Détermination de l’association thermodynamique et cinétique d’un aptamère d’ADN et d’une tétracycline à l’aide de la calorimétrie de titrage isotherme

Ce protocole permet aux chercheurs de déterminer les affinités de liaison des aptamères par rapport à des cibles libres en solution, tout en fournissant un aperçu du mécanisme de liaison. Étant donné que l’ITC mesure les changements de chaleur dus à la liaison, ni l’aptamère ni le ligand n’ont besoin d’être étiquetés ou fonctionnalisés, comme ce serait le cas pour des techniques telles que la SPR. Les nouveaux utilisateurs doivent porter une attention particulière à la correspondance des tampons sur tous les composants de liaison.

De plus, sachez que la technique a des exigences élevées en matière d’échantillons qui peuvent être difficiles à satisfaire pour des ligands plus importants tels que les protéines. Pour commencer, activez la membrane de la colonne de dialyse, remplissez avec un tampon PBS, équilibrez pendant 10 minutes à température ambiante et centrifugez à 5 000 fois G pendant 15 minutes. Retirez le tampon et chargez 500 microlitres d’échantillons d’aptamères dans la colonne.

Centrifuger à 5 000 fois G et répéter quatre fois pour échanger le tampon d’origine contre du PBS. Collectez l’aptamère d’ADN dialysé à l’aide d’une pipette et transférez-le dans le nouveau tube de 1,5 millilitre. Recueillir le dernier tampon d’écoulement continu pour dissoudre la tétracycline.

Assurez-vous que le tampon de l’expérience dans la seringue correspond au tampon de la cellule de référence. Déterminez à nouveau la concentration d’aptamères à l’aide d’un spectromètre UV-visible. Utilisez le dernier tampon d’échange pour ajuster la concentration à 40 micromolaires de tétracycline et à deux micromolaires aptamères.

Pliez l’aptamère d’ADN en chauffant à 90 degrés Celsius pendant 10 minutes, en refroidissant à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, puis en revenant à température ambiante pendant 20 minutes. Dégazez l’aptamère plié et dialysez la tétracycline à l’aide d’une station de dégazage ou d’une pompe à vide pendant 25 minutes pour éliminer les gaz dissous. Après avoir nettoyé et confirmé la propreté de la machine, testez la précision de la machine avec un kit standard comprenant de l’EDTA et du chlorure de calcium en utilisant le programme par défaut et en suivant les instructions du fabricant.

Configurez les paramètres en cours d’exécution. Vérifiez les volumes requis à l’aide d’une calculatrice de programme en cours d’exécution. Avec ce paramètre courant, effectuer la mesure ITC avec 230 microlitres de tétracycline 40 micromolaires dans la seringue ITC et 485 microlitres d’aptamère à deux micromolaires dans la cellule d’échantillon ITC à l’aide de l’ITC.

Charger les plaques de seringue de tétracycline dialysées et l’aptamère plié dans la cellule d’échantillon, en évitant les bulles, à l’aide d’une pipette. Commencez à exécuter l’instrument ITC en cliquant sur le bouton Démarrer du logiciel. Ouvrez le logiciel d’analyse de données en double-cliquant pour commencer à analyser les données.

Ouvrez le chemin des données brutes enregistrées pour connaître la tendance de la liaison. Ouvrez l’onglet Modélisation et utilisez différents modèles de liaison pour trouver le meilleur ajustement pour la courbe de données. Ensuite, le logiciel calcule automatiquement le thermogramme ITC et divers paramètres thermodynamiques, notamment l’enthalpie, l’entropie, l’énergie libre, la constante de liaison à l’équilibre et la stœchiométrie.

Collecter les paramètres thermodynamiques déterminés à partir des données et des informations du modèle d’ajustement. Créez un rapport comprenant des images du thermogramme ITC et divers paramètres thermodynamiques. L’aptamère choisi par Kim, et al se lie à la tétracycline avec des affinités de liaison de la constante de dissociation un est égal à 13 micromolaires et la constante de dissociation deux égale 53 nanomolaires.

Le modèle d’ajustement et la stœchiométrie de l’ITC reflètent que l’aptamère se lie à la tétracycline par un rapport de liaison de 2:1 avec le modèle de liaison séquentielle. Les paramètres thermodynamiques déterminés par la mesure ITC pour le site deux ont indiqué que l’enthalpie surmontant une perte entropique relativement importante entraîne une forte liaison. La liaison par enthalpie avec perte d’entropie est liée à des changements conformationnels d’acides nucléiques, qui ont été rapportés comme des comportements de liaison entre l’ARN et une petite molécule.

L’aptamère et le ligand doivent être dans le même tampon. L’aptamère doit être replié s’il est développé avec un repliement, et les échantillons doivent être dégazés. La prise en compte de ces considérations garantira que seules les interactions aptamère-ligand contribuent au signal mesuré.

En raison de la taille de la cible aptamère, une méthode de suivi appropriée pourrait être la thermophorèse à l’échelle microscopique pour confirmer l’affinité de liaison mesurée sans solution en solution.