Name: Une plate-forme vaccinale à nanoparticules plug-and-display basée sur des vésicules de membrane externe présentant un domaine de liaison au récepteur du SRAS-CoV-2 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Découvrez la bio-ingénierie de vésicules de membrane externe comme plateforme vaccinale « plug-and-display ». Cette méthode permet d'afficher divers antigènes pour améliorer les réponses immunitaires spécifiques.

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Ce travail a été soutenu par le programme clé de la Fondation des sciences naturelles de Chongqing (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) et le projet de la Fondation nationale chinoise des sciences naturelles (n° 31670936, 82041045).

1. Construction plasmidique
<ol><li>Insérer l’ADN codant pour la séquence SpyCatcher (dossier supplémentaire 1) dans un plasmide pThioHisA-ClyA résistant à l’ampicilline (voir le tableau des matériaux) entre les sites BamH I et Sal I pour construire le plasmide pThioHisA ClyA-SC à la suite d’un rapport publié précédemment20.</li>
	<li>Licater le gène de fusion SpyTag-RBD-Histag synthétisé (fichier supplémentaire 1) dans un plasmide pcDNA3.1 (voir le tableau des matériaux) entre les sites BamH I et EcoR I pour construire le plasmide pcDNA3.1 RBD-ST à la suite d’un rapport publié précédemment19.</li>
</ol>2. Préparation de l’OMV-SC
<ol><li>Effectuez la transformation ClyA-SC en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Ajouter 5 μL de solution plasmidique pThioHisA ClyA-SC (50 ng/μL) à 50 μL de souche compétente BL21, souffler doucement et laisser refroidir sur la glace pendant 30 min.</li>
		<li>Placer la solution pendant 90 s au bain-marie à 42 °C, puis déposer immédiatement la solution mélangée sur de la glace pendant 3 min.</li>
		<li>Ajouter 500 μL de milieu LB à la suspension bactérienne et, après mélange, cultiver à 220 rpm à 37 °C pendant 1 h.</li>
		<li>Plaquer toute la transformation sur une plaque de gélose LB contenant de l’ampicilline (100 μg/mL, voir le tableau des matières) et la cultiver pendant une nuit à 37 °C. NOTE: Dans des expériences ultérieures, l’ampicilline a été maintenue à la même concentration dans le milieu. Sinon, cela peut entraîner une perte de plasmides dans les bactéries.</li>
	</ol></li>
	<li>Pour la production OMV-SC, effectuez les étapes ci-dessous.<ol><li>Isoler une seule colonie de la plaque (étape 2.1.4.) à 20 mL de milieu LB (résistant à l’ampicilline) et cultiver pendant une nuit à 220 rpm à 37 °C.</li>
		<li>Inoculer la solution bactérienne (à partir de l’étape 2.2.1.) dans un milieu de 2 L, culture à 220 tr/min, 37 °C pendant 5 h jusqu’au stade de croissance logarithmique (la DO600 nm est comprise entre 0,6 et 0,8).</li>
		<li>Lorsque la DO à 600 nm de la solution bactérienne atteint 0,6-0,8, ajouter l’isopropyl bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, voir le tableau des matériaux) pour obtenir la concentration finale de la solution bactérienne à 0,5 mM, puis la culture pendant la nuit à 220 rpm à 25 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuez la purification OMV-SC.<ol><li>Centrifuger la solution bactérienne à 7 000 x g à 4 °C pendant 30 min.</li>
		<li>Filtrer le surnageant avec un filtre à membrane de 0,22 μm, puis le concentrer à l’aide d’une membrane d’ultrafiltration de 100 kD ou d’une colonne de fibres creuses (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Filtrer le concentré à travers un filtre à membrane de 0,22 μm, puis le centrifuger à 150 000 x g à 4 °C pendant 2 h à l’aide d’une ultracentrifugeuse (voir le tableau des matériaux) et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
		<li>Resuspendre les précipitations avec du PBS et les conserver à −80 °C. La solution peut maintenir la stabilité à long terme à −80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Préparation RBD-ST
<ol><li>Effectuez la transfection RBD-ST en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Choisir un système d’expression eucaryote approprié (p. ex., HEK293F) et cultiver les cellules pendant une nuit à 130 rpm à 37 °C après la récupération.</li>
		<li>Ajouter 20 μL de solution cellulaire HEK293F dans le compteur de cellules automatisé (voir le tableau des matériaux), noter le nombre de cellules, ajuster la concentration à 1 x 106 cellules/mL, puis cultiver les cellules à 130 rpm à 37 °C pendant 4 h.</li>
		<li>Filtrer le plasmide RBD-ST à travers un filtre à membrane de 0,22 μm et ajouter 300 μg de plasmides dans le milieu de culture cellulaire (voir le tableau des matériaux) jusqu’à ce que le volume final atteigne 10 mL; agiter pendant 10 s.</li>
		<li>Chauffer l’IPE (1 mg/mL, voir le tableau des matières) à 65 °C au bain-marie, mélanger 0,7 mL de PEI avec 9,3 mL de milieu de culture cellulaire et agiter par intermittence pendant 10 s. REMARQUE: Ne pas agiter vigoureusement la solution. Sinon, les bulles résultantes peuvent affecter l’efficacité de la transfection.</li>
		<li>Ajouter la solution plasmidique à la solution de PEI, agiter le mélange par intermittence pendant 10 s et l’incuber à 37 °C pendant 15 min.</li>
		<li>Ajouter le mélange à 280 mL de milieu de culture cellulaire et cultiver à 130 rpm à 37 °C pendant 5 jours.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuer la purification RBD-ST.<ol><li>Centrifuger les cellules à 6 000 x g à 25 °C pendant 20 min et recueillir le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
		<li>Remplir la colonne avec 2 mL d’agarose Ni-NTA (voir le tableau des matières) et la laver 3x avec 3x PBS.</li>
		<li>Ajouter l’imidazole (voir le tableau des matières) dans le surnageant cellulaire pour obtenir la concentration finale de 20 mM, et charger le surnageant cellulaire 2x.</li>
		<li>Ajouter 3 volumes de colonne (CV) de PBS contenant 20 mM d’imidazole pour le lavage et recueillir la fraction de lavage.</li>
		<li>élution de gradient avec 3 CV de PBS contenant des concentrations faibles à élevées (p. ex. 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) d’imidazole; éluer 2x pour chaque concentration.</li>
		<li>Utilisez SDS-PAGE21 pour identifier le RBD-ST dans différents gradients de concentration.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Bioconjugaison et purification OMV-RBD
<ol><li>Déterminer la concentration en protéines par la méthode BCA (voir le tableau des matériaux).<ol><li>Diluer en série la solution protéique standard de BSA de 2 mg/mL à 0,0625 mg/mL, diluer l’OMV-SC et le RBD-ST 10x purifiés, puis mélanger les solutions de travail BCA A et B (fournies dans la trousse de dosage) dans un rapport de 50:1 (v/v).</li>
		<li>Ajouter une solution de protéines diluées (25 μL/puits) et mélanger avec une solution de travail BCA (200 μL/puits); incuber à 37 °C pendant 30 min.</li>
		<li>Mesurer l’absorbance (DO) à 562 nm de chaque puits et calculer la concentration en protéines à partir de la courbe standard22.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuer la bioconjugaison de l’OMV-SC et du RBD-ST en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Mélanger OMV-SC et RBD-ST dans PBS à un rapport de 40:1 (p/p).</li>
		<li>Tourner verticalement pour mélanger le mélange pendant la nuit à 15 rpm à 4 °C. REMARQUE: Différents antigènes peuvent réagir dans des proportions différentes. On pourrait essayer différents rapports de réaction en fonction des caractéristiques de l’antigène.</li>
	</ol></li>
	<li>Vérifiez l’efficacité de la réaction.<ol><li>Préparer 10 μL d’OMV-SC, RBD-ST et le produit de réaction (étape 4.2.). Ajouter 2,5 μL de tampon de chargement 5x (voir le tableau des matières) et chauffer les échantillons à 100 °C pendant 5 min. Charger les échantillons dans le gel (10 μL/puits). Effectuer une électrophorèse à 60 V pendant 20 min et changer la condition à 120 V pendant 1 h.</li>
		<li>Transférer la protéine du gel aux membranes de transfert Western en PVDF (voir le tableau des matériaux) à 100 V pendant 70 min.</li>
		<li>Mettre la membrane dans du lait en poudre écrémé à 5 % / TBST et agiter pendant 1 h. Ensuite, laver 3x avec TBST pendant 5 min par lavage avec agitation.</li>
		<li>Mettre la membrane dans un anticorps His-Tag/TBST à 0,1 % (voir le tableau des matières) et agiter pendant 1 h, puis laver 3x avec TBST pendant 5 min par lavage en secouant.</li>
		<li>Mettre la membrane dans 0,02% d’anticorps IgG1 anti-souris (HRP)/TBST (voir le tableau des matières) et agiter pendant 40 min, puis laver 3x avec TBST pendant 5 min par lavage avec agitation.</li>
		<li>Ajouter une solution de chimiluminescence améliorée (voir le tableau des matériaux) et exposer la membrane.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuer la purification de l’OMV-RBD.<ol><li>Diluer 1 mL de solution d’OMV-RBD à réaction à 10 mL et centrifuger la dilution à 150 000 x g à 4 °C pendant 2 h.</li>
		<li>Utilisez une pipette pour jeter le surnageant et suspendre le résidu avec 10 ml de PBS. Centrifuger la suspension à 150 000 x g à 4 °C pendant 2 h.</li>
		<li>Jeter le surnageant et suspendre le résidu avec 1 mL de PBS. NOTE: Si la solubilité de l’antigène est beaucoup plus faible, le même effet de séparation peut être obtenu par chromatographie d’exclusion de taille19.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Caractérisation
<ol><li>Effectuez une diffusion dynamique de la lumière (DLS).<ol><li>Diluer les échantillons à une concentration de 100 μg/mL et ajouter 1 mL d’échantillon dans la cellule d’échantillon.</li>
		<li>Choisissez « Taille » pour « Type de mesure », « Protéines » pour « Matériau de l’échantillon », « Eau » pour « Dispersant », « 25 °C » pour « Température », puis chargez les échantillons et mesurez automatiquement23.</li>
	</ol></li>
	<li>Capturez des images à l’aide de la microscopie électronique à transmission (MET).<ol><li>Diluer les échantillons à 100 μg/mL. Prenez une grille de cuivre de 200 mailles, ajoutez-y 20 μL d’échantillon et laissez-la être absorbée pendant 10 minutes.</li>
		<li>Utilisez du papier filtre pour évacuer la solution, ajoutez 20 μL d’acétate d’uranyle à 3% au film de support et colorez pendant 30 s.</li>
		<li>Évacuer l’acétate d’uranyle et sécher le film naturellement à température ambiante pendant 1 h.</li>
		<li>Chargez les échantillons dans le système TEM (voir le tableau des matériaux) et capturez les images à 80 kV.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncating+the+structure+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+can+effectively+improve+poly-3-hydroxybutyrate+production%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776(2016).</li>
<li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090(2021).</li>
<li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923(2021).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Pour créer une plate-forme vaccinale à nanoparticules « Plug-and-Display », ClyA fusionné SC a été exprimé dans les souches BL21 (DE3), qui est l’un des modèles les plus largement utilisés pour la production de protéines recombinantes en raison de ses avantages dans l’expression des protéines24, de sorte qu’il y aurait suffisamment de fragments SC affichés à la surface des OMV pendant le processus de prolifération bactérienne. Dans le même temps, un antigène cible fusionné ST a été préparé pour le...

En tant que plate-forme vaccinale potentielle, les vésicules de membrane externe (OMV) ont attiré de plus en plus d’attention ces dernières années 1,2. Les OMV, principalement sécrétées naturellement par les bactéries à Gram négatif3, sont des particules sphériques à l’échelle nanométrique composées d’une bicouche lipidique, généralement de la taille de 20-300nm4. Les OMV contiennent divers composants bactériens parentaux, y compris des antigènes bactériens et des profils moléculaires associés à des agents pathogènes (PAMP), qui servent de potentialisateurs immunitaires solides5. Bénéficiant de leurs composants uniques, de la structure naturelle des vésicules et des grands sites de modification du génie génétique, les OMV ont été développés pour être utilisés dans de nombreux domaines biomédicaux, notamment les vaccins bactériens6, les adjuvants7, les médicaments d’immunothérapieanticancéreuse 8, les vecteurs d’administration de médicaments9 et les adhésifs antibactériens10.
La pandémie de SRAS-CoV-2, qui s’est propagée dans le monde entier depuis 2020, a fait payer un lourd tribut à la société mondiale. Le domaine de liaison au récepteur (RBD) dans la protéine de pointe (protéine S) peut se lier à l’enzyme 2 de conversion de l’angiotensine humaine (ACE2), qui intervient ensuite dans l’entrée du virus dans la cellule11,12,13. Ainsi, le TCSP semble être une cible de choix pour la découverte de vaccins14,15,16. Cependant, le TCSP monomère est peu immunogène et son faible poids moléculaire le rend difficile à reconnaître par le système immunitaire, de sorte que des adjuvants sont souvent nécessaires17.
Afin d’augmenter l’immunogénicité des TCSP, des OMV présentant des RBD polyvalents ont été construits. Les études existantes utilisant OMV pour afficher RBD fusionnent généralement RBD avec OMV pour être exprimé dans les bactéries18. Cependant, le TCSP est une protéine dérivée d’un virus, et l’expression procaryote est susceptible d’affecter son activité. Pour résoudre ce problème, le système SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), dérivé de Streptococcus pyogenes, a été utilisé pour former un isopeptide covalent avec OMV et RBD dans un système tampon conventionnel19. Le domaine SC a été exprimé avec la cytolysine A (ClyA) en tant que protéine de fusion par Escherichia coli issu de la bio-ingénierie, et ST a été exprimé avec RBD via le système d’expression cellulaire HEK293F. OMV-SC et RBD-ST ont été mélangés et incubés pendant la nuit. Après purification par ultracentrifugation ou chromatographie d’exclusion de taille (SEC), OMV-RBD a été obtenu.

<table><tbody><tr><td>Ampicilline sodique</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610028</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé</td><td>Countstar</td><td>BioTech</td><td></td></tr><tr><td>BCA kit de quantification des protéines</td><td>cwbio</td><td>cw0014s</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Touching Imaging System</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danamic Light Scattering</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano S90</td><td></td></tr><tr><td>Appareil d’électrophorèse</td><td>Cavoy</td><td>Power BV</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Buffers H 10X TBST Buffer</td><td>Sangon Biotech</td><td>C520009</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre pAb à souris IgG1</td><td>Abcam</td><td>ab97240</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de congélation à grande vitesse</td><td>Bioridge</td><td>H2500R</td><td></td></tr><tr><td>His-Tag souris mAb</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>2366s</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td>A600277</tr><tr><td>Isopropyl bêta-D-thiogalactopyranoside</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600118</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA His-Bind Superflow</td><td>Qiagen</td><td>70691</td><td></td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600669</td><td></td></tr><tr><td>OPM-293 Milieu de culture cellulaire</td><td>Opm biosciences</td><td>81075-001</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1 RBD-ST plasmide</td><td>Wuhan genecreat Technique</td><td></td><td></td>biologique</tr><tr><td>Tampon phosphate salin</td><td>ZSGB-bio</td><td>ZLI-9061</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylénimine Linéaire</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Échelle protéique précolorée</td><td>Thermo</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>pThioHisA ClyA-SC plasmide</td><td>Wuhan Genecreat technologie</td><td></td><td></td>biologique</tr><tr><td>PVDF Western Blot</td><td>Membranes Roche</td><td></td><td></td>03010040001</tr><tr><td>Systèmes de paillasse Quixstand (colonne à fibres creuses de 100 kD)</td>Tampon de chargement <td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE (5x)</td><td>Beyotime</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Supersignal west pico PLUS (solution de chimiluminescence améliorée)</td><td>Thermo</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>Instrument de suspension</td><td>Life Technology</td><td>Hula Mixer</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à transmission</td><td>Hitachi</td><td>HT7800</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>XPN-100</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre ultraviolet</td><td>Hitachi</td><td>U-3900</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610961</td><td></td></tr></tbody></table>

une plate-forme vaccinale à nanoparticules « plug-and-display » basée sur des vésicules de membrane externe présentant un domaine de liaison au récepteur du sras-cov-2

A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

Les nanoparticules biomimétiques obtenues à partir de bactéries ou de virus ont suscité un intérêt considérable dans la recherche et le développement de vaccins. Les vésicules de la membrane externe (OMV) sont principalement sécrétées par les bactéries à Gram négatif pendant la croissance moyenne, avec un diamètre nanométrique et une activité auto-adjuvante, ce qui peut être idéal pour l’administration du vaccin. Les OMV ont fonctionné comme un système d’administration à multiples facettes pour les protéines, les acides nucléiques et les petites molécules. Pour tirer pleinement parti des caractéristiques biologiques des OMV, les OMV dérivés d’Escherichia coli issus du bio-ingénierie ont été utilisés comme porteur et le domaine de liaison au récepteur du SARS-CoV-2 (RBD) comme antigène pour construire une plate-forme vaccinale « Plug-and-Display ». Les domaines SpyCatcher (SC) et SpyTag (ST) de Streptococcus pyogenes ont été appliqués aux OMV et RBD conjugués. Le gène de la cytolysine A (ClyA) a été traduit avec le gène SC en protéine de fusion après transfection plasmidique, laissant un site réactif à la surface des OMV. Après avoir mélangé RBD-ST dans un système tampon conventionnel pendant la nuit, une liaison covalente s’est formée entre les OMV et les RBD. Ainsi, un vaccin multivalent OMV a été obtenu. En les remplaçant par divers antigènes, la plateforme vaccinale OMVs peut afficher efficacement une variété d’antigènes hétérogènes, prévenant ainsi potentiellement rapidement les épidémies de maladies infectieuses. Ce protocole décrit une méthode précise pour construire la plateforme vaccinale OMV, y compris la production, la purification, la bioconjugaison et la caractérisation.

L’organigramme de ce protocole est illustré à la figure 1. Ce protocole pourrait être une approche générale de l’utilisation des OMV comme plate-forme vaccinale; Il suffit de choisir les systèmes d’expression appropriés en fonction du type d’antigènes.
La figure 2 présente un schéma de conception plasmidique réalisable. Le gène SC est connecté au gène ClyA via un linker flexible, tandis que ST se connecte à la terminaison 5' du gène R...

Le présent protocole décrit la bio-ingénierie des vésicules de membrane externe comme une plateforme vaccinale « Plug-and-Display », y compris la production, la purification, la bioconjugaison et la caractérisation.

Une plate-forme vaccinale à nanoparticules « plug-and-display » basée sur des vésicules de membrane externe présentant un domaine de liaison au récepteur du SRAS-CoV-2

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

La nanoscience peut améliorer efficacement la réponse immunitaire spécifique de l’antigène après avoir affiché des antigènes à la surface de Le principal avantage de cette plate-forme vaccinale peut permettre d’obtenir la plaque et l’affichage. En d’autres termes, la plate-forme est capable d’afficher la variété d’antigènes dans Cette méthode peut également être appliquée à d’autres nanoparticules biologiques pour afficher le moteur à des porteurs de taille nanométrique. Pour effectuer une transformation de cathéter espion de cytolysine A, commencez par ajouter cinq microlitres de solution plasmatique à 50 microlitres de souche compétente BL 21.Souffler doucement et laisser refroidir sur la glace pendant 30 minutes. Placez la solution pendant 90 secondes au bain-marie à 42 degrés Celsius, puis mettez immédiatement la solution mélangée sur de la glace pendant trois minutes. Ajouter 500 microlitres de milieu luria bertani à la suspension bactérienne et après mélange culture à 220 rotations par minute à 37 degrés Celsius pendant une heure.Ensuite, plaquez toute la plaque de gélose de luria bertani de transformation contenant de l’ampicilline et la culture pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Pour la production d’OMV spycatcher, commencez par isoler une seule colonie de la plaque à 20 millilitres de milieu luria bertani et cultivez pendant la nuit à 220 rotations par minute à 37 degrés Celsius. Incuber la solution bactérienne dans un milieu de deux litres et cultiver à 220 rotations par minute à 37 degrés Celsius pendant cinq heures jusqu’à ce que le stade de croissance logarithmique soit atteint.Ajouter l’isopropyl bêta D-IPTG pour obtenir la concentration finale de la solution bactérienne à 0,5 millimolaire, puis la culture pendant la nuit à 220 rotations par minute à 25 degrés Celsius. Ensuite, effectuez la purification OMV spycatcher. Commencez par centri fusionnant la solution bactérienne.Filtrez le surnageant avec un filtre à membrane de 0,22 micromètre, puis concentrez-le à l’aide d’une colonne de fibres creuses. Filtrer le concentré à travers un filtre à membrane de 0,22 micromètre, puis le fusionner à 150 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant deux heures à l’aide d’un fusible ultracentricentri et jeter le surnageant avec une pipette. Re-suspendre les précipitations avec PBS et les stocker à moins 80 degrés Celsius.Pour effectuer la transfection spytag RBD, commencez par sélectionner un système d’expression eucaryote approprié et cultivez les cellules pendant la nuit à 130 rotations par minute à 37 degrés Celsius après la récupération. Ajoutez 20 microlitres HEK 293F de solution cellulaire dans le compteur de cellules automatisé. Enregistrez le nombre de cellules, ajustez la concentration à une fois 10 à six cellules par millilitre.Et puis culture des cellules à 130 rotations par minute à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Filtrez le plasmide espion RBD à travers un filtre à membrane de 0,22 micromètre et ajoutez 300 microgrammes de plasmides dans le milieu de culture cellulaire jusqu’à ce que le volume final soit de 10 millilitres. Agiter pendant 10 secondes.Chauffer l’Île-du-Prince-Édouard à 65 degrés Celsius au bain-marie. Mélanger 0,7 millilitre de PEI avec 9,3 millilitres de milieu de culture cellulaire et agiter par intermittence pendant 10 secondes. Ajouter la solution plasmidique à la solution PEI.Agitez le mélange par intermittence pendant 10 secondes et incuberez-le à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ajouter le mélange à 280 millilitres de milieu de culture cellulaire et cultiver à 130 rotations par minute à 37 degrés Celsius pendant cinq jours. Ensuite, effectuez la purification du spytag RBD.Commencez par centri fusionnant les cellules à 6 000 fois G à 25 degrés Celsius pendant 20 minutes et utilisez une pipette pour recueillir le surnageant. Remplissez la colonne avec deux millilitres d’agarose NTA de nickel et lavez-la trois fois avec du PBS. Ajouter l’imidazole dans le surnageant cellulaire pour obtenir la concentration finale de 20 millimolaires, et charger le surnageant cellulaire.Ajouter trois volumes de colonne de PBS contenant 20 millimolaires d’imidazole pour le lavage et recueillir la fraction de lavage. Éluer à gradient avec trois volumes de colonne de PBS contenant des concentrations faibles à élevées d’imidazole éluer deux fois pour chaque concentration. Pour déterminer la concentration en protéines par la méthode BCA, diluez en série la solution de protéine BSA standard de deux à 0,0625 milligramme par millilitre, diluez 10 fois le spycatcher OMV purifié et l’étiquette espion RBD.Ensuite, mélangez les solutions de travail BCA A et B dans un rapport de 50 pour un. Ajouter la solution de protéines diluées et mélanger avec la solution de travail BCA. Incuber à 37 degrés pendant 30 minutes.Mesurez l’absorbance à 562 nanomètres de chaque puits et calculez la concentration en protéines à partir de la courbe standard. Pour effectuer la bioconjugaison d’OMV spycatcher et RBD spy tag, mélangez OMV spycatcher et RBD spytag et PBS à un ratio de 40 pour un. Tourner verticalement pour mélanger le mélange pendant la nuit à 15 rotations par minute à quatre degrés Celsius.Effectuer la purification d’OMV RBD à l’aide d’une solution PBS en utilisant une procédure similaire à la purification OMV spycatcher. Le schéma de conception du plasma montre que le gène spycatcher est connecté au gène cly A via un linker flexible tandis que le spytag se connecte aux cinq terminaux premiers du gène RBD avec un gène hys tag pour la purification et la vérification. Après l’ultracentrifugation, presque tout le spytag RBD n’ayant pas réagi est resté dans le surnageant.La deuxième ultracentrifugation n’a pas fourni d’autre avantage significatif par rapport à la première fois. Le diamètre hydrodynamique moyen z de l’OMV spycatcher était de 133 nanomètres alors qu’il était de 152,6 nanomètres pour OMV-RBD. Ces différences peuvent être dues au fait que le RBD augmente la taille des particules OMV après un affichage intensif.Les résultats de la TEM concordent avec la distribution granulométrique obtenue à partir des résultats de la DLS. La rotation pour mélanger le mélange est très importante. L’efficacité de la réaction peut être beaucoup plus faible sans rotation.

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Ce protocole décrit une procédure générale pour l'étude de liaison au récepteur recombinant domaine (RBD) basé vaccins sous-unitaires contre le SRAS. Il inclut des méthodes pour la transfection et l'expression des protéines dans les cellules 293T RBD, l'immunisation de souris avec RBD et la détection de l'activité de neutralisation de sérums de souris en utilisant un dosage établie SRAS neutralisation pseudovirus.

Protocole pour vaccins recombinants contre le SRAS RBD-base: préparation de protéines, vaccination des animaux et de détection de neutralisation

Cette vidéo présente une méthode permettant de générer des vaccins multivalents à vésicules de membrane externe (OMV). Des cellules de mammifères sont transfectées pour exprimer et sécréter des antigènes viraux fusionnés à un SpyTag et à un marqueur de polyhistidine. Ces antigènes sont ensuite purifiés à l’aide d’une colonne d’affinité d’acide nickel-nitrilotriacétique (Ni-NTA). L’antigène purifié est mélangé à des vésicules de membrane externe exprimant la protéine SpyCatcher (SC) liée à la...

Génération d’un vaccin multivalent à vésicules de la membrane externe

Nous avons conçu la protéine de capside du virus de l’hépatite E comme une NANOPARTICULE théranostiques (HEVNP). HEVNP auto assemble dans une cage icosaédrique stable en livraison muqueuse. Nous décrivons ici la modification de HEVNPs pour tumeur ciblage par mutation exposés à la surface des résidus cystéines, qui conjugue des ligands synthétiques qui lient spécifiquement les cellules tumorales.

Fonctionnalisation de surface des nanoparticules de Virus de l’hépatite E à l’aide de méthodes chimiques de conjugaison

Nous présentons ici un protocole visant à générer des particules pseudo dans un cadre de BSL-2 intégrant la protéine spike du syndrome respiratoire de virus hautement pathogènes Moyen-Orient et coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère. Ces particules pseudo contiennent un gène de rapporteur luciférase permettant la quantification de l’entrée du virus dans les cellules de l’hôte cible.

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Une méthode détaillée est fournie ici décrivant la purification, le repliement et la caractérisation des nanoparticules de protéines auto-assemblantes (SAPN) pour le développement de vaccins.

Production de E. coli-les nanoparticules de protéines auto-assemblantes exprimées pour les vaccins nécessitant une présentation de l'épitope trimmérique

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Détection d’épitopes sensibles à la neutralisation dans les antigènes affichés sur les vaccins à base de particules virales (VLP) à l’aide d’un test de capture

Dans ce protocole, les points quantiques conjugués au pic recombinant du SARS-CoV-2 permettent aux tests cellulaires de surveiller la liaison du pic à hACE2 au niveau de la membrane plasmique et l’endocytose ultérieure des protéines liées dans le cytoplasme.

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Le présent protocole décrit de nouveaux outils pour les tests de liaison SPR afin d’examiner la liaison CV-N à l’HA, à la glycoprotéine S, aux glycanes de type hybride apparentés et aux oligosaccharides à haute teneur en mannose. SPR est utilisé pour déterminer le KD pour lier le CV-N dimérique ou monomère à ces glycanes.

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Ici, nous décrivons un immunodosage fluorescent multiplex nouvellement développé qui utilise un système de cytométrie en flux à double rapporteur pour détecter simultanément deux épitopes uniques de protéine de pointe sur des particules virales intactes du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère sévère (SRAS-CoV-2) qui avaient été capturées par des microsphères magnétiques couplées à l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2.

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Nous présentons un protocole in vitro optimisé pour produire des particules semblables au virus du SRAS-CoV-2 qui imitent étroitement le virus authentique. Cette approche permet d’étudier les mécanismes d’infection, d’assemblage et de sortie virales sans les contraintes de nécessiter un laboratoire de biosécurité de niveau 3.

Production d’un système de particules semblable au virus SARS-CoV-2 pour étudier les cycles de vie viraux in vitro

Cet article décrit la méthodologie pour générer des particules pseudotypées de SARS-CoV-2 à l’aide d’un système de rapporteurs luciférase et son utilisation pour identifier les inhibiteurs d’entrée. Ces protocoles sont démontrés à l’aide de deux inhibiteurs d’entrée différents, une protéine de fusion humaine ACE2-Fc recombinante et le composé à petite molécule arbidol.

Procédures pour l’identification des inhibiteurs d’entrée du SARS-CoV-2 en tant qu’antiviraux potentiels à l’aide de pseudovirus à base de MLV

Découvrez la bio-ingénierie de vésicules de membrane externe comme plateforme vaccinale « plug-and-display ». Cette méthode permet d'afficher divers antigènes pour améliorer les réponses immunitaires spécifiques.

Une plate-forme vaccinale à nanoparticules plug-and-display basée sur des vésicules de membrane externe présentant un domaine de liaison au récepteur du SRAS-CoV-2 (Vidéo) | JoVE Journal

Une plate-forme vaccinale à nanoparticules « plug-and-display » basée sur des vésicules de membrane externe présentant un domaine de liaison au récepteur du SRAS-CoV-2

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