille basilaire (BP), est une feuille d’épithélium composée de cellules ciliées mécanosensorielles (HC) intercalées par des cellules de soutien (SC). Bien que l’architecture anatomique de la papille basilaire et de la cochlée des mammifères diffère, les mécanismes moléculaires du développement de l’oreille interne et de l’audition sont similaires. Cela fait de la papille basilaire un système utile non seulement pour les études comparatives, mais aussi pour comprendre la régénération. Ici, nous décrivons les techniques de dissection et de manipulation pour l’oreille interne du poulet. La technique montre des méthodes génétiques et d’inhibition de petites molécules, qui offrent un outil puissant pour étudier les mécanismes moléculaires du développement de l’oreille interne. Dans cet article, nous discutons des techniques d’électroporation in ovo pour perturber génétiquement la papille basilaire en utilisant des délétions CRIPSR-Cas9, suivies d’une dissection de la papille basilaire. Nous démontrons également la culture d’organes BP et l’utilisation optimale des matrices de culture, pour observer le développement de l’épithélium et des cellules ciliées.

Dans la configuration d’électroporation, le positionnement des électrodes peut jouer un rôle dans le domaine de la transfection. L’électrode positive est placée sous le jaune et le négatif au-dessus de l’embryon (Figure 1A). Il en résulte une expression plus élevée de la GFP dans une grande partie de l’oreille interne et des organes vestibulaires (Figure 1B) et de la papille basilaire auditive (Figure 1C, D), confir...

Le poussin est un organisme modèle rentable, accessible et largement disponible pour une variété d’études. Ici, une série de protocoles est détaillée pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement et à la régénération de l’oreille interne aviaire.

Méthodes in ovo et ex ovo pour étudier le développement de l’oreille interne aviaire

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

L’âge, l’infection et les médicaments ototoxiques peuvent provoquer une dégénérescence des cellules ciliées de l’oreille interne, ce qui entraîne chez nous une perte auditive. Chez les vertébrés non mammifères, tels que les poussins, les cellules ciliées peuvent être régénérées. Les techniques décrites ici utilisent la rentabilité du travail sur les embryons de poussins, la facilité d’obtention d’embryons et le bon développement exologique des explants tissulaires.Comprendre le développement et la régénération des poils de l’oreille interne aviaire peut fournir des informations importantes sur la perte auditive et les thérapies potentielles, et la culture d’explantation peut être importante pour évaluer les effets ototoxiques de divers médicaments. Avant de commencer l’expérience, procurez-vous des œufs fraîchement pondus et nettoyez-les avec de l’éthanol à 70% pour éviter toute contamination. Incuber les œufs pendant 3,5 à 4 jours, à 37 à 38 degrés Celsius avec 45% d’humidité.Après l’incubation, repositionnez l’embryon au sommet du jaune en plaçant un œuf sur le côté pendant cinq minutes. Ensuite, utilisez une pince pour faire un petit trou en haut et à l’extrémité émoussée de l’œuf pour qu’une aiguille de calibre 21 passe à travers. À l’aide d’une seringue de cinq millilitres et d’une aiguille de calibre 21, retirez deux millilitres d’albumine d’un trou à l’extrémité émoussée de l’œuf.Couvrez le trou à l’extrémité émoussée à l’aide de ruban adhésif transparent. Pour faire la fenêtre de l’œuf, fixez le ruban transparent sur le dessus de la coquille d’œuf. Tenez les aiguilles de la micro-injection à partir de capillaires de verre standard à l’aide d’un extracteur de pipette vertical.Après avoir tiré, cassez l’extrémité capillaire à l’aide d’une pince fine pour obtenir un diamètre d’embout d’environ 50 micromètres avec une extrémité conique. Pour l’expérience d’élimination du gène, mélangez les trois constructions, à savoir le plasmide guide, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP dans un rapport de un à un avec un microgramme de protéine SP Cas9, 30% de saccharose et 0,1% de colorant vert rapide, et un volume final de 10 microlitres. Lors de l’électroporation de plusieurs plasmides, assurez-vous que la concentration finale d’ADN est d’au moins quatre microgrammes par microlitre.À l’aide de ciseaux à ressort, coupez une fenêtre de deux centimètres de long et 1,5 centimètre de large et exposez l’embryon. Ensuite, utilisez des pinces pour ouvrir les membranes chorioniques recouvrant l’embryon, permettant ainsi l’accès à l’embryon. Injectez environ 200 nanolitres de mélange de solution d’ADN pour remplir la vésicule otique.Pour déterminer l’efficacité de l’ARN guide, effectuez un test d’endonucléase T7. Ajoutez des gouttes de solution saline à 0,719% à l’embryon pour abaisser la résistance électrique et éviter la surchauffe. Ensuite, placez l’électrode positive à travers le trou fait du côté émoussé de l’œuf et manœuvrez l’électrode de sorte qu’elle soit sous le jaune.Placez l’électrode négative sur l’otocyste rempli. Pour transfecter le plasmide dans la vésicule otique avec électroporation, utilisez un générateur d’impulsions carrées et appliquez cinq impulsions de 25 volts pendant 100 millisecondes chacune, espacées de 50 millisecondes. Déterminer les conditions empiriquement sur la base d’une installation d’électroporation individuelle.Après électroporation, hydratez l’embryon en ajoutant quelques gouttes de solution saline à 0,719%. Refermez l’œuf avec du ruban adhésif transparent et retournez dans l’incubateur humidifié à une température de 37 à 38 degrés Celsius pour une incubation ultérieure. Désinfectez la table chirurgicale, la scène du microscope et la zone environnante en utilisant de l’éthanol à 70 % et de la chaleur, ou stérilisez à l’alcool l’équipement de microdissection, y compris les ciseaux à ressort minimal, le micro-curet et deux paires de pinces fines.Préparez les plaques de dissection, y compris une boîte de Petri en verre avec une base en silicone noir, une boîte de Petri en plastique de 90 millimètres et une boîte de Petri de 60 millimètres. Gardez le PBS réfrigéré ou la solution saline équilibrée de Hanks, également connue sous le nom de HBSS, prête pour les dissections. Casser doucement l’œuf dans la boîte de Petri de 90 millimètres.Ensuite, identifiez l’oreille externe du poussin et transférez la tête dans une boîte de Petri de 60 millimètres remplie de PBS glacé. Ensuite, orientez l’embryon avec le haut du bec tourné vers l’intérieur et tenez le bec à l’aide de l’une des pinces numéro cinq. Retirez les yeux à l’aide de la deuxième pince numéro cinq.Ensuite, du rostral au caudale, coupez le long du crâne le long de sa ligne médiane et retirez le cerveau. Ajoutez plus de PBS glacé, ou HBSS, et localisez les deux otolithes de la lagène comme des structures brillantes à l’extrémité du canal cochléaire et près de la ligne médiane. Pour isoler deux oreilles internes, coupez entre les deux lagenas, et bien au-dessus et au-dessous de la région.Ensuite, sous un éclairage oblique, visualisez le contour de l’oreille interne et retirez les tissus étrangers et le vestibule. Transférer la cochlée isolée sur une plaque de base en silicone noir avec du PBS glacé. Décollez la capsule cochléaire cartilagineuse à l’aide de la pince numéro cinq pour obtenir le canal cochléaire.Ensuite, localisez la couche ondulée ou le tegmentum du canal cochléaire et retirez-le à l’aide d’une pince numéro 55 pour exposer la papille basilaire ou la PA. Ensuite, retirez la membrane tectoriale pour exposer les cellules ciliées et les cellules de soutien à l’aide d’une pince numéro 55. Pour la culture membranaire de la papille basilaire, prendre une plaque de culture tissulaire à six puits et disposer un insert de membrane de culture par puits. Prélever un peu de milieu dans une pipette de 200 microlitres, puis aspirer la papille basilaire disséquée explant avec un tampon X HBSS.Transférez l’explant sur une membrane et orientez-le de manière à ce que la papille basilaire soit orientée vers le haut et que les cheveux et les cellules de soutien soient visibles du haut. Une fois que l’explant est positionné, aspirez lentement le tampon HBSS de la surface de la membrane de culture. Dans ce processus, l’explant se fixera à la membrane de culture.Remplissez le puits de la plaque des six puits en ajoutant 1,2 millilitre de milieu aigle modifié de dulbecco, ou milieu de culture DMEM, entre l’insert de membrane et la paroi du puits. Pour préparer la culture de collagène du canal cochléaire, ajoutez trois gouttes de mélange de collagène fraîchement préparé dans chaque puits d’une plaque de quatre puits et transférez le canal cochléaire disséqué à chaque goutte de collagène. Incuber la plaque pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius, et 5% de dioxyde de carbone pour durcir la matrice de collagène.Pour un traitement à petite molécule des cultures, remplacer le milieu de culture par 700 microlitres de milieux complétés par le modulateur pharmacologique, tel que la pénicilline, et incuber les plaques comme démontré précédemment. Remplacer 50% des milieux de culture chaque jour. Après un temps d’incubation approprié, retirer le milieu de culture et utiliser les explants pour les essais en aval.Dans la configuration de l’électroporation, le positionnement correct de l’électrode a entraîné une expression plus élevée de la GFP dans l’oreille interne dans les deux organes vestibulaires et une papille basilaire auditive confirmant la transfection. CRISPR Cas9 a médié l’élimination du gène Atoh1 dans l’oreille interne, entraînant une perte de cellules ciliées. L’élimination du gène Atoh1 via une ovo-électroporation suivie d’une incubation jusqu’à ce que E10 ait montré un développement réduit des cellules ciliées par rapport au contrôle plasmidique vide.Bien que l’électroporation soit une mosaïque, les cellules électroporées de contrôle ont pu former des cellules ciliées. Dans les échantillons électroporés d’ARNg Atoh1, les cellules vertes fluorescentes positives aux protéines n’ont jamais montré les marqueurs du développement des cellules ciliées. La culture d’organes de la papille basilaire dans une matrice 3D, comme le collagène et la coloration avec des anticorps contre l’antigène des cellules ciliées, a fourni l’excellente préservation de la morphologie tissulaire jusqu’à cinq jours.L’organisation des cellules ciliées et des cellules de soutien a été maintenue dans ces conditions de culture. Les cultures d’organes sur une membrane peuvent être maintenues jusqu’à cinq jours tout en maintenant l’intégrité du faisceau pileux. Cela peut être vu dans l’image représentative par la localisation de la protéine de liaison de pointe, la protocadhérine 15.Pour étudier le développement du faisceau de cheveux, l’imagerie à plus haute résolution, telle que la microscopie à super résolution ou la microscopie électronique à balayage, peut fournir plus d’informations. Les conditions stériles doivent être maintenues tout au long de la procédure. Pendant l’électropore, assurez-vous que les embryons ne se dessèchent pas.Lors du titrage des inhibiteurs pharmacologiques, on peut réduire la concentration pour surmonter toute létalité. Les embryons et les explants peuvent être prélevés pour des expériences d’imagerie. Soit en effectuant une microscopie vidéo en temps réel, soit une microscopation confocale électronique à lumière statique, comme indiqué dans le protocole.Compte tenu de la facilité et de l’accessibilité de l’utilisation d’explants de l’oreille interne de poussin, nous pouvons utiliser un milieu grâce à un criblage de preuves pour identifier de nouvelles molécules essentielles à la régénération des cellules ciliées.

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