Name: Isolement et caractérisation du microbiote naturel du nématode modèle Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Découvrez l'isolement du microbiote naturel de Caenorhabditis elegans pour étudier les interactions hôte-microbiote. Cette méthode permet d'analyser le rôle des microbes sur la biologie du nématode modèle.

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Nous reconnaissons le soutien financier de la Fondation allemande pour la science (projets A1.1 et A1.2 du Centre de recherche collaborative 1182 sur l’origine et la fonction des métaorganismes). Nous remercions les membres du laboratoire de Schulenburg pour leurs conseils et leur soutien.

1. Préparation des tampons et des milieux
<ol><li>Préparer le tampon S en ajoutant 5,85 g de NaCl, 1,123 g de K2HPO4, 5,926 g de KH2PO4 et 1 L deH2Odésionisé dans une fiole et un autoclave pendant 20 min à 121°C.</li>
	<li>Préparer un milieu visqueux en ajoutant du tampon S contenant 1,2 % (p/v) d’hydroxyméthylcellulose (la substance causant la viscosité du milieu), 5 mg/mL de cholestérol, 1 mM de MgSO4, 1 mM de CaCl2 et 0,1 % (v/v) d’acétone. Autoclaver et agiter le milieu visqueux jusqu’à ce qu’il soit complètement homogène. REMARQUE: Cela peut prendre plusieurs heures. En outre, le tampon S peut être directement préparé et ajouté au milieu visqueux sans stérilisation préalable.</li>
	<li>Préparer le tampon M9 en ajoutant 3 g de KH 2PO4, 6 g de NA2HPO4·2H2O, 5 g de NaCl et 1 L deH2Odésionisé dans une fiole de 1 L. Autoclaver la solution, et après refroidissement, ajouter 1 mL de 1 M MgSO4 (123,24 g deMgSO4·7H2O dans 500 mL deH2Odésionisé, filtre stérilisé).</li>
	<li>Préparer la solution mère de Triton X-100 à 10 % (v/v) en mélangeant 5 mL de Triton X-100 avec 45 mL de tampon M9. Filtrer-stériliser la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 μm.</li>
	<li>Préparer le tampon M9 avec Triton X-100 (M9-T) en ajoutant 2,5 ml de la solution mère Triton X-100 à 10 % (v/v) à 1 L de tampon M9 après autoclavage pour obtenir 0,025 % (v/v) M9-T.</li>
	<li>Préparer 30 % (v/v) de glycérol dans du tampon S en mélangeant 15 mL de glycérol stérile à 100 % et 35 mL de tampon S stérile dans un tube de 50 mL.</li>
</ol>2. Préparation d’échantillons environnementaux (figure 1)
<ol><li>Prélevez des échantillons environnementaux comme du compost ou des fruits pourris et placez chaque échantillon dans un sac en plastique, un tube ou un autre contenant propre. REMARQUE : Afin d’attirer les nématodes, les pommes peuvent être placées sur du compost plusieurs semaines avant l’échantillonnage.</li>
	<li>Répartir uniformément les morceaux de l’échantillon environnemental dans une boîte de Petri vide stérile de 9 cm. REMARQUE : Les échantillons présentant des niveaux plus élevés de désintégration sont plus susceptibles de contenir C. elegans. En option, une boîte de Petri remplie d’un milieu gélosé sans peptone (PFM) peut être utilisée pour augmenter le contraste.</li>
	<li>Couvrir soigneusement l’échantillon avec environ 20 mL de milieu visqueux stérile. NOTE: Les nématodes flottent à la surface en 1-2 heures. Le milieu visqueux ralentit le mouvement des vers et facilite leur échantillonnage. Un tampon M9 stérile peut être utilisé comme alternative, mais le mouvement des vers sera plus rapide.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64249/64249fig01.jpg"> Figure 1 : Isolement des nématodes des substrats. Les échantillons de substrat sont placés dans des boîtes de Petri vides et recouverts d’un milieu visqueux pour éliminer les nématodes. Les nématodes sont transférés à M9-T et lavés à plusieurs reprises pour éliminer les bactéries de l’extérieur. Les nématodes individuels peuvent être utilisés pour isoler l’ADN, isoler les bactéries associées ou être placés sur des plaques de gélose pour cultiver des populations de vers. Figure créée avec BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64249/64249fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
3. Isolement des nématodes Caenorhabditis (figure 1)
<ol><li>Recherche de nématodes Caenorhabditis à l’aide d’un microscope à dissection, en suivant les lignes directrices présentées dans le chapitre WormBook sur l’isolement de C. elegans et des nématodes apparentés par Barrière et Félix27. NOTE: Caenorhabditis hermaphrodites/femelles ont un intestin de couleur brun clair (sous éclairage transmis). De plus, les cellules intestinales ont de grands noyaux cellulaires, qui sont visibles sous forme de points blancs. En revanche, d’autres espèces de nématodes ont souvent un intestin brun foncé et peuvent présenter une asymétrie antéropostérieure dans l’intensité pigmentaire et généralement pas de noyaux visibles. La vulve des Caenorhabditis hermaphrodites/femelles adultes se trouve au milieu de l’animal. Cette localisation de la vulve n’est pas toujours démontrée par les autres taxons de nématodes. Les nématodes Caenorhabditis possèdent deux bulbes pharyngés, qui sont tous deux visibles avec un grossissement suffisant et un éclairage transmis et contrastent avec de nombreux autres taxons de nématodes. Les nématodes Caenorhabditis ont une queue pointue, tandis que d’autres nématodes ont une queue ronde.</li>
	<li>Recueillir les nématodes Caenorhabditis au microscope à dissection dans le moins de liquide possible à l’aide d’une pipette de 20 à 100 μL. Transférer les nématodes prélevés directement dans 1 à 3 mL de M9-T stérile dans une boîte de Petri stérile de 3 cm pour laver les vers afin d’éliminer les microbes non attachés (étape 3.3) ou, alternativement, transférer les vers individuels sur une plaque avec un milieu de croissance des nématodes (NGM) pour établir une population de vers (étape 3.4).</li>
	<li>Lavez les nématodes pour éliminer les microbes de l’extérieur du nématode. REMARQUE: Ce protocole enrichit les bactéries intestinales mais n’élimine pas complètement les bactéries qui collent à la cuticule du ver.<ol><li>Incuber les nématodes pendant 10-15 min dans M9-T.</li>
		<li>Pipeter les nématodes dans le moins de liquide possible dans 1-3 mL de M9-T frais dans une nouvelle boîte de Pétri stérile de 3 cm.</li>
		<li>Répétez l’incubation et transférez les nématodes sur M9-T frais deux fois de plus. REMARQUE : les étapes suivantes peuvent être effectuées avec des vers individuels ou avec des populations de vers. Les vers peuvent maintenant être utilisés pour la caractérisation de C. elegans et des microbes associés, ainsi que pour l’isolement des bactéries (étapes 4 et 5). Alternativement, ils peuvent être transférés individuellement sur des plaques NGM pour établir une population de vers (étape 3.4).</li>
	</ol></li>
	<li>Pour obtenir une population de vers, pipeter un nématode individuel sur une plaque NGM. NOTE: Seuls les nématodes hermaphrodites tels que C. elegans ou C . briggsae sont capables de produire une progéniture à partir de vers uniques. Cependant, les vers uniques d’autres espèces peuvent encore produire une progéniture s’ils étaient déjà accouplés.<ol><li>Les nématodes isolés naturellement contiennent généralement des bactéries dans leur intestin, qu’ils excrètent sur les plaques NGM, où ces bactéries se développent et sont disponibles comme nourriture pour C. elegans. N’ajoutez pas d’organismes alimentaires distincts comme l’organisme alimentaire de laboratoire standard, la souche OP50 d’E. coli. NOTE: Les vers d’élevage sur les plaques influencent la composition de la communauté bactérienne associée, mais la composition est encore comparable à celle des isolats naturels de C. elegans 6,7.</li>
		<li>Laisser les nématodes proliférer jusqu’à 10 jours à la température appropriée (p. ex. 15 à 20 °C pour les endroits tempérés). Congeler ces nématodes (étape 3.5) ou les utiliser pour la caractérisation de C. elegans et des microbes associés ainsi que pour l’isolement des microbes (étapes 4 et 5).</li>
	</ol></li>
	<li>Congélation des nématodes pour un stockage à long terme<ol><li>Laissez les nématodes dans les assiettes jusqu’à ce que les bactéries alimentaires aient disparu et qu’il y ait principalement de petits stades larvaires dans les assiettes. Laver les vers des plaques dans 1,5 mL de tampon S.</li>
		<li>Bien mélanger 500 μL de tampon S contenant des vers avec 500 μL de glycérol à 30 % (v/v) dans du tampon S dans un tube stérile de 2 mL. Congelez rapidement les tubes à -80 °C pour un stockage à long terme, sinon le glycérol pourrait nuire aux nématodes.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Préparation des vers pour l’identification moléculaire de C. elegans et des microbes
<ol><li>Pour une identification impartiale des microbes associés aux nématodes, préparer une plaque de 96 puits avec trois billes stériles de 1 mm, 19,5 μL de tampon PCR et 0,5 μL de protéinase K (20 mg/mL) par puits. Pipeter un nématode lavé individuel dans chaque puits, en transférant le moins de liquide possible.</li>
	<li>Les populations de vers peuvent également être utilisées. Pour cela, lavez les vers des plaques avec un tampon M9 et transférez ~300 μL de tampon M9 contenant des vers à des tubes de 2 mL avec 10-15 billes.</li>
	<li>Briser les nématodes à l’aide d’un homogénéisateur de billes (p. ex., battre les perles pendant 3 minutes à 30 Hz). Centrifuger brièvement la plaque ou les tubes pour amener le liquide au fond (par exemple, pendant 10 s à 8000 x g à température ambiante [RT]).</li>
	<li>Identification de C. elegans
	<ol><li>Isoler l’ADN de nématodes individuels en chauffant les échantillons dans un cycleur de PCR pendant 1 h à 50 °C et 15 min à 95 °C. Isoler l’ADN des populations de vers en utilisant n’importe quelle méthode d’isolement de votre choix (exemples de protocoles de différentes méthodes d’isolement utilisant des kits commerciaux 7,9). Congeler l’ADN à -20 °C pour un stockage à long terme.</li>
		<li>Pour l’identification de C. elegans, utiliser l’ADN et la paire d’amorces nlp30-F (tableau 1, 5'-ACACATACAACTGATCACTCA-3') et nlp30-R (tableau 1, 5'-TACTTTCCCCATCCGTATC-3') dans une PCR, en suivant les instructions d’un fournisseur Taq de choix.</li>
		<li>Utilisez les conditions de PCR suivantes : étape initiale de dénaturation à 95 °C pendant 2 min, suivie de 35 cycles de 95 °C pendant 45 s, 55 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 1 min, et une étape finale d’allongement à 72 °C pendant 5 min. C. elegans produit un produit PCR de 154 pb.</li>
	</ol></li>
	<li>Caractériser les bactéries associées aux nématodes par séquençage d’amplicon 16S de la région V3-V4, en utilisant l’ADN isolé.<ol><li>Préparez une bibliothèque 16S avec les amorces 16S de votre choix et suivez le protocole du kit de préparation de bibliothèque. Une option consiste à utiliser les amorces 341F (Tableau 1, 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3') et 806R (Tableau 1, 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') couvrant la région V3-V4 du gène de l’ARNr 16S, ce qui donne des séquences qui peuvent être classées avec des bases de données standard avec une bonne résolution7. REMARQUE: La quantité d’ADN d’entrée est critique dans cette étape. L’ADN acquis à partir de vers uniques sera beaucoup moins important que celui obtenu à partir de populations de vers. Pour les vers simples, il peut être nécessaire d’augmenter la quantité d’ADN entrant ou d’augmenter la quantité de cycles de PCR7.</li>
		<li>Les bibliothèques peuvent être séquencées sur une plate-forme de séquençage à l’aide d’un kit de séquençage approprié. REMARQUE: Ici, la plate-forme MiSeq est utilisée avec un kit de réactif MiSeq approprié. Les réactifs sont constamment améliorés et doivent être choisis selon les normes les plus récentes.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Isolement et culture de bactéries associées aux nématodes (figure 2)
<ol><li>Pour isoler les bactéries, préparez une plaque de 96 puits avec trois billes stériles de 1 mm, 20 μL de tampon M9 par puits, et pipeter un nématode lavé individuel dans chaque puits, en transférant le moins de liquide possible. REMARQUE: Alternativement, les populations de vers peuvent être lavées des plaques avec un tampon M9 et ~300 μL de tampon M9 contenant des vers peuvent être transférés dans des tubes de 2 ml avec 10-15 billes. Dans tous les cas, les vers doivent provenir d’une culture qui a été identifiée comme étant C. elegans en utilisant les étapes 4.1-4.4.</li>
	<li>Briser les nématodes à l’aide d’un homogénéisateur de billes (p. ex., battre les perles pendant 3 minutes à 30 Hz). Centrifuger brièvement la plaque ou les tubes pour amener le liquide au fond (par exemple, pendant 10 s à 8000 x g à TA). NOTE: L’utilisation de cette méthode a conduit à l’isolement de taxons bactériens similaires à ceux révélés par le séquençage de l’amplicon de l’ADNr16S 7, ce qui suggère que le battement de billes décrit laisse la plupart des cellules bactériennes intactes.</li>
	<li>Recueillir le surnageant, le diluer en série à 1:10 et plaquer jusqu’à 100 μL sur des plaques de gélose de 9 cm.<ol><li>Pour vous assurer que la plupart des bactéries peuvent être cultivées, utilisez une variété de milieux alternatifs avec différentes compositions nutritives, y compris la gélose trypticase de soja diluée (TSA, dilution 1:10), la gélose MacConkey, la gélose au glucose Sabouraud, la gélose au dextrose de pomme de terre ou la gélose peptone de levure dextrose.</li>
	</ol></li>
	<li>Incuber les plaques aux conditions de température moyenne du lieu d’échantillonnage (par exemple, des températures comprises entre 15 et 20 °C pour les endroits tempérés) pendant 24 à 48 h.</li>
	<li>Utilisez la technique standard à trois stries et une boucle stérile pour obtenir des cultures bactériennes pures (Figure 2).<ol><li>Prélever une seule colonie dans une assiette à l’aide d’une boucle stérile ou d’un cure-dent et la glisser sur une nouvelle plaque de gélose contenant le même milieu gélose que celui utilisé pour la purification. Assurez-vous de n’utiliser qu’environ 1/3 de la plaque.</li>
		<li>Utilisez une nouvelle boucle stérile ou stérilisez une boucle réutilisable et faites-la glisser à travers la première traînée pour créer une deuxième traînée sur un autre 1/3 de la même plaque.</li>
		<li>Répétez cette étape en faisant glisser une boucle stérile à travers la deuxième strie.</li>
		<li>Incuber la plaque dans les mêmes conditions de croissance que celles utilisées pour l’isolement. Cette technique doit entraîner la croissance de colonies uniques dans la zone de la troisième traînée. REMARQUE: Il peut être nécessaire de répéter l’étape de purification plusieurs fois car les isolats naturels ont tendance à former des biofilms et / ou des agrégats.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultiver les colonies pures dans un milieu liquide (du même type que le milieu gélosé) en utilisant la même température et le même temps de croissance que ci-dessus (étape 5.4)</li>
	<li>Préparer les stocks de bactéries en ajoutant 300 μL de la culture bactérienne à 200 μL de glycérol à 86 % (v/v) (dans le milieu de croissance respectif, p. ex. BST) et pipeter de haut en bas pour bien mélanger. Vous pouvez également préparer des stocks de DMSO en mélangeant 50 μL de culture bactérienne avec 50 μL de DMSO à 7 % (v/v). Congeler à -80 °C pour un stockage à long terme.</li>
	<li>Caractérisation des bactéries par séquençage du gène complet de l’ARN ribosomique 16S<ol><li>Extraire l’ADN bactérien de cultures liquides pures en utilisant une technique appropriée (par exemple, un kit d’extraction d’ADN; par expérience, un protocole d’extraction basé sur CTAB fonctionne très bien22).</li>
		<li>Amplifier le gène de l’ARNr 16S à l’aide des amorces 27F (Tableau 1, 5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') et 1495R (Tableau 1, 5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA -3')28 et des conditions de PCR suivantes : 95 °C, 2 min, 22x (95 °C, 30 s; 55 °C, 30 s; 72 °C, 100 s) et une période de prolongation finale à 72 °C, 5 min.</li>
		<li>Afin d’acquérir les séquences complètes, utilisez en outre deux amorces de séquençage internes, telles que 701F (Tableau 1, 5'-GTGTAGCGGTGAAATGCG-3') et 785R (Tableau 1, 5'-GGATTAGATACCCTGGTAGTCC-3')6.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64249/64249fig2v2.jpg"> Figure 2 : Identification des espèces et isolement des bactéries individuelles. Les nématodes individuels sont brisés à l’aide d’un homogénéisateur de billes, et l’ADN est isolé pour la détermination de l’espèce par PCR ou séquençage. Alternativement, le nématode brisé est dilué en série et plaqué sur des plaques de milieu de croissance. Les plaques sont incubées jusqu’à l’apparition de colonies bactériennes, et les colonies individuelles sont striées sur de nouvelles plaques pour obtenir des cultures pures. Des colonies uniques de cultures pures sont utilisées pour cultiver des cultures bactériennes liquides pour la préparation de stocks bactériens pour un stockage à long terme à -80 ° C. Figure créée avec BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64249/64249fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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</ol>

Nous déclarons que nous n’avons aucun conflit d’intérêts.

Le nématode Caenorhabditis elegans est l’un des organismes modèles les plus étudiés en recherche biologique. Il a été introduit par Sydney Brenner dans les années 1960, à l’origine pour comprendre le développement et la fonction du système nerveux29. Depuis lors, C. elegans est devenu un modèle puissant pour l’étude des processus fondamentaux dans toutes les disciplines biologiques, y compris la biologie comportementale, la neurobiologie, le vieillissement, la biologie évolutive,...

Dans la nature, C. elegans se trouve couramment dans la matière végétale pourrie, en particulier les fruits pourris comme les pommes ou sur les tas de compost1. Il est également associé à certains hôtes invertébrés tels que les limaces et les cloportes 2,3. Ces habitats sont riches en microbes, qui non seulement servent de nourriture au ver, mais peuvent également former des associations stables avec lui. Les informations sur la diversité des micro-organismes naturellement associés n’ont été publiées qu’en 2016 4,5,6. Depuis lors, ces études et seulement quelques études plus récentes ont révélé que C. elegans est associé à une variété de bactéries et de champignons, y compris le plus souvent des bactéries du genre Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter, et plusieurs autres 6,7,8. Plusieurs bactéries associées peuvent coloniser de manière stable l’intestin du ver, mais pas toutes 6,9,10,11,12. Ils sont susceptibles d’être d’une importance clé pour notre compréhension de la biologie de C. elegans, car ils peuvent fournir de la nutrition, protéger contre les agents pathogènes et éventuellement d’autres facteurs de stress, et affecter les traits centraux de l’histoire de vie tels que le taux de reproduction, le développement ou les réponses comportementales.
À titre d’exemple, les isolats naturellement associés des genres Pseudomonas, Ochrobactrum, ainsi que Enterobacter ou Gluconobacter peuvent protéger le ver contre l’infection pathogène et tuer de manière distincte 5,6,11,13,14. Un isolat spécifique du genre Comamonas influence la réponse alimentaire, le développement, la durée de vie et la fertilité des nématodes15,16,17. Les bactéries de Providencia produisent le neuromodulateur tyramine et modulent ainsi l’activité du système nerveux de l’hôte et les réponses comportementales résultantes18. Il a été démontré qu’un ensemble de différentes bactéries naturellement associées affectait le taux de croissance de la population, la fertilité et les réponses comportementales 5,6,9,11,19.
À ce jour, la diversité et la cohérence exactes du microbiote indigène de C. elegans dans les habitats et les emplacements géographiques ne sont pas entièrement comprises, et d’autres associations entre le ver et les microbes de son environnement restent à découvrir. Plusieurs études antérieures ont utilisé des souches bactériennes isolées dans certains environnements pédologiques, des habitats naturels de C. elegans ou des expériences de mésocosme (c.-à-d. des environnements de laboratoire qui recréent des habitats naturels) avec des souches de laboratoire 4,5,20 de C. elegans. Même si ces études ont permis d’obtenir de nouvelles connaissances sur l’influence des microbes sur des caractéristiques spécifiques des nématodes (p. ex. métabolisme des nématodes21), la pertinence de ces interactions pour la biologie de C. elegans dans la nature n’est pas claire. Par conséquent, ce manuscrit décrit les méthodes permettant d’isoler directement C. elegans de la nature et d’isoler et de caractériser par la suite les microbes naturellement associés à la fois des vers uniques et des groupes de vers. Les méthodes décrites sont une version mise à jour et améliorée des procédures utilisées précédemment pour l’isolement et la caractérisation de C. elegans naturel et de son microbiote natif 2,6,7. Étant donné que C. elegans est largement présent dans la matière végétale en décomposition à travers le monde (en particulier dans les fruits pourris, les régions tempérées et en automne)1,2,22,23,24,25, ce protocole peut être appliqué par n’importe quel laboratoire chaque fois qu’il y a un intérêt à relier C. elegans des microbes naturellement associés et donc un contexte plus naturellement pertinent. Ce dernier est essentiel pour une compréhension complète de la biologie du nématode, car il est connu par une diversité d’autres systèmes hôtes que le microbiote associé peut affecter diverses caractéristiques du cycle biologique26, un aspect qui est actuellement largement négligé dans la multitude d’études de C. elegans dans presque toutes les disciplines des sciences de la vie.

<table><tbody><tr><td>COMSOL</td><td>Logiciel de simulation multiphysique</td> <td>COMSOL</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et caractérisation du microbiote naturel du nématode modèle caenorhabditis elegans

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Le nématode Caenorhabditis elegans interagit avec une grande diversité de micro-organismes dans la nature. En général, C. elegans se trouve couramment dans la matière végétale pourrie, en particulier les fruits pourris comme les pommes ou sur les tas de compost. Il est également associé à certains hôtes invertébrés tels que les limaces et les cloportes. Ces habitats sont riches en microbes, qui servent de nourriture à C. elegans et qui peuvent également coloniser de manière persistante l’intestin des nématodes. À ce jour, la diversité et la cohérence exactes du microbiote indigène de C. elegans dans les habitats et les emplacements géographiques ne sont pas entièrement comprises. Nous décrivons ici une approche appropriée pour isoler C. elegans de la nature et caractériser le microbiote des vers. Les nématodes peuvent être facilement isolés des matières compostables, des pommes en décomposition, des limaces ou attirés en plaçant des pommes sur des tas de compost. Le moment idéal pour trouver C. elegans dans l’hémisphère nord est de septembre à novembre. Les vers peuvent être éliminés du substrat collecté en immergeant le substrat dans une solution tampon, puis en collectant des nématodes et en les transférant sur un milieu de croissance des nématodes ou un tampon PCR pour une analyse ultérieure. Nous illustrons en outre comment les échantillons peuvent être utilisés pour isoler et purifier les micro-organismes associés aux vers et pour traiter les vers pour l’analyse de l’ARN ribosomique 16S de la composition de la communauté du microbiote. Dans l’ensemble, les méthodes décrites pourraient stimuler de nouvelles recherches sur la caractérisation du microbiote de C. elegans dans les habitats et les emplacements géographiques, aidant ainsi à obtenir une compréhension globale de la diversité et de la stabilité du microbiote du nématode comme base pour de futures recherches fonctionnelles.

Le nématode C. elegans est fréquemment trouvé dans les fruits en décomposition, tels que les pommes, ainsi que dans les échantillons de compost. Dans le nord de l’Allemagne, C. elegans ainsi que des espèces congénériques (en particulier C. remanei mais aussi C. briggsae) se trouvent principalement de septembre au2 novembre. Les nématodes se trouvent le plus souvent dans la matière végétale en décomposition, en particulier les fruits pourris tels que les pommes o...

Caenorhabditis elegans est l’une des principales espèces modèles en biologie, mais presque toutes les recherches sont effectuées en l’absence de ses microbes naturellement associés. Les méthodes décrites ici aideront à améliorer notre compréhension de la diversité des microbes associés comme base pour les futures recherches fonctionnelles sur C. elegans.

Isolement et caractérisation du microbiote naturel du nématode modèle Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Ce protocole permet de mieux comprendre le microbiote naturel de C.elegans. Simultanément, les microbes isolés peuvent être utilisés dans des expériences de laboratoire contrôlées pour caractériser les interactions microbiote-hôte et la biologie de C. elegans. Ce protocole se concentre sur l’isolement des microbes associés à C. elegans dans la nature, qui sont donc essentiels pour comprendre la biologie de cet hôte modèle important dans un contexte plus naturel.Il sera utile de se familiariser avec l’apparence de Caenorhabditis par rapport à d’autres nématodes. Pipetter sous le cadre de la dissection peut être difficile au début, mais la pratique sera utile. Commencez par recueillir les échantillons environnementaux comme le compost ou les fruits pourris dans des sacs en plastique séparés, des tubes ou des contenants propres.Répartir uniformément les morceaux des échantillons environnementaux prélevés dans une boîte de Petri vide stérile de neuf centimètres et ajouter environ 20 millilitres de milieu visqueux stérile pour couvrir l’échantillon avec le milieu. Au microscope à dissection, rechercher des nématodes Caenorhabditis en suivant les lignes directrices sur l’isolement de Caenorhabditis elegans et des nématodes apparentés. À l’aide d’une pipette de 20 à 100 microlitres, prélever la plus petite quantité possible de liquide contenant les nématodes Caenorhabditis de la plaque et la transférer dans la boîte de Petri de trois centimètres contenant un à trois millilitres de M9T stérile.Pour établir une population de vers, les vers individuels peuvent être transférés sur une plaque avec un milieu de croissance de nématodes ou NGM. Pour laver les nématodes et éliminer les microbes présents à l’extérieur des nématodes, incuber dans M9T pendant 10 à 15 minutes. Extraire à la pipette la plus petite quantité possible de liquide contenant les nématodes et la transférer dans une nouvelle boîte de Petri stérile de trois centimètres contenant un à trois millilitres de M9T frais.Pour une identification impartiale des microbes associés aux nématodes, préparer une plaque de 96 puits avec environ trois billes stériles d’un millimètre de diamètre et ajouter un mélange de 19,5 microlitres de tampon PCR et 0,5 microlitre de protéinase K par puits. Transférer un seul nématode lavé dans chaque puits avec le moins de liquide possible. Briser les nématodes transférés à l’aide d’un homogénéisateur de billes pendant trois minutes à 30 hertz et centrifuger les plaques ou les tubes à 8 000 g pendant 10 secondes à température ambiante pour amener le liquide au fond.Pour identifier C. elegans, chauffer les échantillons dans un cycleur PCR pendant une heure à 50 degrés Celsius et 15 minutes à 95 degrés Celsius pour isoler l’ADN de nématodes individuels, ou utiliser des trousses commerciales pour isoler l’ADN des populations de vers. Congeler l’ADN isolé à moins 20 degrés Celsius pour un stockage à long terme. Utilisez l’ADN et la paire d’amorces NLP 30 avant et NLP 30 inversé et produisez un produit PCR à 154 paires de bases.Pour isoler les bactéries, préparez une plaque de 96 puits avec environ trois billes stériles d’un millimètre, 20 microlitres de tampon M9 par puits, et pipeter un seul nématode lavé dans chaque puits avec le moins de liquide possible. Briser les nématodes comme démontré avant d’utiliser un homogénéisateur de billes, suivi d’une brève centrifugation de la plaque pour amener le liquide au fond. Une fois cela fait, récupérez la suspension et diluez-la en série à une proportion de un à 10.Plaquer jusqu’à 100 microlitres de suspension diluée sur des plaques de gélose de neuf centimètres. Incuber ensuite les plaques à 15 à 20 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures. Pour obtenir la culture bactérienne pure, prélevez une seule colonie dans la plaque incubée à l’aide d’une boucle stérile ou d’un cure-dent et faites-la glisser sur une nouvelle plaque de gélose contenant le même milieu gélosé utilisé lors de la purification.Assurez-vous de n’utiliser que 1/3 de la plaque. Ensuite, stérilisez une boucle réutilisable ou utilisez une nouvelle boucle stérile et faites-la glisser à travers la première traînée pour créer une deuxième traînée sur une autre partie 1/3 de la plaque d’échantillonnage. Répétez-le en faisant glisser une boucle à travers la deuxième traînée et en créant la troisième traînée pour obtenir la croissance de la colonie unique.Incuber la plaque dans les mêmes conditions de croissance que celles utilisées pour l’isolation et, si nécessaire, répéter l’étape de purification. Cultiver les colonies pures dans un milieu liquide en utilisant les mêmes conditions de température et de croissance. Ensuite, caractérisez les bactéries en extrayant l’ADN bactérien de cultures liquides pures amplifiant l’ARN ribosomique 16S à l’aide de 27 amorces directes et 1495 amorces inverses et en effectuant la PCR comme décrit dans le texte.Lorsque les échantillons de fruits et de compost prélevés ont été distribués dans des boîtes de Petri et immergés dans un milieu liquide ou visqueux, les vers ont quitté le substrat et nagé à la surface du milieu. Les microbes ont été isolés sous forme de colonies uniques pures et la purification a joué un rôle essentiel car certaines bactéries associées à C. elegans peuvent former des biofilms ou s’agréger facilement, ce qui donne lieu à des cultures multi-espèces. La PCR utilisant les amorces spécifiques de C.elegans, à savoir NLP 30 avant et NLP 30 arrière, a abouti à l’amplification d’un produit de 154 paires de bases pour C.elegans.L’ADN isolé à partir de vers uniques a entraîné de faibles bandes de PCR, tandis que l’extraction de l’ADN des populations de vers composées d’au moins 50 vers a donné une plus grande quantité et des bandes plus claires. Le succès de la PCR spécifique de C. elegans a été confirmé en exécutant l’ADN d’une souche de laboratoire à savoir N2 comme témoin positif simultanément avec l’ADN des nématodes isolés Les microbes sont partout. Par conséquent, il est essentiel de travailler dans des conditions stériles pour s’assurer que les microbes isolés sont vraiment associés au ver dans la nature.Les microbes isolés peuvent être utilisés pour étudier les interactions hôte-microbiote ou le rôle des microbes sur la biologie de l’hôte, par exemple, le vieillissement, le développement ou l’immunité dans des expériences de laboratoire contrôlées. Les microbes isolés avec cette technique sont actuellement utilisés par la communauté C.elegans pour améliorer la compréhension de la diversité du microbiote sur la condition physique de l’hôte ou le rôle des microbes sur l’immunité.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source : Taylor, M. N., et.al. Utilisation de données sur un seul ver pour quantifier l’hétérogénéité des interactions entre Caenorhabditis elegans et les bactéries. J. Vis. Exp. (2022)Cette vidéo démontre l’exposition de vers Caenorhabditis elegans exempts de germes et d’âge apparié à une souche bactérienne pour la colonisation intestinale. Il explique l’élimination sélective des bactéries non adhérentes et externes, ne laissant que les bactéries viables adhérant à l’épithélium intestinal pour...

Évaluation de la colonisation bactérienne intestinale chez C. elegans exempt de germes

Source : Petersen, C. et al., Isolement et caractérisation du microbiote naturel du nématode modèle Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)Cette vidéo montre l’isolement et la culture d’espèces bactériennes associées à Caenorhabditis elegans. Une lyse par billes de C. elegans, suivie d’une culture sélective, permet d’isoler diverses souches microbiennes pour une analyse ultérieure.

Isolement et culture de Caenorhabditis elegans - Bactéries associées

Nous présentons ici le nématode Caenorhabditis elegans comme un modèle d’hôte polyvalent pour étudier l’interaction microbienne.

Le nématode Caenorhabditis Elegans - un modèle polyvalent In Vivo pour étudier les Interactions hôtes-microorganismes

Les nématodes sauvages de Caenorhabditis sont associés à de nombreux microbes, souvent dans la lumière intestinale ou infectant l’intestin. Ce protocole détaille une méthode pour enrichir les microbes inculturables colonisant l’intestin, en tirant parti de la résistance de la cuticule de dauer.

Nettoyage sélectif des nématodes sauvages de Caenorhabditis pour enrichir les bactéries du microbiome intestinal

Ce protocole décrit une méthode pour extraire efficacement les nématodes vivants des substrats naturels sur le terrain.

Isolement rapide des nématodes sauvages par Baermann Funnel

Ce protocole peut être utilisé pour effectuer des études écologiques à grande échelle sur les nématodes de Caenorhabditis auto-identifiés. Le principal avantage de cette méthode est l’organisation et l’analyse efficaces des données écologiques et moléculaires associées aux nématodes collectés dans la nature.

Une approche hautement évolutive pour effectuer des études écologiques sur les nématodes de Caenorhabditis Selfing

Les microbes intestinaux peuvent avoir un impact positif ou négatif sur la santé de leur hôte via des mécanismes spécifiques ou conservés. Caenorhabditis elegans est une plate-forme pratique pour dépister de tels microbes. Le présent protocole décrit le dépistage à haut débit de 48 isolats bactériens pour déterminer leur impact sur la résistance au stress des nématodes, utilisés comme indicateur de la santé des vers.

Criblage à haut débit d’isolats microbiens ayant un impact sur la santé de Caenorhabditis elegans

Les microbes intestinaux, y compris les bactéries extracellulaires et les agents pathogènes intracellulaires comme le virus d’Orsay et les microsporidies (champignons), sont souvent associés aux nématodes sauvages Caenorhabditis . Cet article présente un protocole pour détecter et quantifier les microbes qui colonisent et/ou infectent les nématodes C. elegans , et pour mesurer la charge pathogène après des infections contrôlées en laboratoire.

Hybridation in situ par fluorescence d’ARN (FISH) pour visualiser la colonisation microbienne et l’infection dans les intestins de Caenorhabditis elegans

Ce protocole décrit une perturbation de 96 puits de Caenorhabditis elegans colonisés par des bactéries individuelles à la suite d’une paralysie par le froid et d’un blanchiment de surface pour éliminer les bactéries externes. La suspension résultante est plaquée sur des plaques de gélose pour permettre une quantification précise et à débit moyen de la charge bactérienne dans un grand nombre de vers individuels.

Utilisation de données à un seul ver pour quantifier l’hétérogénéité dans les interactions caenorhabditis elegans-bactériennes

Les microcosmes de compost apportent la diversité microbienne trouvée dans la nature en laboratoire pour faciliter la recherche sur le microbiome chez Caenorhabditis elegans. Voici des protocoles pour la mise en place d’expériences de microcosme, les expériences démontrant la capacité de moduler la diversité microbienne environnementale pour explorer les relations entre la diversité microbienne environnementale et la composition du microbiome intestinal du ver.

Microcosmes de compost en tant qu’environnements naturels diversifiés sur le plan microbien pour la recherche sur le microbiome chez Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans est un modèle puissant pour examiner les déterminants moléculaires à l’origine des interactions hôte-microbiome. Nous présentons un pipeline à haut débit profilant les niveaux de colonisation du microbiome intestinal chez un seul animal ainsi que des aspects clés de la physiologie de C. elegans.

Application de la vermimétrie de flux pour la quantification et l’analyse du microbiome intestinal de Caenorhabditis elegans

Découvrez l'isolement du microbiote naturel de Caenorhabditis elegans pour étudier les interactions hôte-microbiote. Cette méthode permet d'analyser le rôle des microbes sur la biologie du nématode modèle.

Isolement et caractérisation du microbiote naturel du nématode modèle Caenorhabditis elegans

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