Name: Détermination de l’association thermodynamique et cinétique d’un aptamère d’ADN et d’une tétracycline à l’aide de la calorimétrie de titrage isotherme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Découvrez la calorimétrie de titrage isotherme pour analyser l'affinité de liaison entre un aptamère d'ADN et la tétracycline. Cette méthode sans marquage permet d'étudier la thermodynamique et la cinétique des interactions moléculaires.

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Cette recherche a été soutenue par le financement de la recherche et du développement d’Aptagen LLC.

NOTE: La figure 2 montre les principales étapes de l’expérience ITC pour déterminer l’association thermodynamique et cinétique d’un aptamère d’ADN et de la tétracycline.
1. Préparation des échantillons
REMARQUE : Les échantillons pour l’ITC doivent être préparés dans le même tampon pour l’aptamère et le ligand afin d’éviter le dégagement de chaleur causé par le mélange de différents tampons de la cellule d’échantillon et de la seringue. Ceci est généralement réalisé par dialyse de tous les matériaux dans le même tampon. Le tampon est échangé à l’aide d’un protocole adapté du protocole d’un concentrateur de seuil de masse moléculaire (MWC) de 3 kDa avec quelques modifications, comme ci-dessous:
<ol><li>Activer la membrane de la colonne de dialyse (3 kDa MWC) avec 1x PBS, pH 7,4, acheté auprès du fabricant, en suivant les étapes suivantes: remplir avec 1x tampon (PBS), équilibrer pendant 10 min à TA et centrifuger à 5 000 x g pendant 15 min.</li>
	<li>Retirez le tampon et chargez 500 μL d’échantillons d’aptamères dans la colonne, centrifugez à 5 000 x g et répétez-le 4x pour échanger le tampon d’origine contre 1x PBS. Lorsque le tampon traverse la membrane, toutes les molécules d’une masse inférieure à 3 kDa traversent la membrane et l’aptamère reste sur la face supérieure de la membrane.</li>
	<li>Prélever l’aptamère d’ADN dialysé à l’aide d’une pipette et le transférer dans le(s) nouveau(x) tube(s) de 1,5 mL.</li>
	<li>Recueillir le dernier tampon d’écoulement pour dissoudre la tétracycline. La poudre de tétracycline est pure et petite, de sorte que la dialyse n’est pas nécessaire. Cependant, utilisez le tampon dialysé précédent pour l’ADN de la cible afin de vous assurer que le tampon de l’expérience dans la seringue correspond au tampon de la cellule de référence.</li>
	<li>Déterminez à nouveau la concentration d’aptamères à l’aide d’un spectromètre UV-visible. Utilisez le dernier tampon d’échange pour ajuster la concentration à 40 μM de tétracycline et 2 μM d’aptamère.</li>
	<li>Plier l’aptamère d’ADN en le chauffant à 90 °C pendant 10 min, en refroidissant à 4 °C pendant 10 min, puis en retournant à TA pendant 20 min.</li>
	<li>Dégazer l’aptamère plié et dialyser la tétracycline à l’aide d’une station de dégazage ou d’une pompe à vide réglée à 600 mmHg à 25 °C pendant 25 min pour éliminer les gaz dissous.</li>
</ol>2. Lavage de l’instrument et fonctionnement du kit de test
<ol><li>Nettoyez les orifices de solvant pour vous assurer que tout le chemin de l’échantillon est clair. Nettoyez en jetant la solution de déchets et en les chargeant de méthanol pur, d’eau et de tampon. Chaque port contient plus de 250 ml pour assurer une solution suffisante pour le nettoyage. REMARQUE: Le processus de nettoyage est automatiquement complété par un logiciel de contrôle ITC programmable par l’utilisateur.</li>
	<li>Testez la propreté de la machine en exécutant ITC en utilisant un tampon dans un tampon (c.-à-d. 1x PBS dans 1x PBS). REMARQUE: Une ligne de base de bruit normale est visible entre le minuscule tampon dans les pics d’injection de tampon. Lorsque la seringue de titrage et les canules sont correctement nettoyées et complètement sèches, la ligne de base sera stable; Une augmentation ou une diminution de la ligne de base reflète une instrumentation sale ou des bulles à l’intérieur de l’instrument, qui doivent être corrigées avant d’exécuter des échantillons réels.</li>
	<li>Testez la précision de la machine avec un kit standard comprenant de l’EDTA et du CaCl2 (Figure 3), en utilisant le programme par défaut et en suivant les instructions du fabricant.</li>
</ol>3. Exécution de l’échantillon pour déterminer la liaison entre l’aptamère et la tétracycline
<ol><li>Paramétrer les paramètres de fonctionnement : une vitesse d’agitation de 200 tr/min, fonctionnant à 25 °C, 2 μM d’aptamère et 40 μM de tétracycline, 30 injections de 2,0 μL chacune, un temps de retard de 180 s.</li>
	<li>Vérifiez les volumes requis à l’aide d’une calculatrice de programme en cours d’exécution. Avec ce paramètre courant, effectuer une mesure ITC avec 230 μL de tétracycline 40 μM dans la seringue ITC et 485 μL d’aptamère 2 μM dans la cellule d’échantillon ITC à l’aide de l’ITC.</li>
	<li>Charger les plaques de seringue de tétracycline dialysées et l’aptamère plié dans la cellule d’échantillon, en évitant les bulles, à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Commencez à exécuter l’instrument ITC en cliquant sur le bouton de démarrage du logiciel. NOTE: Le processus de fonctionnement de l’instrument ITC est entièrement automatisé après le remplissage manuel de la cellule de référence et des plaques d’échantillonnage de titre.</li>
</ol>4. Analyse des données à l’aide d’un logiciel
<ol><li>Ouvrez le logiciel d’analyse de données en double-cliquant pour commencer à analyser les données.</li>
	<li>Ouvrez le chemin des données brutes enregistrées pour connaître la tendance de la liaison.</li>
	<li>Ouvrez l’onglet Modélisation et utilisez différents modèles de liaison pour trouver le meilleur ajustement pour la courbe de données. Ensuite, le logiciel calcule automatiquement le thermogramme ITC et divers paramètres thermodynamiques, notamment l’enthalpie (ΔH), l’entropie (ΔS), l’énergie libre (ΔG), la constante de liaison à l’équilibre (Ka) et la stœchiométrie.</li>
	<li>Collecter les paramètres thermodynamiques déterminés à partir des données et des informations du modèle d’ajustement.</li>
	<li>Créez un rapport, comprenant des images du thermogramme ITC et de divers paramètres thermodynamiques, comme illustré à la figure 4 et au tableau 1.</li>
</ol>

<ol><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li>
<li>Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptasensors+for+environmental+monitoring+of+contaminants+in+water+and+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Environmental+Science+%26+Health%22%5BJournal%5D)">Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil.</a> Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).</li>
<li>Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+aptamer+discovery+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of aptamer discovery and technology.</a> Nature Reviews Chemistry. 1, 0076(2017).</li>
<li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SELEX--A+%28r%29evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Engineering%22%5BJournal%5D)">SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).</li>
<li>Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+kinetics+by+isothermal+titration+calorimetry%3A+Allostery%2C+inhibition%2C+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826(2020).</li>
<li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).</li>
<li>Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+aptamers+specific+for+antibiotics+tetracyclines%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).</li>
<li>Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+aptasensor+for+tetracycline+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+and+Biosystems+Engineering%22%5BJournal%5D)">Electrochemical aptasensor for tetracycline detection.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+indirect+competitive+assay-based+aptasensor+for+highly+sensitive+detection+of+tetracycline+residue+in+honey%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey.</a> Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+colorimetric+aptasensor+using+gold+nanoparticle+for+a+highly+sensitive+and+specific+detection+of+oxytetracycline%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline.</a> Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).</li>
<li>Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+photosensitisation+processes+by+an+RNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer.</a> Scientific Reports. 7, 43272(2017).</li>
<li>Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+and+thermodynamics+of+2%27%2C5%27+RNA+intercalation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).</li>
<li>Sigurskjold, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exact+analysis+of+competition+ligand+binding+by+displacement+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).</li>
<li>Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt-mediated+two-site+ligand+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).</li>
<li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+value+of+c%3A+Can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).</li>
<li>Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+reactions+for+the+amplification+of+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

La méthode présentée ici a été modifiée selon les instructions de TA Instruments et est suffisante pour déterminer l’affinité de liaison et la thermodynamique de nombreux aptamères et cibles sélectionnés dans notre centre. Les étapes cruciales de cette procédure comprennent l’échange du tampon pour avoir une cible correspondant au ligand, l’exécution d’échantillons avec les paramètres appropriés et la recherche du modèle d’ajustement de liaison approprié pour analyser les données. L’enregistrement continu de la libératio...

Les aptamères sont des fragments d’ADNss ou d’ARN sélectionnés par un processus d’évolution avec une affinité et une spécificité de liaison élevées aux cibles souhaitées1,2, qui peuvent fonctionner comme des éléments de reconnaissance avancés ou des anticorps chimiques 3,4,5. Ainsi, l’affinité et la spécificité de liaison des aptamères à leurs cibles jouent un rôle crucial dans la sélection et l’application d’un aptamère, et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) a été largement utilisée à ces fins de caractérisation. De nombreuses approches ont été utilisées pour déterminer l’affinité des aptamères, notamment l’ITC, la résonance plasmonique de surface (SPR), le titrage colorimétrique, la thermophorèse à micro-échelle (MST) et l’interférométrie de la couche biologique (BLI). Parmi elles, l’ITC est l’une des dernières techniques permettant de déterminer l’association thermodynamique et cinétique de deux molécules en phase de solution. Cette approche effectue un titrage continu à l’aide de molécules sans marquage et enregistre la chaleur libérée au fil du temps lors des événements de liaison produits par chaque titrage 6,7. Contrairement à d’autres méthodes, l’ITC peut offrir une affinité de liaison, plusieurs sites de liaison et une association thermodynamique et cinétique (Figure 1A). À partir de ces paramètres initiaux, les changements d’énergie libre de Gibbs et les changements d’entropie sont déterminés à l’aide de la relation suivante:
ΔG = ΔH-TΔS
Cela signifie que l’ITC offre un profil thermodynamique complet de l’interaction moléculaire pour élucider les mécanismes de liaison (Figure 1B). Il est difficile de déterminer l’affinité de liaison pour les petites molécules avec un aptamère en raison des tailles radicalement différentes entre l’aptamère et la cible. Pendant ce temps, ITC peut fournir des mesures sensibles sans marquage ni immobilisation des molécules, ce qui permet de conserver la structure naturelle de l’aptamère et de la cible pendant la mesure. Avec les attributs mentionnés, ITC peut être utilisé comme méthode standard pour la caractérisation de la liaison entre un aptamère et de petites cibles.
Après sélection par le groupe Gu, cet aptamère a été intégré à différentes plates-formes, y compris des biocapteurs électrochimiques à base d’aptamères, un test compétitif d’aptamère lié à une enzyme et une plaque de microtitrage, qui peut permettre une détection à haut débit de la tétracycline 8,9,10. Cependant, ses caractéristiques de liaison n’ont pas été suffisamment bien élucidées pour choisir la plate-forme appropriée8; il convient de caractériser la liaison de l’aptamère à la tétracycline à l’aide de l’ITC.

<table><tbody><tr><td>5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCacgg C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'Integrated</td> <td>DNA Technologies, Inc</td><td></td><td>La séquence est tirée des recherches de Gu, qui n’ont pas identifié Kd à l’aide de l’ITC (voir références 8 et 9)</td></tr><tr><td>Affinity ITC Auto Low Volume (190 &micro ; l) Système complet&ndash ; Gold Cells</td><td>TA Instruments</td><td>61000.901</td><td>Système de titrage calorimétrique isotherme</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Avantor (VWR)</td><td>E506-100ML</td><td>Chlorure de calcium 1 M en solution aqueuse, qualité biotechnologie, stérile</td></tr><tr><td></td><td>Centrifugeuse Eppendorf</td><td>5417R</td><td>L’Eppendorf 5417R est inégalé en termes de sécurité, de fiabilité et de facilité d’utilisation. Très facile à entretenir avec un moteur brushless qui tourne jusqu’à 16 400 tr/min avec une FCR maximale jusqu’à 25 000 x g.</td></tr><tr><td>Station de dégazage complète (110/230V)</td><td>TA Instruments</td><td>6326</td><td>Ce dégazeur est équipé d’une plate-forme d’agitation autonome, d’une chambre à vide, d’un port de vide, d’un port de température, d’un contrôle de la température et d’une minuterie électronique pour une préparation correcte des échantillons.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>TekNova</td><td>E0375</td><td>EDTA 500 mM, pH 7,5</td></tr><tr><td>NanoDrop Spectrophotomètre UV-Vis à un microvolume</td><td>ThermoFisher</td><td>Spectrophotomètre UV-VIS</td><td>ND-ONE-W</td></tr><tr><td>Nanosep, Nanosep MF et NAB Dispositifs centrifuges</td><td>Pall Laboratory</td><td>OD030C34</td><td>Concentrateur de coupure de poids moléculaire 3 kDa</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70165</td><td>Tampon contenant du phosphate de sodium, du chlorure de sodium, du phosphate de potassium et du chlorure de potassium de qualité ultra-pure Filtré stérilement à l’aide de 0,2 & micro ; Filtre M. Autoclave à 121 &deg ; C pendant plus de 20 min.</td></tr><tr><td>Posi-Click 1,7 mL Tubes de microcentrifugation à grand capuchon</td><td>labForce (une marque Thomas Scientific)</td><td>1149K01</td><td></td></tr><tr><td>Tétracycline, hydrochlorure</td><td>EMD Millipore Corperation</td><td>CAS64-75-5</td><td></td></tr></tbody></table>

détermination de l’association thermodynamique et cinétique d’un aptamère d’adn et d’une tétracycline à l’aide de la calorimétrie de titrage isotherme

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

La détermination de l’affinité et du comportement de liaison entre un aptamère et sa cible est l’étape la plus cruciale dans la sélection et l’utilisation d’un aptamère pour l’application. En raison des différences drastiques entre l’aptamère et les petites molécules, les scientifiques doivent faire beaucoup d’efforts pour caractériser leurs propriétés de liaison. La calorimétrie de titrage isotherme (ITC) est une approche puissante à cette fin. L’ITC va au-delà de la détermination des constantes de dissociation (K d) et peut fournir les changements d’enthalpie et la stœchiométrie de liaison de l’interaction entre deux molécules dans la phasede solution. Cette approche effectue un titrage continu à l’aide de molécules sans marquage et enregistre la chaleur libérée au fil du temps sur les événements de liaison produits par chaque titrage, de sorte que le processus peut mesurer avec sensibilité la liaison entre les macromolécules et leurs petites cibles. Ici, l’article présente une procédure étape par étape de la mesure ITC d’un aptamère sélectionné avec une petite cible, la tétracycline. Cet exemple prouve la polyvalence de la technique et son potentiel pour d’autres applications.

ITC fournit une constante de dissociation précise (Kd), la stœchiométrie de liaison et les paramètres thermodynamiques des interactions à deux molécules6. Dans cet exemple, l’aptamère choisi par Kim et coll.9,11 se lie à la tétracycline avec des affinités de liaison de K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Fait intéressant, cette liaison a été déterminée à l’aide de la méthode de filtratio...

Le présent protocole décrit l’utilisation de la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) pour analyser l’association et la cinétique de dissociation de la liaison entre un aptamère d’ADN et la tétracycline, y compris la préparation des échantillons, les étalons et les échantillons, et l’interprétation des données résultantes.

Détermination de l’association thermodynamique et cinétique d’un aptamère d’ADN et d’une tétracycline à l’aide de la calorimétrie de titrage isotherme

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Ce protocole permet aux chercheurs de déterminer les affinités de liaison des aptamères par rapport à des cibles libres en solution, tout en fournissant un aperçu du mécanisme de liaison. Étant donné que l’ITC mesure les changements de chaleur dus à la liaison, ni l’aptamère ni le ligand n’ont besoin d’être étiquetés ou fonctionnalisés, comme ce serait le cas pour des techniques telles que la SPR. Les nouveaux utilisateurs doivent porter une attention particulière à la correspondance des tampons sur tous les composants de liaison.De plus, sachez que la technique a des exigences élevées en matière d’échantillons qui peuvent être difficiles à satisfaire pour des ligands plus importants tels que les protéines. Pour commencer, activez la membrane de la colonne de dialyse, remplissez avec un tampon PBS, équilibrez pendant 10 minutes à température ambiante et centrifugez à 5 000 fois G pendant 15 minutes. Retirez le tampon et chargez 500 microlitres d’échantillons d’aptamères dans la colonne.Centrifuger à 5 000 fois G et répéter quatre fois pour échanger le tampon d’origine contre du PBS. Collectez l’aptamère d’ADN dialysé à l’aide d’une pipette et transférez-le dans le nouveau tube de 1,5 millilitre. Recueillir le dernier tampon d’écoulement continu pour dissoudre la tétracycline.Assurez-vous que le tampon de l’expérience dans la seringue correspond au tampon de la cellule de référence. Déterminez à nouveau la concentration d’aptamères à l’aide d’un spectromètre UV-visible. Utilisez le dernier tampon d’échange pour ajuster la concentration à 40 micromolaires de tétracycline et à deux micromolaires aptamères.Pliez l’aptamère d’ADN en chauffant à 90 degrés Celsius pendant 10 minutes, en refroidissant à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, puis en revenant à température ambiante pendant 20 minutes. Dégazez l’aptamère plié et dialysez la tétracycline à l’aide d’une station de dégazage ou d’une pompe à vide pendant 25 minutes pour éliminer les gaz dissous. Après avoir nettoyé et confirmé la propreté de la machine, testez la précision de la machine avec un kit standard comprenant de l’EDTA et du chlorure de calcium en utilisant le programme par défaut et en suivant les instructions du fabricant.Configurez les paramètres en cours d’exécution. Vérifiez les volumes requis à l’aide d’une calculatrice de programme en cours d’exécution. Avec ce paramètre courant, effectuer la mesure ITC avec 230 microlitres de tétracycline 40 micromolaires dans la seringue ITC et 485 microlitres d’aptamère à deux micromolaires dans la cellule d’échantillon ITC à l’aide de l’ITC.Charger les plaques de seringue de tétracycline dialysées et l’aptamère plié dans la cellule d’échantillon, en évitant les bulles, à l’aide d’une pipette. Commencez à exécuter l’instrument ITC en cliquant sur le bouton Démarrer du logiciel. Ouvrez le logiciel d’analyse de données en double-cliquant pour commencer à analyser les données.Ouvrez le chemin des données brutes enregistrées pour connaître la tendance de la liaison. Ouvrez l’onglet Modélisation et utilisez différents modèles de liaison pour trouver le meilleur ajustement pour la courbe de données. Ensuite, le logiciel calcule automatiquement le thermogramme ITC et divers paramètres thermodynamiques, notamment l’enthalpie, l’entropie, l’énergie libre, la constante de liaison à l’équilibre et la stœchiométrie.Collecter les paramètres thermodynamiques déterminés à partir des données et des informations du modèle d’ajustement. Créez un rapport comprenant des images du thermogramme ITC et divers paramètres thermodynamiques. L’aptamère choisi par Kim, et al se lie à la tétracycline avec des affinités de liaison de la constante de dissociation un est égal à 13 micromolaires et la constante de dissociation deux égale 53 nanomolaires.Le modèle d’ajustement et la stœchiométrie de l’ITC reflètent que l’aptamère se lie à la tétracycline par un rapport de liaison de 2:1 avec le modèle de liaison séquentielle. Les paramètres thermodynamiques déterminés par la mesure ITC pour le site deux ont indiqué que l’enthalpie surmontant une perte entropique relativement importante entraîne une forte liaison. La liaison par enthalpie avec perte d’entropie est liée à des changements conformationnels d’acides nucléiques, qui ont été rapportés comme des comportements de liaison entre l’ARN et une petite molécule.L’aptamère et le ligand doivent être dans le même tampon. L’aptamère doit être replié s’il est développé avec un repliement, et les échantillons doivent être dégazés. La prise en compte de ces considérations garantira que seules les interactions aptamère-ligand contribuent au signal mesuré.En raison de la taille de la cible aptamère, une méthode de suivi appropriée pourrait être la thermophorèse à l’échelle microscopique pour confirmer l’affinité de liaison mesurée sans solution en solution.

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ITC est un outil puissant pour étudier la liaison d'un ligand à son hôte. Dans les systèmes complexes cependant, plusieurs modèles peuvent ajuster les données aussi bien. La méthode décrite ici fournit un moyen d'élucider le modèle approprié contraignante pour les systèmes complexes et d'extraire les paramètres thermodynamiques correspondants.

Collecte variable de concentration isotherme ensembles de données de titrage calorimétrique afin de déterminer des mécanismes de liaison

Un protocole général pour l'utilisation de la calorimétrie de titration isotherme pour surveiller la thermodynamique contraignante pour les systèmes biologiques avec les modérés affinités de liaison est présenté.

Calorimétrie titration isotherme pour Mesure macromolécules-ligand d&#39;affinité

Cette vidéo décrit l’anisotropie de fluorescence haute performance qui permet de surveiller l’interaction entre les facteurs de transcription et l’ADN. Le test surveille les interactions d’une molécule d’ADN marquée au fluorophore avec son facteur de transcription spécifique en mesurant le degré de polarisation dû à la rotation moléculaire ou à l’anisotropie de l’ADN marqué au fluorophore.

Anisotropie de fluorescence pour déterminer l’affinité de liaison entre le facteur de transcription et l’ADN

Cette vidéo présente la calorimétrie différentielle à balayage, une technique permettant d’étudier l’interaction entre une biomolécule et un ligand. La liaison d’un aptamère d’ADN et d’un ligand thermolabile est étudiée en appliquant des cycles répétés de chauffage et de refroidissement à l’échantillon et en obtenant des balayages pour l’analyse thermodynamique.

Calorimétrie différentielle à balayage pour étudier l’interaction aptamère-ligand thermolabile de l’ADN

Flux de chaleur des mesures de calorimétrie isotherme titrage libéré ou absorbé dans les réactions chimiques. Cette méthode peut être utilisée pour quantifier la catalyse enzymatique. Dans ce document, le protocole pour la configuration instrumentale, expérience en cours d'exécution, et l'analyse des données est généralement décrite, et appliquée à la caractérisation des enzymatique hydrolyse de l'urée par l'uréase jack bean.

Hot Catalyse biologique: calorimétrie de titration isotherme pour caractériser enzymatiques Réactions

La fluorimétrie différentielle à balayage est une méthode largement utilisée pour cribler des bibliothèques de petites molécules pour les interactions avec les protéines. Nous présentons ici une méthode simple pour étendre ces analyses afin de fournir une estimation de la constante de dissociation entre une petite molécule et son partenaire protéique.

Détermination des interactions protéine-ligand à l&#39;aide différentielle à balayage Fluorimétrie

La thermophorèse à l’échelle microscopique (MST) est une technologie sensible pour caractériser les interactions aptamère-cible. Ce manuscrit décrit un protocole MST pour caractériser les interactions aptamère-petites molécules.

La cartographie du site de liaison d&#39;un aptamère sur ATP utilisant MicroScale thermophorèse

Nous présentons ici une nouvelle méthode permettant de déterminer les affinités de liaison à l’équilibre et en solution avec la sensibilité élevée sur une grande échelle. Cela permet d’améliorer l’analyse quantitative de liaison ADN-facteur de transcription. La méthode repose sur des mesures d’anisotropie fluorescence automatisé dans un système de livraison contrôlé.

Haute sensibilité mesure des affinités de liaison de l’ADN-facteur de Transcription par titrage concurrentiel à l’aide de la microscopie en Fluorescence

La stabilité thermique de l’activité enzymatique est facilement mesurable par calorimétrie isotherme titration (ITC). Des essais de stabilité protéique plus actuellement utilisé mesure protéine déplier, mais ne fournissent pas d’informations sur l’activité enzymatique. ITC permet la détermination directe de l’effet des modifications des enzymes sur la stabilité de l’activité enzymatique.

Mesurer la stabilité enzymatique par calorimétrie isotherme de Titration

Le présent protocole démontre l’utilisation d’un test d’amplification exponentielle rapide en 3 étapes, basé sur des aptamères, pour détecter des cibles. La préparation des échantillons, l’amplification du signal et le développement de la couleur sont couverts pour mettre en œuvre ce système afin de reconnaître la présence de théophylline par rapport à celle de la caféine.

Détection de cible basée sur des aptamères facilitée par une réaction d’amplification exponentielle isotherme G-quadruplex en 3 étapes

Le protocole présente deux méthodes pour déterminer la cinétique des aptamères d’ARN fluorogéniques Spinach2 et Brocoli. La première méthode décrit comment mesurer la cinétique des aptamères fluorogéniques in vitro avec un lecteur de plaques, tandis que la deuxième méthode détaille la mesure de la cinétique des aptamères fluorogéniques dans les cellules par cytométrie en flux.

Détermination de la cinétique d’activation in vitro et cellulaire pour les aptamères d’ARN fluorogéniques

Découvrez la calorimétrie de titrage isotherme pour analyser l'affinité de liaison entre un aptamère d'ADN et la tétracycline. Cette méthode sans marquage permet d'étudier la thermodynamique et la cinétique des interactions moléculaires.

Détermination de l’association thermodynamique et cinétique d’un aptamère d’ADN et d’une tétracycline à l’aide de la calorimétrie de titrage isotherme (Vidéo) | JoVE Journal

Détermination de l’association thermodynamique et cinétique d’un aptamère d’ADN et d’une tétracycline à l’aide de la calorimétrie de titrage isotherme

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