Reconstitution de la motilité à base d’actine avec des protéines disponibles dans le commerce

Avec un simple mélange d’ingrédients et de surfaces fonctionnalisées, ce protocole recrée une fonction vitale des cellules, mouvement alimenté par l’assemblage de l’actine. Les mécanismes biochimiques et biophysiques de la production de force peuvent être évalués en faisant varier le mélange d’ingrédients et les propriétés de la surface fonctionnalisée. Le principal avantage de ce protocole est que tous les ingrédients peuvent être achetés, de sorte qu’une expertise en purification des protéines n’est pas nécessaire.

Cela permet aux non-spécialistes d’utiliser ce système comme outil dans leurs recherches. Ce protocole fournit un module d’enseignement de premier cycle, donnant aux étudiants une expérience pratique de la manipulation des protéines et de l’observation d’un système biologique auto-préparé au microscope. Ils peuvent contrôler et faire varier les paramètres du système.

L’analyse physique, telle qu’une équation de Langmuir, peut être exécutée sur des trajectoires. Commencez par remettre en suspension les protéines lyophilisées. Rassemblez le solide au fond du tube en centrifugeant des poudres de protéines à quatre degrés Celsius.

Ensuite, ajoutez de l’eau selon les instructions du fabricant et incuber sur de la glace pendant au moins 15 minutes. Mélanger doucement par pipetage. Gardez-le sur la glace pendant encore 15 minutes et mélangez à nouveau.

Recueillir la solution au fond du tube par centrifugation. Remixer et aliquote sur glace. Pour dépolymériser les oligomères d’actine formés lors de la lyophilisation et de la congélation, diluez une partie aliquote d’actine remise en suspension huit fois dans un tampon G enrichi d’ATP, de DTT et d’actine marquée à 10%.

Laissez-le se dépolymériser sur la glace en mélangeant occasionnellement pendant au moins quelques jours à une semaine avant de mesurer la concentration en protéines. Pour mesurer les concentrations protéiques des protéines en suspension, préparez d’abord une série de dilutions BSA. Commencez par placer deux tubes de millilitre et 1,5 millilitre dans une grille comme décrit dans le manuscrit.

Remplissez un tube conique de 15 millilitres jusqu’au sommet avec le réactif Bradford et placez-le sur de la glace. Prenez 200 microlitres de réactif Bradford et éjectez-le dans le tube conique pour mouiller l’embout de la pipette. Comme la solution est visqueuse, pipeter lentement pour permettre à la solution d’entrer et de sortir complètement de l’embout sans faire de bulles.

Ensuite, à l’aide de l’embout pré-humide, pipeter 200 microlitres de réactif Bradford dans chacun des tubes de 1,5 millilitre du rack. Et remettez le contenu restant du tube conique de 15 millilitres dans la bouteille. Mesurez l’eau dans les tubes de deux millilitres des rangées un, trois et cinq.

Préparer la série de dilution BSA en diluant la solution mère de BSA étalonnée comme décrit dans le manuscrit. Ensuite, faites des dilutions en série en transférant 900 microlitres de chaque solution dans le tube suivant. Ajoutez 800 microlitres d’eau dans le tube de réactif Bradford pour l’ébauche et démarrez la minuterie.

Mélanger 800 microlitres de chaque norme BSA avec 200 microlitres de réactif Bradford dans les tubes préparés. Dans les cinq minutes suivant le mélange avec le réactif Bradford ou chaque étalon dans une cuvette jetable, lisez l’absorbance à 600 nanomètres. Représenter graphiquement les valeurs d’absorbance obtenues en fonction de la concentration connue de BSA et obtenir une corrélation linéaire avec une valeur R de 0,99.

Dans les tubes contenant 2000 microlitres d’eau, diluer doucement les protéines résolubilisées comme décrit dans le manuscrit. Ajouter immédiatement 800 microlitres de chaque solution au réactif Bradford préparé et mélanger. Lisez les absorbances dans le spectrophotomètre dans les cinq minutes.

Calculer les concentrations de protéines à l’aide de la courbe standard construite précédemment. Pour le revêtement du cordon, pré-refroidir la centrifugeuse à quatre degrés Celsius. Pipeter 50 microlitres de tampon Xb dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Bien mélanger la suspension de billes de 4,5 micromètres de diamètre par vortex et ajouter neuf microlitres de la suspension au tube contenant le tampon Xb. Centrifuger les échantillons à 20 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Pour enduire les billes, retirez délicatement le surnageant sans déranger les billes et remettez en suspension la pastille de bille dans 40 microlitres de SpVCA micromolaire dans un tampon Xb en pipetant doucement.

Maintenant, agitez les perles dans le bloc sec à 1000 RPM pendant 20 minutes à 18 degrés Celsius. Ensuite, lavez les billes enduites par centrifugation. Retrait du surnageant et remise en suspension des billes dans 50 microlitres de Xb froid avec 1% de BSA.

Après avoir lavé les billes, remettre en suspension la pastille de bille enduite dans 120 microlitres de Xb froid, 1% BSA. Conserver sur de la glace dans un réfrigérateur ou une chambre froide. Préparer le mélange de réaction de motilité tel que décrit dans le manuscrit.

Mélangez rapidement la réaction et démarrez la minuterie. Repérez tout le mélange de réaction de motilité sur une lame. Couvrez-le d’un couvercle de 18 millimètres sur 18 millimètres et scellez-le avec du VALAP fondu à l’aide d’un petit pinceau.

Pour obtenir des vitesses de déplacement moyennes pour toute une population de perles, enregistrez le contraste de phase ou les images fixes fluorescentes au fil du temps en balayant la diapositive entière. Mesurez la longueur de la comète à la main et consignez les valeurs. Tracez la longueur de la comète en fonction du temps.

La pente de l’ajustement linéaire est la vitesse de croissance moyenne. Sélectionnez des films en accéléré en microscopie à contraste de phase pour évaluer la vitesse de chaque bille. Selon la vitesse du cordon et la résolution requise, prenez des images toutes les 1 à 10 secondes.

Utilisez l’outil de suivi de n’importe quel programme de traitement d’image pour obtenir des vitesses et des trajectoires de perles. Le mélange des normes BSA avec le réactif Bradford donne une solution avec des teintes bleues graduées. Les valeurs d’absorbance sont tracées par rapport aux concentrations de protéines standard et la corrélation linéaire est utilisée pour déterminer les concentrations de protéines en remise en suspension.

Le mélange de billes codées SPVCA et d’un milieu de motilité contenant une protéine de coiffage conduit à la formation de nuages d’actine en quelques minutes. La polarisation des nuages se produit à environ cinq minutes et la production de comètes à 15 à 20 minutes. Les comètes d’actine continuent de s’allonger pendant de nombreuses heures, mais une vitesse constante n’est pas maintenue.

La motilité des billes est donc évaluée en une heure. Le mélange de motilité avec une protéine de coiffage ou de la gelsoline donne des comètes de la même manière. Les nuages d’actine se sont polarisés pour former des comètes dans les 20 premières minutes de réaction et les comètes s’allongent avec le temps.

L’évaluation des longueurs de comètes mesurées au fil du temps est utilisée pour calculer la vitesse de déplacement. En l’absence d’activité de coiffage, des nuages d’actine se forment autour des perles, mais la formation de comètes ne se produit pas. Une manipulation et un pipetage soigneux des protéines sont essentiels au succès de cette procédure, non seulement lors de la fabrication du mélange de motilité, mais également lors de la mesure des concentrations de protéines avec le test de Bradford.

La formation des comètes et les trajectoires des billes obtenues avec ce protocole permettent de comprendre le mécanisme physique du mouvement à l’aide de la matière molle et de l’analyse physique statistique et de l’expérimentation biophysique, y compris les mesures de force et la micromanipulation.