Une plate-forme vaccinale à nanoparticules « plug-and-display » basée sur des vésicules de membrane externe présentant un domaine de liaison au récepteur du SRAS-CoV-2

La nanoscience peut améliorer efficacement la réponse immunitaire spécifique de l’antigène après avoir affiché des antigènes à la surface de Le principal avantage de cette plate-forme vaccinale peut permettre d’obtenir la plaque et l’affichage. En d’autres termes, la plate-forme est capable d’afficher la variété d’antigènes dans Cette méthode peut également être appliquée à d’autres nanoparticules biologiques pour afficher le moteur à des porteurs de taille nanométrique. Pour effectuer une transformation de cathéter espion de cytolysine A, commencez par ajouter cinq microlitres de solution plasmatique à 50 microlitres de souche compétente BL 21.

Souffler doucement et laisser refroidir sur la glace pendant 30 minutes. Placez la solution pendant 90 secondes au bain-marie à 42 degrés Celsius, puis mettez immédiatement la solution mélangée sur de la glace pendant trois minutes. Ajouter 500 microlitres de milieu luria bertani à la suspension bactérienne et après mélange culture à 220 rotations par minute à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Ensuite, plaquez toute la plaque de gélose de luria bertani de transformation contenant de l’ampicilline et la culture pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Pour la production d’OMV spycatcher, commencez par isoler une seule colonie de la plaque à 20 millilitres de milieu luria bertani et cultivez pendant la nuit à 220 rotations par minute à 37 degrés Celsius. Incuber la solution bactérienne dans un milieu de deux litres et cultiver à 220 rotations par minute à 37 degrés Celsius pendant cinq heures jusqu’à ce que le stade de croissance logarithmique soit atteint.

Ajouter l’isopropyl bêta D-IPTG pour obtenir la concentration finale de la solution bactérienne à 0,5 millimolaire, puis la culture pendant la nuit à 220 rotations par minute à 25 degrés Celsius. Ensuite, effectuez la purification OMV spycatcher. Commencez par centri fusionnant la solution bactérienne.

Filtrez le surnageant avec un filtre à membrane de 0,22 micromètre, puis concentrez-le à l’aide d’une colonne de fibres creuses. Filtrer le concentré à travers un filtre à membrane de 0,22 micromètre, puis le fusionner à 150 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant deux heures à l’aide d’un fusible ultracentricentri et jeter le surnageant avec une pipette. Re-suspendre les précipitations avec PBS et les stocker à moins 80 degrés Celsius.

Pour effectuer la transfection spytag RBD, commencez par sélectionner un système d’expression eucaryote approprié et cultivez les cellules pendant la nuit à 130 rotations par minute à 37 degrés Celsius après la récupération. Ajoutez 20 microlitres HEK 293F de solution cellulaire dans le compteur de cellules automatisé. Enregistrez le nombre de cellules, ajustez la concentration à une fois 10 à six cellules par millilitre.

Et puis culture des cellules à 130 rotations par minute à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Filtrez le plasmide espion RBD à travers un filtre à membrane de 0,22 micromètre et ajoutez 300 microgrammes de plasmides dans le milieu de culture cellulaire jusqu’à ce que le volume final soit de 10 millilitres. Agiter pendant 10 secondes.

Chauffer l’Île-du-Prince-Édouard à 65 degrés Celsius au bain-marie. Mélanger 0,7 millilitre de PEI avec 9,3 millilitres de milieu de culture cellulaire et agiter par intermittence pendant 10 secondes. Ajouter la solution plasmidique à la solution PEI.

Agitez le mélange par intermittence pendant 10 secondes et incuberez-le à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ajouter le mélange à 280 millilitres de milieu de culture cellulaire et cultiver à 130 rotations par minute à 37 degrés Celsius pendant cinq jours. Ensuite, effectuez la purification du spytag RBD.

Commencez par centri fusionnant les cellules à 6 000 fois G à 25 degrés Celsius pendant 20 minutes et utilisez une pipette pour recueillir le surnageant. Remplissez la colonne avec deux millilitres d’agarose NTA de nickel et lavez-la trois fois avec du PBS. Ajouter l’imidazole dans le surnageant cellulaire pour obtenir la concentration finale de 20 millimolaires, et charger le surnageant cellulaire.

Ajouter trois volumes de colonne de PBS contenant 20 millimolaires d’imidazole pour le lavage et recueillir la fraction de lavage. Éluer à gradient avec trois volumes de colonne de PBS contenant des concentrations faibles à élevées d’imidazole éluer deux fois pour chaque concentration. Pour déterminer la concentration en protéines par la méthode BCA, diluez en série la solution de protéine BSA standard de deux à 0,0625 milligramme par millilitre, diluez 10 fois le spycatcher OMV purifié et l’étiquette espion RBD.

Ensuite, mélangez les solutions de travail BCA A et B dans un rapport de 50 pour un. Ajouter la solution de protéines diluées et mélanger avec la solution de travail BCA. Incuber à 37 degrés pendant 30 minutes.

Mesurez l’absorbance à 562 nanomètres de chaque puits et calculez la concentration en protéines à partir de la courbe standard. Pour effectuer la bioconjugaison d’OMV spycatcher et RBD spy tag, mélangez OMV spycatcher et RBD spytag et PBS à un ratio de 40 pour un. Tourner verticalement pour mélanger le mélange pendant la nuit à 15 rotations par minute à quatre degrés Celsius.

Effectuer la purification d’OMV RBD à l’aide d’une solution PBS en utilisant une procédure similaire à la purification OMV spycatcher. Le schéma de conception du plasma montre que le gène spycatcher est connecté au gène cly A via un linker flexible tandis que le spytag se connecte aux cinq terminaux premiers du gène RBD avec un gène hys tag pour la purification et la vérification. Après l’ultracentrifugation, presque tout le spytag RBD n’ayant pas réagi est resté dans le surnageant.

La deuxième ultracentrifugation n’a pas fourni d’autre avantage significatif par rapport à la première fois. Le diamètre hydrodynamique moyen z de l’OMV spycatcher était de 133 nanomètres alors qu’il était de 152,6 nanomètres pour OMV-RBD. Ces différences peuvent être dues au fait que le RBD augmente la taille des particules OMV après un affichage intensif.

Les résultats de la TEM concordent avec la distribution granulométrique obtenue à partir des résultats de la DLS. La rotation pour mélanger le mélange est très importante. L’efficacité de la réaction peut être beaucoup plus faible sans rotation.