Name: Synthèse de protéines acellulaires à partir d’extraits cellulaires déficients en exonucléase utilisant des modèles d’ADN linéaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Découvrez la synthèse de protéines acellulaires à partir d'extraits d'E. coli BL21 Rosetta2 déficients en exonucléase V utilisant des modèles d'ADN linéaires. Cette méthode accélère le prototypage sans clonage.

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Ici, nous montrons que le lysat cellulaire préparé à partir d’E. coli BL21 Rosetta2 avec un knockout génomique pour l’opéron recB ou recBCD soutient une expression protéique élevée à partir de modèles d’ADN linéaires. Ce protocole élabore une procédure d’étalonnage du lysat étape par étape spécifique pour les modèles d’ADN linéaire (Figure 2), qui est une étape critique qui conduit à l’expression élevée des promoteurs σ70 dans l’ADN linéaire, atteignant des niveaux...

Les systèmes de synthèse de protéines acellulaires (CFPS) sont de plus en plus utilisés comme méthode rapide, simple et efficace pour l’ingénierie des biocapteurs, la fabrication décentralisée et le prototypage de circuits génétiques1. En raison de leur grand potentiel, les systèmes CFPS sont régulièrement utilisés dans le domaine de la biologie synthétique. Cependant, jusqu’à présent, les systèmes CFPS reposent sur des plasmides circulaires qui peuvent empêcher la technologie d’atteindre son plein potentiel. La préparation de l’ADN plasmidique dépend de nombreuses étapes chronophages lors du clonage et de grandes quantités d’isolement de l’ADN. D’autre part, l’amplification PCR à partir d’un plasmide, ou d’un modèle d’ADN synthétisé, peut être utilisée pour préparer simplement des modèles CFPS en quelques heures 2,3. Par conséquent, l’application de l’ADN linéaire offre une solution prometteuse pour CFPS. Cependant, l’ADN linéaire est rapidement dégradé par les exonucléases naturellement présentes dans les extraits cellulaires4. Il existe des solutions qui répondent à ce problème, telles que l’utilisation de la protéine λ-phage GamS5 ou de l’ADN contenant des sites Chi6 comme agents protecteurs, ou la protection directe de l’ADN linéaire par modification chimique de ses extrémités 2,7,8,9. Toutes ces méthodes nécessitent des suppléments à l’extrait cellulaire, qui sont coûteux et prennent beaucoup de temps. On sait depuis longtemps que le complexe exonucléase V (RecBCD) dégrade l’ADN linéaire dans les lysats cellulaires4. Récemment, nous avons montré que l’ADN linéaire peut être beaucoup mieux protégé dans les lysats contre les cellules assommées pour les gènes exonucléases (recBCD)10.
Dans ce protocole, les étapes de préparation des lysats acellulaires à partir de la souche E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD par lyse par sonication sont décrites en détail. La lyse par sonication est une technique courante et abordable employée par plusieurs laboratoires11,12. Les extraits produits à partir de cette souche n’ont pas besoin de l’ajout d’un composant supplémentaire ou d’une modification du modèle d’ADN pour soutenir l’expression à partir de modèles d’ADN linéaires. La méthode repose sur l’étape essentielle de l’optimisation de la mémoire tampon pour les extraits cellulaires spécifiquement pour l’expression linéaire de l’ADN à partir de promoteurs natifs d’E. coli. Il a été démontré que cette optimisation tampon spécifique pour l’expression linéaire de l’ADN est la clé pour que les promoteurs natifs σ70 produisent des protéines élevées sans protéine GamS ou supplémentation en ADN Chi, évitant même la purification des produits de PCR10. La concentration optimale de Mg-glu pour l’expression linéaire de l’ADN s’est avérée similaire à celle de l’ADN plasmidique. Cependant, la concentration optimale de K-glu a montré une différence substantielle entre l’ADN linéaire et plasmidique, probablement due à un mécanisme lié à la transcription10. La fonctionnalité des protéines exprimées à l’aide de cette méthode a été démontrée pour plusieurs applications, telles que le criblage rapide des commutateurs de maintien et l’évaluation de l’activité des variantes enzymatiques10.
Ce protocole fournit une solution simple, efficace et rentable pour l’utilisation de modèles d’ADN linéaire dans les systèmes sans cellules E. coli en utilisant simplement des extraits de cellules ΔrecBCD mutantes et un étalonnage spécifique pour l’ADN linéaire comme modèle.

<table><tbody><tr><td>Bouillon 2-YT</td><td>Invitrogen</td><td>22712020</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubes Safe-Lock</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1,5 mL Microtube</td></tr> à <tr><td>fond carré 384 puits</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>3PGA (D-(-)-3-Acide phosphoglycérique disodique)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>Joint de plaque adhésive</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td></td><td></td>232701</tr><tr><td>Agar</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td></td></tr><tr><td>ATP (adénosine 5'-triphosphate disodium sel hydraté)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2</td><td>Merck Millipore</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 & Delta ; recB</td><td>addgene</td><td>176582</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 & Delta ; recBCD</td><td>Addgene</td><td>176583</td><td></td></tr><tr><td>cAMP (adénosine 3' 5'-monophosphate cyclique)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>CoA (hydrate de coenzyme A)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>Corning 15 mL Tubes à centrifuger en PP, Rack emballé avec capuchon CentriStar, Stérile</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>Tube de 15 mL</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger en PP Corning de 50 mL, fond conique avec capuchon CentriStar, Tube stérile</td><td>430828 Corning</td><td></td> de <td>50 mL</td></tr><tr><td>CTP (Cytidine 5'-triphosphate, sel disodique hydrate)</td><td>Alfa Aesar</td><td>&nbsp ; J62238</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Acide folinique (sel de calcium d’acide folinique solide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanosine 5 ?-Triphosphate,&nbsp ; Sel disodique)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>371701</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp ; H3375</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate dibasique K (K2HPO4)</td><td>Carl Roth</td><td>231-834-5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate monobasique K (H2KO4P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamate</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17232</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutamate&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Unité de filtre à seringue, 0,22 & micro ; m, polyéthersulfone</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>filtre à membrane 0,22 & micro ; m</td></tr><tr><td>Monarch PCR & Kit de nettoyage de l’ADN</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td>PCR & Kit de nettoyage de l’ADN</td></tr><tr><td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td><td>NEB</td><td>T1010S</td><td>Plasmid Miniprep</td></tr><tr><td>Kit NAD (B-nicotinamide adénine dinucléotide hydraté)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>Norme FITC traçable par le NIST</td><td>Invitrogen</td><td>F36915</td><td>NIST-FITC</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740414.1</td><td>Plasmide Maxiprep Kit</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>Biotek&nbsp ;</td><td>Synergy HTX</td><td></td></tr><tr><td>Protéine EGFP recombinante purifiée</td><td>Chromotek</td><td>egfp-250</td><td>eGFP</td></tr><tr><td>recombinant Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>DNA polymérase</td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492L</td><td>DNA polymérase</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Thermo</td><td>Q32850</td><td>dosage fluorométrique avec colorant de liaison à l’ADN</td></tr><tr><td>RTS Amino Acid Sampler</td><td>biotechrabbit</td><td>BR1401801</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>Eau</td><td></td><td></td> stérile <td>Eau purifiée du système Millipore RiOs 8, stérilisée par autoclavage.</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Produits des sciences de la vie Cytiva</td><td>17-1321-01&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>ARNt</td><td>Roche</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>Processeur à ultrasons Cellule vibrante VC-505</td><td>SONICS</td><td>VC505</td><td>Sonicateur</td></tr><tr><td>UTP Na3 (Uridine 5'-triphosphate, hydrate de sel trisodique)</td><td>Acros Organics&nbsp ;</td><td></td><td></td>226310010</tr><tr><td>Eau, sans nucléase</td><td>Thermo</td><td>R0581</td><td>Eau sans nucléase</td></tr></tbody></table>

synthèse de protéines acellulaires à partir d’extraits cellulaires déficients en exonucléase utilisant des modèles d’adn linéaires

Cell-Free Protein Synthesis from Exonuclease-Deficient Cellular Extracts Utilizing Linear DNA Templates

La synthèse protéique acellulaire (CFPS) est récemment devenue très populaire dans le domaine de la biologie synthétique en raison de ses nombreux avantages. L’utilisation de modèles d’ADN linéaires pour CFPS permettra à la technologie d’atteindre son plein potentiel, réduisant ainsi le temps expérimental en éliminant les étapes de clonage, de transformation et d’extraction plasmidique. L’ADN linéaire peut être amplifié rapidement et facilement par PCR pour obtenir des concentrations élevées du modèle, évitant ainsi une toxicité potentielle d’expression in vivo . Cependant, les matrices d’ADN linéaires sont rapidement dégradées par les exonucléases naturellement présentes dans les extraits cellulaires. Plusieurs stratégies ont été proposées pour s’attaquer à ce problème, telles que l’ajout d’inhibiteurs de nucléases ou la modification chimique des extrémités linéaires de l’ADN pour la protection. Toutes ces stratégies coûtent du temps et des ressources supplémentaires et n’ont pas encore atteint des niveaux d’expression protéique proches du plasmide. Un protocole détaillé pour une stratégie alternative est présenté ici pour l’utilisation de modèles d’ADN linéaire pour CFPS. En utilisant des extraits cellulaires de cellules knock-out déficientes en exonucléase, les modèles d’ADN linéaires restent intacts sans nécessiter de modifications finales. Nous présentons les étapes de préparation du lysat cellulaire à partir de la souche Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD par lyse de sonication et étalonnage tampon pour Mg-glutamate (Mg-glu) et K-glutamate (K-glu) spécifiquement pour l’ADN linéaire. Cette méthode est capable d’atteindre des niveaux d’expression protéique comparables à ceux de l’ADN plasmidique dans E. coli CFPS.

Des résultats représentatifs sont présentés ici après calibration du lysat pour des niveaux optimaux de Mg-glutamate et de K-glutamate séparément pour l’ADN linéaire et plasmidique (Figure 1). La concentration optimale de Mg-glutamate est similaire dans les extraits de Δ recB et ΔrecBCD à 8 mM (Figure 1B). Cependant, la concentration optimale de K-glutamate pour l’ADN plasmidique est de 140 mM, tandis que la concentration optimale de K-glutamat...

Un protocole pour la préparation et l’étalonnage tampon d’extraits cellulaires de souches knockout d’exonucléase V d’Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD et ΔrecB) est présenté ici. Il s’agit d’une approche rapide, facile et directe pour l’expression dans les systèmes de synthèse de protéines acellulaires utilisant des modèles d’ADN linéaires.

Synthèse de protéines acellulaires à partir d’extraits cellulaires déficients en exonucléase utilisant des modèles d’ADN linéaires

Cell-free protein synthesis (CFPS) has recently become very popular in the field of synthetic biology due to its numerous advantages. Using linear DNA ...

Le protocole est très important car il permet une utilisation rapide, facile et directe des modèles d’ADN linéaires dans les systèmes de synthèse de protéines acellulaires, même à partir de paramètres E. coli natifs. Les principaux avantages sont le gain de temps en évitant le clonage, les modifications chimiques des extrémités linéaires de l’ADN et les suppléments protecteurs comme l’ADN gamma ou chi. Comme des extraits de synthèse auto-déclarés sont en cours de développement pour différents organismes d’intérêt, notre méthode présente un moyen d’accélérer le prototypage de ces extraits en utilisant l’ADN linéaire.Pour commencer, séquiez la souche BL21 Rosetta-2 delta recBCD de moins 80 degrés Celsius sur un stock de glycérol 2x YTP contenant 10 microgrammes par millilitre de chloramphénicol et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ensuite, inoculer une seule colonie de la plaque de gélose dans un peu plus de 40 millilitres de 2x YTP complété par 10 microgrammes par millilitre de chloramphénicol et incuber pendant une nuit à 37 degrés Celsius avec agitation de 200 tr / min. Ensuite, faites une sous-culture en diluant la culture de nuit 100 fois dans quatre litres de média frais 2x YTP contenant 10 microgrammes par millilitre de chloramphénicol.Diviser les quatre litres du média en quatre fioles distinctes. Incuber à 37 degrés Celsius, 200 tr / min, pendant environ trois à quatre heures de croissance pour atteindre une densité optique de 1,5 à 2,0. Mettez la culture sur de la glace, faites tourner les cellules à 5 000 G pendant 12 minutes à quatre degrés Celsius, puis jetez le surnageant par décantation.Ensuite, remettez en suspension les granulés de la cellule dans 800 millilitres de S30A refroidi avec du DTT. Encore une fois, faites tourner les cellules à 5 000 G pendant 12 minutes à quatre degrés Celsius comme démontré précédemment et jetez le surnageant par décantation. Après avoir remis en suspension les granulés de cellules dans 160 millilitres de S30A refroidi avec du DTT, transférer les cellules dans des tubes de 50 millilitres refroidis et prépesés.Faites tourner les cellules à 2000 G pendant huit minutes à quatre degrés Celsius, puis jetez le surnageant par décantation. Encore une fois, faites tourner les cellules à 2000 G pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius, puis retirez soigneusement le surnageant restant à l’aide d’une pipette. Ensuite, remesurez le poids du tube pour calculer le poids de la pastille de cellule et maintenez les pastilles de la cellule à moins 80 degrés Celsius.Après avoir prélevé les granulés de la cellule à moins 80 degrés Celsius, décongelez-les sur de la glace pendant une à deux heures et remettez en suspension les granulés de la cellule dans 0,9 millilitre de S30A avec un tampon DTT par gramme de poids de la pastille de cellule. Ensuite, pipeter lentement pour remettre les cellules en suspension, en évitant autant que possible la mousse supérieure. Placez des aliquotes d’un millilitre des cellules en suspension dans des microtubes de 1,5 millilitre et conservez-les sur de la glace ou un bloc froid pré-réfrigéré à quatre degrés Celsius.Ensuite, sonicez chaque tube dans un sonicateur avec une configuration de 20% d’amplitude pendant trois cycles et faites tourner le lysat à 12 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir recueilli le surnageant à l’aide d’une pipette, transférer dans un tube de 50 millilitres. Incuber le lysat cellulaire à 37 degrés Celsius à 200 RPM agitation pendant 80 minutes.Après avoir filé le lysat et recueilli le surnageant dans des microtubes pré-refroidis de 1,5 millilitre, aliquote 30 microlitres dans des tubes PCR à 8 bandes pré-refroidis, tout en gardant tous les tubes sur la glace. Congeler les aliquotes de lysat sur de la glace sèche et les conserver à moins 80 degrés Celsius. Préparez un mélange maître conformément à l’onglet de préparation du tampon tel que décrit dans le manuscrit.Pour un volume de réaction de 10,5 microlitres, ajouter 1,05 microlitre de différentes concentrations de Mg-glutamate et 9,45 microlitres du mélange principal et mélanger doucement. Pipeter 10 microlitres des réactions ci-dessus dans une microplaque à fond carré de 384 puits et la couvrir à l’aide d’un joint adhésif. Mesurer l’expression des gènes sous forme de sortie de fluorescence en enregistrant les données de fluorescence avec un lecteur de plaque à intervalles réguliers pendant huit heures d’incubation à 30 degrés Celsius avec agitation orbitale continue à 307 cycles par minute.Après avoir identifié la concentration de Mg-glutamate qui donne la valeur de fluorescence la plus élevée au point final, procédez à l’étalonnage du K-glutamate. Exécutez l’expérience et identifiez la valeur de fluorescence la plus élevée parmi les concentrations de K-glutamate testées, identifiant ainsi la composition tampon optimale pour le Mg-glutamate et le K-glutamate pour ce lysat. Une fois les valeurs de Mg-glutamate et de K-glutamate établies, préparer des tubes mères de la composition tampon optimisée en fonction du volume de lot obtenu.Après avoir calculé le nombre de tubes tampons nécessaires, aliquote 38 microlitres par tube et stocker à moins 80 degrés Celsius. Tout d’abord, étiquetez un microtube de 1,5 millilitre pour la préparation optimale du mélange principal. Ajouter les volumes corrects du tampon et du lysat et mélangez-les doucement.Ensuite, pipeter d’abord les échantillons d’ADN, suivis d’eau sans nucléase et, enfin, du mélange maître optimal. Mélangez doucement la réaction acellulaire avec une pipette juste avant de l’ajouter au lecteur de plaques et évitez les bulles. Après avoir configuré les réactions dans le lecteur de plaques, les exécutions cinétiques ont enregistré des données de fluorescence à intervalles réguliers pendant huit heures d’incubation à 30 degrés Celsius avec agitation orbitale continue à 307 cycles par minute.Après calibration du lysat, la concentration optimale de Mg-glutamate était similaire à huit millimolaires dans les extraits pour l’ADN linéaire et plasmidique. Cependant, la concentration optimale de K-glutamate pour l’ADN plasmidique est de 140 millimolaires, tandis que la concentration optimale de K-glutamate pour l’ADN linéaire est de 20 millimolaires. Après les étapes d’étalonnage, les niveaux d’expression de GFP ont été comparés entre l’ADN linéaire et plasmidique dans les extraits de type sauvage, delta recB et delta recBCD.L’expression de la GFP à partir de l’ADN linéaire a atteint respectivement 102% et 138% de l’expression de l’ADN plasmidique dans les extraits de souches delta recB et delta recBCD. Les choses les plus importantes dans le protocole sont la lyse de sonication de la cellule et les étapes d’étalonnage du tampon séparément pour l’ADN linéaire et plasmidique, en particulier lors de l’utilisation des paramètres natifs. Cette technique permettrait d’accélérer les tests de conceptions biologiques dans des systèmes acellulaires, par exemple, le criblage de biocapteurs, d’enzymes et de voies, ou le prototypage de circuits génétiques synthétiques.

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Un obstacle majeur à des analyses biochimiques des ribosomes contenant naissante peptidyl-ARNt a été la présence de ribosomes d'autres dans les mêmes échantillons, les ribosomes pas impliqué dans la traduction de la séquence d'ARNm spécifiques en cours d'analyse. Nous avons développé une méthodologie simple pour purifier, en exclusivité, les ribosomes contenant la naissante peptidyl-ARNt d'intérêt.

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Cet article présente une méthode sensible appelée Circle-Seq pour purifier l’ADN circulaire extrachromosomique (eccDNA). La méthode comprend la purification en colonne, l’élimination de l’ADN chromosomique linéaire restant, l’amplification en cercle roulant et le séquençage à haut débit. Circle-Seq est applicable au criblage à l’échelle du génome de l’ADNcc eucaryote et à l’étude de l’instabilité du génome et de la variation du nombre de copies.

Purification de l&#39;ensemble du génome de l&#39;ADN extrachromosomique circulaire à partir de cellules eucaryotes

Nous décrivons une procédure simple lithographique pour l’immobilisation des molécules d’ADN gène-longueur sur une surface, ce qui peut être utilisée pour réaliser des expériences d’expression de gène acellulaire sur biopuces.

Surface-immobilisation fonctionnelle des gènes à l’aide de la lithographie de déplacement multipas Strand

Systèmes d’expression acellulaires sont des outils puissants et rentables pour la synthèse de haut débit et la présélection des protéines importantes. Nous décrivons ici la préparation du système d’expression de protéine acellulaire à l’aide de Vibrio natriegens pour la production de protéine rapide à l’aide de l’ADN plasmidique, ADN linéaire et messagère.

Acellulaire Protein Expression utilisant la rapide croissance bactérie Vibrio natriegens

Nous cloner et analyser les gènes des reporters générant des ARN circulaires. Ces gènes reporter sont plus grands que les constructions pour analyser l’épissage linéaire et contenir des éléments Alu. Pour étudier les ARN circulaires, les constructions sont transfected dans les cellules et l’ARN résultant est analysé à l’aide de RT-PCR après l’élimination de l’ARN linéaire.

Utilisation d’un élément Alu contenant des minigènes pour analyser les ARN circulaires

L’étude décrit un protocole pour créer de grandes quantités (μg-mg) d’ADN pour des campagnes de dépistage de protéines à partir de fragments de gènes synthétiques sans clonage ni utilisation de cellules vivantes. Le gabarit minimal est digéré et circularisé de manière enzymatique, puis amplifié à l’aide d’une amplification de cercle roulant isotherme. Des réactions d’expression sans cellules pourraient être effectuées avec le produit non purifié.

Méthodes enzymatiques rapides pour l’amplification de modèles linéaires minimaux pour le prototypage de protéines à l’aide de systèmes sans cellules

Ce protocole décrit une méthode rapide et simple pour produire du lysat bactérien pour l’expression génique sans cellule, en utilisant une souche modifiée d’Escherichia coli et ne nécessitant que du matériel de laboratoire standard.

Production rapide, abordable et simple de lysat sans cellules bactériennes

Des parties génétiques bien caractérisées sont nécessaires à la conception de nouveaux circuits génétiques. Nous décrivons ici une méthode rentable et à haut débit pour caractériser rapidement des parties génétiques. Notre méthode réduit les coûts et le temps en combinant des lysats acellulaires, de l’ADN linéaire pour éviter le clonage et de la manipulation acoustique des liquides pour augmenter le débit et réduire les volumes de réaction.

Caractérisation rapide de parties génétiques avec des systèmes acellulaires

Ce travail décrit la préparation de l’extrait cellulaire d’Escherichia coli (E. coli) suivie de réactions de synthèse de protéines sans cellules (CFPS) en moins de 24 heures. L’explication du protocole d’auto-induction sans cellule (CFAI) détaille les améliorations apportées pour réduire la surveillance des chercheurs et augmenter les quantités d’extrait cellulaire obtenues.

Des cellules à la synthèse de protéines sans cellules en 24 heures à l’aide d’un flux de travail d’auto-induction sans cellules

Ce protocole décrit le système de synthèse des protéines libres (CFPS) utilisé dans la construction des cellules synthétiques. Il décrit les étapes clés avec des résultats représentatifs dans différents micro-compartiments. Le protocole vise à établir les meilleures pratiques pour divers laboratoires de la communauté des cellules synthétiques, faisant ainsi progresser le développement des cellules synthétiques.

SYSTÈME DE SYNTHÈSE DE PROTÉINES ACELLULAIRES POUR LA CONSTRUCTION DE CELLULES SYNTHÉTIQUES

Découvrez la synthèse de protéines acellulaires à partir d'extraits d'E. coli BL21 Rosetta2 déficients en exonucléase V utilisant des modèles d'ADN linéaires. Cette méthode accélère le prototypage sans clonage.

Synthèse de protéines acellulaires à partir d’extraits cellulaires déficients en exonucléase utilisant des modèles d’ADN linéaires (Vidéo) | JoVE Journal

Synthèse de protéines acellulaires à partir d’extraits cellulaires déficients en exonucléase utilisant des modèles d’ADN linéaires

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