Protocoles pour la mutagenèse CRISPR/Cas9 de la mouche orientale des fruits Bactrocera dorsalis

La mouche orientale des fruits est une espèce de ravageur très envahissante et adaptative. Des méthodes efficaces de recherche sur les gènes fonctionnels pourraient nous aider à élaborer des stratégies de lutte antiparasitaire respectueuses de l’environnement. Cette méthode est très efficace et peu coûteuse.

Notre protocole servira de guide utile pour générer des mouches mutantes pour les chercheurs sur les mouches orientales des fruits. Pour commencer, prédire la structure des gènes cibles d’intérêt et déterminer les limites entre les exons et les introns via l’analyse bioinformatique du génome de Bactroceras dorsalis. Utilisez le kit de synthèse d’ARNg disponible dans le commerce pour générer le sgRNA conçu.

Remettez en suspension le produit d’ARNg dans de l’eau exempte de nucléase. Quantifier la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre UV-visible et conserver à 80 degrés Celsius avant utilisation. Placer les pupes de B. dorsalis dans une cage en plastique, avec des conditions d’élevage de 55% d’humidité relative, 26,5 degrés Celsius et un cycle de lumière / jour 14:10.

Lorsque les adultes ferment, fournissez un mélange de sucre et de levure comme nourriture avec de l’eau. La plupart des adultes atteignent la maturité sexuelle 10 jours après l’émergence. Utilisez un support lumineux avec une lumière de 30 à 50 lux pour améliorer la fécondité des femelles, améliorant ainsi l’efficacité de la collecte d’embryons.

Ensuite, placez une gaze de 200 mailles dans la chambre de ponte, à environ 1 à 2 millimètres du couvercle de la chambre. Placez une nouvelle chambre de ponte dans la cage lorsque la configuration de micro-injection est prête. Prélevez les embryons toutes les 10 minutes à l’aide d’une fine brosse humide et alignez-les sur une plaque d’injection faite maison.

Trempez les embryons dans de l’huile d’halocarbure pendant l’injection pour éviter toute dessiccation supplémentaire. Préparer la solution de travail en mélangeant la protéine Cas9 et l’ARNg correspondant à une concentration de 300 nanogrammes par microlitre de chacun. Ensuite, ajoutez 1 microlitre de rouge de phénol au mélange pour servir de moyen pratique de marquer les embryons injectés.

Placer le mélange préparé sur de la glace pour éviter la dégradation de l’ARNg. Préparez l’aiguille d’injection de verre à l’aide d’un extracteur de micropipette. Ajouter 3 microlitres du mélange dans l’aiguille d’injection sans introduire de bulles d’air.

Ensuite, ouvrez l’aiguille à l’aide d’un microbroyeur et connectez-la au micromanipulateur conformément au guide de l’utilisateur. Définissez les paramètres de l’injecteur sur Pi sur 500 hectopascals. Ti à 0,5 seconde, et PC à 200 hectopascals.

Placez l’assiette avec les embryons alignés sur la table de l’objectif. Ensuite, ajustez la position de la micropipette sous un microscope optique fin, en plaçant la micropipette et l’embryon sur le même plan. Insérez l’extrémité de l’aiguille dans le pôle postérieur ou végétal de l’embryon.

Ensuite, appuyez sur la pédale de l’injecteur pour livrer les mélanges dans l’embryon. L’apparition d’une légère couleur rougeâtre est due à l’ajout de rouge phénol dans le mélange. Placez la plaque d’injection avec les embryons injectés dans une chambre climatique artificielle.

Après 36 heures, transférer les larves écloses dans le régime larvaire à l’aide d’une brosse à pointe fine. Ramassez les larves trois ou quatre fois par jour jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de larves. Ensuite, placez les larves matures dans le sable humide pour les nymphoser.

La phase de nymphose dure 10 jours. Après la nymphose, déplacez les pupes dans une cage en plastique avant le début de l’éclosion. Après avoir isolé l’ADN génomique d’un puparium frais ou d’une seule jambe médiane d’adultes individuels et conçu les amorces spécifiques pour amplifier la zone cible, effectuer une réaction en chaîne de la polymérase, ou PCR, en suivant les conditions de cycle décrites dans le manuscrit.

Ensuite, séquencez les produits PCR purifiés. La détection de plusieurs pics qui se chevauchent adjacents au site cible suggère une mutagénèse réussie. Pour le sous-clonage, mélanger les produits PCR purifiés avec un vecteur à extrémité émoussée et les ligaturer à 25 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Ensuite, ajoutez des cellules trans-T1 et placez-les sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de milieu LB et incuber à 37 degrés Celsius pendant 1 heure en secouant. Centrifuger et jeter le surnageant.

Remettez la pastille en suspension et étalez-la sur une plaque LB. Placez l’assiette pour l’incubation pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ensuite, sélectionnez des colonies bactériennes individuelles pour le séquençage afin de vérifier le génotype des mutants.

Dans cette étude, l’exemple du site cible du gène sélectionné est situé dans le troisième exon. Le site cible est hautement conservé, et une seule bande a été détectée par électrophorèse sur gel pour la matrice d’ADN pour l’ARNg synthétique et l’ARNg obtenus en transcription in vitro. La survie et la mutagénèse de B.dorsalis après micro-injections sont montrées ici.

Après séquençage des produits PCR, 80% des individus G0 sont des mutants mosaïques. Dans le dépistage des mutants, le mutant avec délétion de 8 paires de bases a entraîné l’arrêt prématuré de la traduction des acides aminés. L’insertion de l’aiguille dans la région postérieure ou le pôle végétal d’un embryon est une étape centrale car elle affecte directement la survie des œufs.

Cette technologie fournit une référence pour étudier les domaines des fonctions des gènes chez B.Dorsalis Ils peuvent rapidement capturer les mutants qu’ils veulent grâce à cette méthode.