Évaluation et manipulation de l’activité neuronale à l’aide de la microscopie holographique à deux photons

Ce protocole fournit des informations temporelles spatiales précises sur la neuroactivité. Le principal avantage de cette technique est sa capacité à manipuler et à évaluer la neuroactivité avec une résolution temporelle spatiale élevée. Il peut être utile pour illustrer les agents pathogènes des troubles neuropsychiatriques qui conduisent à des anomalies dans l’activité neuronale.

Cette méthode peut être appliquée à l’étude des neurones ainsi qu’à la santé dans les autres organes. La démonstration de la procédure sera Zhongtian Guo, doctorant de notre laboratoire. Un jour après l’implantation de la plaque de tête, administrer 1,32 milligramme par kilogramme de phosphate de sodium de dexaméthasone par voie intrapéritonéale une heure avant la chirurgie pour éviter l’œdème cérébral.

Sous un stéréoscope, effectuer une craniotomie circulaire d’environ deux millimètres de diamètre à l’aide d’une perceuse dentaire. Pour réduire les lésions cérébrales, utilisez la perceuse dentaire avec précaution avec un léger mouvement constant et une légère pression vers le bas. Retirez les fragments d’os plusieurs fois à l’aide d’un système d’aspiration.

Après avoir retiré le fragment d’os, utilisez un liquide céphalo-rachidien artificiel ou une solution ACSF pour enlever et laver tous les débris restant à la surface du cerveau. Répétez cette procédure de nettoyage plusieurs fois pour supprimer les réactions inflammatoires. À l’aide d’un système d’injection de pression, réglez la pression appropriée pour injecter 500 nanolitres de solution AAV à travers un capillaire en verre d’un diamètre de pointe de 10 à 20 micromètres pendant 10 minutes.

Si le niveau de la solution AAV dans le capillaire en verre diminue progressivement, la solution AAV est administrée au cerveau. Laissez le capillaire en verre en place pendant 10 minutes supplémentaires pour éviter le refoulement. Répétez cette opération trois fois pour administrer un total de 1,5 microlitre de solution AAV dans le cerveau.

Appliquer une agarose à faible fusion de 2% sur la surface du cerveau de S1 à l’aide d’une micropipette, puis placer une fenêtre en verre sur la craniotomie avec deux verres de couverture. Pressez le verre de couverture contre l’agarose alors qu’il est encore liquide. Cela empêche la formation de bulles d’air dans l’agarose.

Scellez les bords de la fenêtre crânienne avec du ciment de résine adhésive dentaire. Pour calibrer le système de stimulation holographique, placez la surface d’une lame fluorescente rouge sur le plan de l’échantillon et placez le microscope en mode d’imagerie en direct avec une faible lumière d’excitation. Exécutez l’interface graphique d’étalonnage.

mfile, vérifiez le volet des paramètres et cliquez sur le bouton Enregistrer. Cliquez sur le bouton Z Scan dans le volet de l’étape un pour générer automatiquement trois points aléatoires dans 21 plans axiaux différents à deux micromètres de chaque plan. Déplacez la barre de défilement et vérifiez l’image en direct.

Trouvez le plan parfait où les taches apparaissent les plus petites et les plus lumineuses, puis cliquez sur le bouton Enregistrer. Cela générera automatiquement un front d’onde sphérique décalé pour l’hologramme numérique. Cliquez sur le bouton OK dans le volet de l’étape deux, puis cliquez sur six emplacements sur le carré de gauche.

Vérifiez l’image en direct. S’il y a six taches fluorescentes distinctes, tapez leurs axes x et Y dans les zones d’édition et cliquez sur le bouton Enregistrer. Cela générera automatiquement un coefficient de transformation fine pour coordonner l’étalonnage entre la stimulation holographique et le système d’imagerie.

Cliquez ensuite sur le bouton Analyser dans le volet de l’étape trois. Il générera 441 hologrammes numériques pour effectuer un balayage ponctuel dans le champ de vision en 21 par 21 étapes. Vérifiez les images tout en modifiant les motifs dans la zone de liste.

Ajustez la puissance laser pour obtenir des images ponctuelles dans la plage dynamique de l’appareil d’imagerie. Mettez le périphérique d’imagerie en mode d’enregistrement et cliquez sur le bouton Lecture. Une fois la lecture terminée, cliquez sur Générer la carte de poids dans le volet quatre de l’étape et choisissez une image empilée.

Fermez ensuite la fenêtre de l’interface graphique d’étalonnage. Il générera automatiquement une carte de poids pour compenser l’intensité déséquilibrée à chaque endroit. Placez la souris injectée AAV avec une plaque de tête sous le microscope et effectuez une imagerie à deux photons à l’aide d’un microscope holographique et d’un laser saphir titane à mode verrouillé réglé sur 920 nanomètres avec un objectif 25x.

Ouvrez le logiciel d’imagerie commercial en mode d’imagerie en direct. Ajustez la tension du détecteur d’images et la puissance du laser imageur pour optimiser la luminosité des neurones exprimant GCaMP8f. Capturez des images des neurones exprimant cette protéine.

Pour éclairer les neurones spécifiques avec une illumination holographique, exécutez le SLMcontrol. Fichier de script m. Cliquez sur l’image de référence et choisissez l’image acquise.

Ensuite, cliquez sur le bouton Spot pour choisir des pixels spécifiques sur les neurones de l’image et appuyez sur le bouton Entrée du clavier pour le finaliser. Pour détecter l’activité neuronale avec une résolution temporelle élevée à l’aide d’un capteur d’image, définissez le temps d’exposition, la zone d’imagerie et le binning, puis effectuez l’acquisition de l’image. Après avoir placé la souris sous le microscope et effectué une imagerie à deux photons, ouvrez le logiciel d’imagerie commercial.

En mode d’imagerie en direct, réglez la tension du détecteur d’images et la puissance du laser d’imagerie pour optimiser la luminosité des neurones exprimant GCaMP-6m-p2A-ChRmine. Capturez des images des neurones exprimant ces protéines, puis illuminez les neurones spécifiques en suivant la procédure décrite précédemment. Pour étudier la connectivité fonctionnelle dans les neurones des couches deux et trois, utilisez un modulateur de lumière spatial pour générer des modèles holographiques de stimulation optogénétique et combinez-le avec l’imagerie calcique à deux photons.

Réglez l’intensité du laser imageur à 920 nanomètres à 10 à 20 milliwatts et le champ de vision à 256 micromètres par 256 micromètres mesurés à une profondeur de 100 à 150 micromètres de la surface corticale. Réglez le temps d’arrêt des pixels sur 1,5 microseconde pour deux hertz ou 100 nanosecondes pour 30 hertz. Utilisez à la fois deux hertz et 30 hertz comme fréquence d’images d’imagerie pour voir si un seul stimulus holographique a provoqué une réponse calcique dans les neurones.

Réglez l’intensité du laser de stimulation holographique qui stimule un seul neurone à 10 milliwatts, ce qui est suffisant pour induire une activité neuronale. Simultanément, imagez la réponse du calcium et du fer à 920 nanomètres avec 10 stimuli holographiques à 1040 nanomètres et des intervalles de huit secondes pendant une durée de 50 millisecondes après une période de référence de 10 secondes. Après cela, remettez la souris dans sa cage d’origine.

L’image représentative et les traces de neurones exprimant GCaMP8f en imagerie 100 hertz avec stimulation holographique et un capteur d’image sont montrées ici. Ce graphique montre la réponse neuronale à la stimulation holographique à chaque puissance laser. Les traces représentatives de calcium 2+ lors de la stimulation holographique de 10 neurones différents à des fréquences d’imagerie de deux hertz et 30 hertz sont présentées ici.

La même couleur indique le même neurone. Un diagramme schématique évaluant les connexions fonctionnelles entre les neurones est représenté ici. Lorsque le neurone orange est stimulé, les neurones rouges répondent en même temps, indiquant qu’il existe une connectivité fonctionnelle entre ces neurones.

Une image typique des neurones primaires du cortex somatosensoriel exprimant GCaMP6m en type sauvage est montrée ici. Ces images graphiques représentent les traces typiques de calcium 2+ lors de la stimulation holographique à des fréquences d’imagerie de deux hertz et 30 hertz. La réactivité neurologique à la stimulation holographique peut être détectée à des vitesses d’imagerie de deux hertz et de 30 hertz.

Ces étapes sont importantes pour réduire les mouvements du cerveau et deuxièmement, obtenir des résultats stables. Nous pensons que ce microscope peut induire un comportement dans l’écriture des neurones avec des motifs spécifiques. Avec cette technique, nous sommes maintenant en mesure d’évaluer et de manipuler l’activité de neurones individuels et de caractériser la neuropsychiatrie en détail.