En face Préparation d’un coussin endocardique pour l’analyse de morphogenèse planaire chez des embryons de souris

Ce protocole permet l’analyse de l’endocarde primitif dans une orientation plane. Nous pouvons analyser la distribution des cellules endocardiques, l’anisotropie d’autres injonctions et décrire la forme d’une seule cellule endocardique au cours du développement de la valve. Par rapport aux coupes de tissus classiques, l’imagerie faciale de la région régénérative de la valve interne permet d’analyser la polarité cellulaire plane et la dynamique des cellules endocardiques pendant le développement de la valve chez des embryons intacts.

Cette méthode peut être utilisée pour approfondir la connaissance de la polarité cellulaire plane pendant le développement cardio. Commencez par placer l’utérus excisé de souris gravides euthanasiées dans une boîte de Petri contenant du PBT glacé. Retirez la déciduye individuelle de l’utérus au microscope à dissection à l’aide d’une pince fine.

À l’aide d’une fine pince à épiler, faites une incision dans la partie blanche de la décidue, où se trouve l’embryon. Retirez-le délicatement, évitez de tirer et transférez les embryons dans une nouvelle boîte de Petri avec du PBT frais à l’aide d’un P-1000 avec la pointe coupée, laissant un diamètre suffisamment grand pour qu’un embryon puisse passer à travers sans se casser. Pour le génotypage, prenez un petit morceau du sac vitellin d’environ 0,5 millimètre carré ou un morceau de la queue de l’extrémité postérieure, en comptant cinq à 10 somites vers la tête et digérez-le dans 100 millilitres du tampon approprié.

Sous la hotte, transférer les embryons dans du 4% PFA glacé dans un tube microcentrifuge de deux millilitres à quatre degrés Celsius. Fixez les embryons de deux heures à la nuit à quatre degrés Celsius sur un nutator. Sous la hotte, retirer le fixateur à 4% PFA des tubes de microcentrifugation sans toucher les embryons.

Jeter le PFA dans un contenant approprié. Lavez les embryons cinq fois dans du PBT froid pendant 10 minutes à température ambiante. À l’aide de pinces fines, retirez le cœur et transférez-le dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre avec du PBT frais.

Remplacer PBT par PBS Triton et laver les échantillons trois fois, cinq minutes chacun, à température ambiante sur un agitateur orbital. Remplacer PBS Triton par une solution bloquante contenant du PBS Triton avec 10% de sérum bovin inactivé par la chaleur. Incuber de deux heures à une nuit à quatre degrés Celsius sur un agitateur orbital.

Remplacer la solution bloquante par une solution de blocage contenant des anticorps primaires à la concentration désirée. Incuber pendant la nuit sur un agitateur orbital à quatre degrés Celsius. Après une incubation nocturne à quatre degrés Celsius, incuber les échantillons pendant 1,5 heure à température ambiante sur un agitateur orbital.

Cette étape est cruciale pour augmenter le rapport signal sur bruit. Retirer et conserver la solution d’anticorps primaire à quatre degrés Celsius, jusqu’à trois expériences futures. Ajouter l’azoture de sodium à une concentration finale de 0,02% pour une meilleure conservation.

Ensuite, lavez les embryons trois fois avec PBS Triton pendant trois minutes chacun. Lavez les embryons avec PBS Triton trois fois pendant 30 minutes et gardez-les sur un agitateur orbital à quatre degrés Celsius. Après le dernier lavage, ajouter un millilitre de solution bloquante contenant un anticorps secondaire conjugué à la fluorescence contre l’espèce hôte de l’anticorps primaire.

Ajoutez ensuite du DAPI à la solution et incuber les embryons pendant la nuit sur un agitateur orbital à quatre degrés Celsius. Après l’incubation nocturne à quatre degrés Celsius, incuber les embryons pendant 1,5 heure à température ambiante sur un agitateur orbital. Cette étape est essentielle pour augmenter le rapport signal sur bruit.

Répétez les étapes de lavage PBS Triton comme mentionné dans le manuscrit du texte. Mettez les cœurs sur une boîte de Petri de 35 millimètres contenant du PBS. À l’aide d’un fil de tungstène et de fines pinces, isolez le canal auriculo-ventriculaire ou le tractus de sortie et coupez-les longitudinalement.

Préparez des couvercles, des lames, des pinces, une pipette P-200 avec les embouts appropriés, une serviette en papier et tout support de montage aqueux à base de glycérol pour la fluorescence sans DAPI. Collez deux bandes de ruban adhésif sur une lame séparées de 0,3 à 0,6 centimètre pour créer un espace de pièce 3D qui permettra aux échantillons de conserver leur forme originale sans les écraser. Ensuite, à l’aide d’environ 20 microlitres de tampon, déposez soigneusement les échantillons sur la lame entre les bandes de ruban à l’aide d’une pointe de pipette P-200 coupée.

Utilisez un microscope à dissection pour augmenter la précision. À l’aide d’une pince fine, placer les échantillons avec l’endocarde vers le haut et le myocarde vers le bas sur la lame. Retirez l’excès de PBS avec une serviette en papier et évitez de toucher l’échantillon.

Ensuite, séchez les échantillons pendant une à deux minutes à température ambiante pour que les échantillons collent à la lame. Ajouter 40 microlitres de support de montage à base aqueuse dans le tissu. Placez le couvercle sur les deux morceaux de ruban adhésif et abaissez-le lentement sur le tissu avec une aiguille ou une pince.

Évitez de créer des bulles d’air. Scellez le bordereau de couverture à l’aide d’une goutte de vernis à ongles sur chaque sommet du couvercle. Une fois que le vernis à ongles est sec, nettoyez l’excès de support de montage sur les côtés du couvercle à l’aide d’une serviette en papier absorbante.

Évitez de déplacer le bordereau de couverture. Ajoutez du vernis à ongles le long des bords du couvercle pour le sceller complètement, empêchant ainsi l’évaporation du support de montage. À l’aide d’un microscope confocal vertical ou inversé, prenez des images à un grossissement de 10X pour une vue générale et à 63X avec un zoom 3X pour des images détaillées.

La forme cellulaire de l’endocarde a été analysée lors de la formation des valves à une résolution cellulaire. Des cellules individuelles ou des clones de quelques cellules exprimées en GFP dans l’endocarde. L’expression et la combinaison de la GFP avec la localisation subcellulaire de la VE-cadhérine ont été une approche efficace pour étudier la relation entre la dynamique de l’AJ et la formation de filopodia et les cellules pré-EMT, puisque ces cellules ont développé des protubérances membranaires lorsque les AJ se dissolvent.

Les différences dans l’intensité de la coloration de la VE-cadhérine dans l’endocarde ont indiqué la présence d’une contractilité anisotrope dans l’endocarde embryonnaire du canal auriculo-ventriculaire aux stades prévalvulaires. Tout le cœur a été coloré avec des anticorps VE-cadhérine à E8.5 et E9.5. À E8.5, l’endocarde du canal auriculo-ventriculaire avait tendance à avoir une organisation épithéliale stable, et les sommets formés par plus de quatre cellules n’ont pas été détectés.

À E9.5, des sommets allant jusqu’à six cellules ont été observés formant des structures en forme de rosette, similaires à l’organisation cellulaire précédemment décrite dans l’épithélium subissant des réarrangements cellulaires actifs, suggérant que l’endocarde du canal auriculo-ventriculaire subissait un réarrangement cellulaire dynamique pendant le développement de la valve. Une courbe d’apprentissage est nécessaire pour devenir un expert dans cette technique. De plus, il est fortement recommandé d’utiliser des pinces Sovereign et du fil de tungstène.

Aujourd’hui, la visualisation de l’endocarde prévalvulaire était limitée aux coupes transversales. Notre approche offre la possibilité d’étudier le comportement embryonnaire de l’endocarde valvulaire d’un point de vue planaire.