Mesure de la compressibilité de la cellule et du noyau basée sur un microdispositif acoustofluidique

La mécanique cellulaire joue un rôle important dans les métastases tumorales, la transformation maligne des cellules et la radiosensibilité. La méthode acoustofluidique permet de réaliser des mesures rapides et non destructives à l’état suspendu. Cette technique peut être utilisée pour refléter le changement d’autocompressibilité au cours de la transition épithéliale à mésenchymateuse et séparer les cellules tumorales circulantes, montrant ses perspectives d’application dans le diagnostic du cancer.

Pour commencer, liez le bloc PDMS à la puce en perforant des trous dans le bloc PDMS pour les orifices d’entrée et de sortie avec une aiguille creuse d’un millimètre de diamètre. Ensuite, placez les blocs PDMS et la puce avec l’arrière vers le haut dans un nettoyeur plasma pendant une minute. Après avoir aligné les trous sur les blocs PDMS avec l’entrée et la sortie de la puce, appuyez doucement sur les blocs PDMS sur la puce pendant 15 secondes, ce qui entraîne une liaison entre les blocs PDMS et la surface de la puce.

Pour connecter le cathéter PTFE à la puce, coupez deux morceaux de cathéter d’un diamètre intérieur de 0,8 millimètre et d’une longueur de 10 centimètres. Pliez une aiguille en acier inoxydable d’un diamètre intérieur de 0,7 millimètre et d’une longueur de 1,5 centimètre sur 90 degrés en forme de L et reliez-la à une extrémité du cathéter. Insérez les aiguilles en acier inoxydable dans les trous des blocs PDMS.

Pour l’entrée, connectez une aiguille de distribution de calibre 19 à l’autre extrémité du cathéter comme connecteur pour une seringue. Ensuite, injectez de l’eau désionisée pour tester l’étanchéité de l’ensemble du canal. Pour un assemblage céramique piézoélectrique, sélectionnez des feuilles de céramique piézoélectriques prédécoupées d’une largeur de cinq millimètres.

Ensuite, soudez des fils des deux côtés de la céramique piézoélectrique à une extrémité. Collez la céramique piézoélectrique au milieu du dos de la puce en plaçant une goutte de colle cyanoacrylate sur la céramique piézoélectrique. Lissez la colle avec le cure-dent et retirez l’excès de colle.

Ensuite, appuyez rapidement sur la puce et continuez à appuyer pendant environ une minute. Pour monter le micro-dispositif, découpez un morceau de PDMS comme base du micro-dispositif et collez un côté de la base aux blocs PDMS d’entrée et de sortie et l’autre côté à une lame de verre transparente à l’aide de ruban adhésif double face. Fixez l’ensemble du microdispositif à l’étage du microscope pour maintenir la puce dans un plan focal.

Pour préparer les solutions de particules étalons de polystyrène, ajoutez 0,05 millilitre de solution de particules de polystyrène à 10 millilitres de PBS et mélangez bien. Préparez ensuite les suspensions cellulaires en lavant les cellules adhérentes à 90% de confluence avec le PBS. Ajouter 500 microlitres de 0,25 trypsine pendant une à deux minutes à température ambiante.

Après avoir retiré la trypsine, ajouter un millilitre de milieu complet et former une suspension cellulaire par pipetage. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à 100 G pendant cinq minutes. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 0,5 à un millilitre de PBS afin d’obtenir une suspension cellulaire.

Ensuite, les cellules ont été comptées avec un hémocytomètre et la concentration était d’environ 300 à 500 000 cellules par millilitre. Après une préparation de la suspension du noyau cellulaire comme démontré précédemment, retirer le surnageant et ajouter 200 microlitres de réactif d’extraction de protéines cytoplasmiques A par palette cellulaire de 20 microlitres et bien mélanger. Ensuite, vortex le mélange ci-dessus à 220 G pendant cinq secondes et placer sur un bain de glace pendant 10 minutes.

Ensuite, ajoutez 10 microlitres de réactif d’extraction de protéines cytoplasmiques B à la solution après l’incubation. Après le vortex, placer sur un bain de glace pendant une minute et vortex à nouveau à 220 G pendant cinq secondes. Enfin, centrifuger à 1000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Retirez le surnageant et remettez la palette en suspension dans un millilitre de PBS. Puis centrifuger à 1000 G à quatre degrés Celsius pendant quatre minutes. Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension dans 100 microlitres de PBS comme suspension de noyau cellulaire.

Ajouter le bleu de trypan à la suspension du noyau cellulaire ci-dessus et colorer à température ambiante pendant quatre minutes. Ensuite, comptez le nombre de noyaux sous le microscope inversé avec un objectif 10x. Diluer la suspension du noyau cellulaire ci-dessus avec un tampon PBS à une concentration de 200 à 300 000 noyaux par millilitre.

Ensuite, filtrez la suspension du noyau cellulaire à travers un tamis de 70 micromètres. Pour configurer le système de mesure, allumez la source lumineuse du microscope et ouvrez le logiciel de la caméra. Utilisez l’objectif 4x pour trouver la position médiane du microcanal, c’est-à-dire la position de la céramique piézoélectrique.

Après avoir connecté les fils, soudez-les respectivement aux bornes positive et négative de la sortie du générateur de signaux de la céramique piézoélectrique. Placez ensuite la seringue sur la pompe de micro-injection et connectez-la au cathéter d’admission. Pour recueillir le liquide du microcanal, placez un petit récipient à l’extrémité du cathéter de sortie.

Pour déterminer les paramètres de mesure, aspirez la solution de particules de polystyrène avec la seringue. Injectez ensuite la solution dans le microcanal de la puce tout en évitant les bulles d’air et dans le microcanal de la puce pour assurer une mesure précise. Réglez la sortie du générateur de signaux sur un signal de signe avec une fréquence d’un mégahertz et une tension de crête à crête de 10 volts jusqu’à ce qu’il soit observé que les particules se déplacent vers la ligne médiane du microcanal et restent en mouvement vers l’avant le long de la ligne médiane après avoir atteint la ligne médiane.

Après avoir mélangé une cellule millilitre ou une suspension de noyau avec la solution de particules étalon dans un rapport de un à un, injectez-la dans le microcanal avec une seringue pour mesurer les cellules et les noyaux. Démarrez l’enregistrement avec la caméra CCD lorsque les cellules ou les noyaux entrent dans le champ de vision et allumez le générateur de signaux. Ensuite, rincez le microcanal avec de l’eau désionisée, de l’alcool à 75% et de l’eau désionisée en séquence pour une utilisation ultérieure.

Le mouvement des cellules et des particules a été observé sous l’action de la force du champ acoustique vers la ligne médiane du microcanal à différents intervalles de temps. Le calcul de l’énergie, de la densité et de la compressibilité de la cellule a été effectué et la densité d’énergie acoustique et la trajectoire de mouvement mesurée pour la particule ont été obtenues à partir du meilleur résultat d’ajustement. Les noyaux de haute pureté et intacts ont été isolés des cellules et la mesure de la compressibilité du noyau a été obtenue en obtenant la trajectoire de mouvement du noyau.

La compressibilité de différents types de cellules cancéreuses et de cellules après une EMT induite par un médicament ou une irradiation aux rayons X avec différentes doses a été mesurée et comparée. Les cellules mesurées ont été recueillies et il a été constaté qu’il n’y avait pas de différence significative dans la prolifération et la viabilité cellulaires par rapport au groupe non traité après 48 heures de culture. Indiquant que la mesure de compressibilité n’a aucun effet sur la prolifération et la survie des cellules.

Le plus important est d’affiner la fréquence du signal jusqu’à ce que l’on observe que les particules se déplacent vers la ligne médiane du microcanal.