Plate-forme analytique multimodale sur une puce d’imagerie par résonance plasmonique de surface multiplexée pour l’analyse de sous-ensembles de vésicules extracellulaires

La nature complexe des VE rend difficile la reconnaissance de la sous-population d’intérêt, et ce protocole peut les détecter avec leur phénotype, leur profil de taille et leurs propriétés nanomécaniques. Cette combinaison de techniques est une méthode sans étiquette, qui nous permet de détecter les VE en temps réel à partir du milieu de l’état et du plasma sanguin. Cette technique permet de caractériser profondément un sous-ensemble de nanoparticules d’intérêt, afin d’être utilisées comme bio-indicateurs de pathologie, ou également utilisées comme nanoparticules pour l’administration de médicaments.

Comme il s’agit d’une méthode très sensible, il est impératif de faire attention à la préparation de la biopuce avant d’injecter votre échantillon d’intérêt. Après avoir enduit et fonctionnalisé les puces, incuber la biopuce dans un mélange de 200 millimolaires d’éthyl diméthylaminopropyl carbodiimide/N-hydroxysuccinimide et de 50 millimolaires par litre de N-hydroxysuccinimide pendant au moins 30 minutes à l’obscurité à température ambiante. À l’aide du spotter, ajoutez 300 nanolitres de solution de ligand et incuber la biopuce sous un bain sonique pendant 30 minutes.

Lavez la biopuce par le haut avec de l’eau ultrapure. Ajoutez une gouttelette d’huile ayant le même indice de réfraction que le prisme pour créer une fine couche uniforme entre la biopuce et le prisme, et placez-la doucement sur un prisme ayant le même indice de réfraction que la biopuce. Pour l’imagerie par résonance plasmonique de surface, montez la biopuce sur le système SPRi.

Accédez au menu déroulant sur le côté gauche du logiciel et cliquez sur le répertoire de travail. Recherchez l’image où différents points sont visibles, puis cliquez pour sélectionner cette image. Écrivez ensuite le nom des familles de ligands, et cliquez sur la définition de l’espèce Finish.

Faites glisser la ligne noire avec le curseur jusqu’à l’angle de travail optimal. Cliquez sur Déplacer le miroir à l’angle de travail et sélectionnez un angle de travail. Maintenant, cliquez sur Cinétique.

Lorsque le logiciel invite l’utilisateur à définir le contrôle négatif, choisissez Aucun contrôle négatif à ce stade. Injectez de l’albumine sérique de rat à 50 microlitres par minute pendant quatre minutes. Injecter de l’éthanolamine à raison de 20 microlitres par minute pendant 10 minutes pour désactiver les groupes carboxyliques encore présents et réactifs en surface.

Ensuite, lavez la biopuce en injectant 40 millimolaires OG à 50 microlitres par minute pendant quatre minutes. Injecter les vésicules extracellulaires à une concentration spécifique sur la puce biofonctionnalisée tout en suivant la cinétique de l’interaction des vésicules sur les différents spots, simultanément. Déterminez également la valeur de la réflectivité et le niveau d’interaction.

Une fois stabilisé, injecter du glutaraldéhyde sur la puce pour fixer les vésicules extracellulaires à l’endroit où elles se trouvent avant de faire l’imagerie AFM. Alignez la biopuce sur le dessus du masque sur la lame de verre. Utilisez la caméra CCD sur le dessus de l’AFM pour localiser le porte-à-faux au bon endroit qui doit être scanné.

Démarrez l’acquisition AFM en mode contact de trois à cinq grandes surfaces. Ensuite, traitez les images AFM avec le logiciel de traitement de données JPK en sélectionnant d’abord le canal de hauteur. Choisissez un ajustement polynomial à soustraire de chaque ligne pour obtenir des lignes de balayage redressées.

Sélectionnez le seuil de hauteur sur les grains d’or pour éliminer la rugosité de la surface. Le module d’extraction des grains marque les grains à l’aide d’un seuil de hauteur de 8,5 nanomètres. Des biopuces multiplexées ont été analysées après passivation de l’albumine.

La puce sans défaut. La puce avec quelques défauts, dus à la fusion de taches, à une greffe faible, à des bulles ou à des contaminants. Et une puce d’or nue sans microréseaux pour examiner l’adsorption des vésicules extracellulaires sur l’or est montrée.

L’expérience de capture sur une biopuce multiplexée a montré de bons signaux de réflectivité pour différents ligands, et un bon rapport signal sur bruit pour les différents ligands, puisque la réponse du contrôle négatif était négligeable. L’adsorption des vésicules extracellulaires après l’injection de l’échantillon de vésicule extracellulaire a montré un signal de réflectivité élevé, suggérant que ces vésicules étaient capables de s’adsorber et de rester stables sur la puce d’or. Après le chargement des vésicules extracellulaires, les images AFM à grande et à petite échelle des vésicules extracellulaires sur des biopuces ont été générées.

Une vue rapprochée à haute résolution permet la métrologie des vésicules extracellulaires. Le diamètre effectif des vésicules extracellulaires sur une biopuce variait de 30 à 300 nanomètres, avec une grande majorité autour de 60 nanomètres. Les résultats obtenus dans l’air et dans le liquide étaient comparables.

Le spectre Raman des vésicules extracellulaires adsorbées sur une puce nue a révélé un spectre clair, avec des pics correspondant principalement aux vibrations du méthylène, qui sont associées aux lipides des membranes des vésicules extracellulaires. Il est important de préparer votre biopuce rigoureusement afin de pouvoir détecter vos véhicules électriques avec précision et de manière reproductible. Des méthodes conventionnelles telles que le transfert Western et l’analyse de suivi des nanoparticules peuvent être utilisées pour corréler et confirmer les phénotypes et les modèles de taille.

De plus, les analyses multi-omiques sont envisagées pour aller encore plus loin dans la caractérisation moléculaire des VE et la discrimination potentielle des sous-ensembles.