Transfert mitochondrial de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux de souris dans des ovocytes de souris âgés

Résumé

Ici, nous décrivons l’isolement des mitochondries à partir de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux de souris, puis nous transférons les mitochondries dans des ovocytes de souris âgés pour améliorer la qualité des ovocytes.

Résumé

En raison de la baisse de la quantité et de la qualité des ovocytes liée à l’âge, la fertilité des femmes de plus de 35 ans a fortement diminué. Les mécanismes moléculaires qui maintiennent la qualité des ovocytes restent flous, il est donc difficile d’augmenter le taux de natalité des femmes de plus de 35 ans à l’heure actuelle. Les ovocytes contiennent plus de mitochondries que n’importe quel type de cellule dans le corps, et tout dysfonctionnement mitochondrial peut entraîner une réduction de la qualité des ovocytes. Dans les années 1990, le transfert cytoplasmique d’ovocytes a connu un grand succès dans la reproduction humaine, mais s’est accompagné de controverses éthiques. La transplantation mitochondriale autologue devrait être une technique utile pour augmenter la qualité des ovocytes qui ont diminué en raison de l’âge. Dans la présente étude, nous avons utilisé des cellules souches dérivées du tissu adipeux de souris âgées comme donneur de mitochondries pour augmenter la qualité des ovocytes de souris âgées. La poursuite du développement de la technologie de transfert mitochondrial autologue fournira un traitement nouveau et efficace de l’infertilité chez les femmes âgées.

Introduction

L’un des facteurs importants qui affectent la fertilité féminine est le vieillissement des ovocytes ; La baisse de la qualité des ovocytes est la principale cause d’infertilité chez les femmes âgées. Cependant, la principale cause du vieillissement des ovocytes et le mécanisme moléculaire qui régule la qualité des ovocytes ne sont pas encore clairs. Des études antérieures ont indiqué que le nombre et la qualité des mitochondries sont impliqués dans le contrôle de la qualité des ovocytes et^{le développement} embryonnaire1,2,3. La diminution de l....

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche animale du troisième hôpital affilié de l’Université Soochow. Toutes les opérations respectent les directives appropriées de l’agence et de l’utilisation des animaux et les directives nationales. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et réactifs utilisés dans ce protocole.

1. Isolement et caractérisation de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ADSC) de souris âgées

1. Sacrifiez les souris....

Résultats

Dans ce protocole, nous avons isolé et caractérisé les ADSC à partir de graisse de souris (Figure 1). Pour obtenir des mitochondries isolées, la membrane cellulaire doit être perturbée à l’aide d’un homogénéisateur en verre. (Figure 2A). Il est important d’obtenir une fraction mitochondriale uniforme sans gros amas afin que le tube de micro-injection ne soit pas bloqué. D’abord, des pointes de pipette de 200 μL, puis de 10 μL, doivent être utilisées pour remettr.......

Discussion

Les ovocytes contiennent plus de mitochondries que n’importe quel type de cellule dans le corps, avec ~1-5 × 10⁵ numéros de copie d’ADNmt. Les mitochondries sont essentielles à la maturation des ovocytes, à la fécondation et au développement embryonnaire, ainsi, tout dysfonctionnement mitochondrial peut entraîner une diminution de la qualité des ovocytes. La diminution de la quantité et de la qualité mitochondriales est étroitement liée au vieillissement physiologique. Dans ce.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,05 % trypsine/EDTA	Gibco	25300054	Culture cellulaire
; 4 % paraformaldéhyde	beyotime	P0099	immunofluorescence
40 &mu ; Filtre cellulaire m	Corning	352340	Isolation ADSC
induction adipogénique	Cyagen	HUXXC-90031	Différenciation multidirectionnelle
Solution de coloration rouge d’alizarine	Sigma	A5533	Différenciation multidirectionnelle
Anticorps contre CD29	BD Biosciences	Analyse de flux	558741
Anticorps contre CD34	BD Biosciences	Analyse	flux
Anticorps contre CD90	BD Biosciences	Analyse de	flux
Anticorps contre HLA-DR	BD Biosciences	555560	Analyse de flux
&bêta ;-actine	Abcam	ab-8226	Test de fonction mitochondriale
BSA	Sigma	V900933	immunofluorescence
CCCP	Solarbio	C6700	mitochondries JC-1 analyse de flux
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711	qPCR
collagénase type I	Sigma	SCR103	ADSC isolation
DAPI  ;	Invitrogen	D1306	immunofluorescence
DMEM-F12	Gibco	11320033	Culture cellulaire
DMSO	Sigma	276855	mitochondries JC-1 analyse de flux
EGTA	Sigma	324626	Isolement des mitochondries
FBS	Gibco Gibco	10100147	Cell
Culture Cytométrie en flux	BD Biosciences	FACSCanto& commerce; II	Caractéristiques des ADSC
microscope à fluorescence	leica	DM2500	immunofluorescence
gélatine	Sigma	48722	Différenciation multidirectionnelle
tube d’homogénéisation du verre	Sangon	F519062	Isolement des mitochondries
hCG	Aibei	M2520	Superstimulation ovarienne
hyaluronidase	Sigma	H1115000	Superstimulation ovarienne
; Microscope inversé	Olympus	IMT-2
Microinjection Isolement des mitochondries	Sigma	CS0760	Mitochondries JC-1 Analyse de flux
JC-1	Sigma	T4069	Test de la fonction mitochondriale
KCl	Sigma	P5405	Transfert de mitochondries
KH2PO4	Sigma	P5655	Transfert
de mitochondriesLaminB	Abcam	ab-16048	Test de fonction mitochondriale
M16 Medium	Sigma	M7292	culture cellulaire embryonnaire
M2 Medium	Sigma	M7167	culture cellulaire embryonnaire
mannitol	Sigma	M9546	Transfert de mitochondries
Microinjecteur	Olympus+ eppendorf	IX73	Transfert de mitochondries
MitoTracker rouge	Invitrogen	M22425	Coloration des mitochondries
MOPS	Sigma	M1442	Isolement des mitochondries
Médiateur neurofilamentaire polypeptide (NFM)	Santa Cruz Biotechnology	sc-16143	Différenciation multidirectionnelle
induction neurogène	Gibco	A1647801	Différenciation multidirectionnelle
Enolase spécifique des neurones (NSE)	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	Différenciation multidirectionnelle
Huile rouge O	Sangon	E607319	Différenciation adipogénique
huile rouge O solution	Sigma	O1516	Différenciation multidirectionnelle
induction ostéogénique	Cyagen	HUXXC-90021	Différenciation multidirectionnelle
PBS (phosphate tamponné salin	Hyclone	SH30256.LS	Culture cellulaire
pénicilline et streptomycine	Hyclone	SV30010	Culture cellulaire
PMSG	Aibei	M2620	Superstimulation ovarienne
protéase Cocktail inhibiteur	Sigma	P8340	Isolement des mitochondries
saccharose	Sigma	V900116	Isolement des mitochondries
Tris	Sigma	648314	Isolement des mitochondries
Tris-HCl	Sigma	108319	Transfert des mitochondries
Triton X-100	beyotime	P0096	immunofluorescence
VDAC	Abcam	ab-14734	Test de la fonction mitochondriale

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