Applications techniques des enregistrements de microélectrodes et de patch clamp sur des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

L’évaluation de la sécurité cardiaque est un élément crucial du processus de développement du médicament. Les cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC se sont révélés être un modèle fiable, efficace et humain pour l’évaluation préclinique de la sécurité cardiaque. Nous avons établi des méthodologies pour étudier de manière exhaustive les caractéristiques fonctionnelles des cardiomyocytes humains dérivés des CSPi, qui sont très importants pour la modélisation de la maladie, le dépistage de la toxicité cardio induite par les médicaments et la médecine de précision.

L’incorporation croissante de cardiomyocytes humains dérivés de CSPi dans le processus standard d’évaluation préclinique de l’innocuité a le potentiel d’améliorer la précision de la prédiction de la toxicité des composés d’un candidat. Commencez par cultiver les cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC pendant au moins 10 jours avant de prendre la mesure. Allumez le régulateur de température et réglez-le à 37 degrés Celsius.

Allumez le microscope, l’appareil photo et l’alimentation en dioxyde de carbone. Remplissez la chemise d’eau du porte-plaque avec une quantité appropriée d’eau désionisée stérile. Placez la plaque de 96 puits sur le porte-plaque et incuber les cellules pendant au moins cinq minutes.

Ouvrez le logiciel d’affichage, puis réglez la fréquence d’images de la caméra sur 75 images par seconde et la résolution de la vidéo ou de l’image sur 1024 x 1024 pixels. Appliquez les fonctions de mise au point automatique et de luminosité automatique, enregistrez des vidéos et des images de cardiomyocytes dérivés de l’iPSC humain. Placez soigneusement une gouttelette de huit microlitres de solution de revêtement à matrice extra cellulaire sur la zone de l’électrode d’enregistrement de chaque puits des plaques de réseau de microélectrodes de 48 puits.

Ajoutez ensuite trois millilitres d’eau désionisée stérile dans la zone entourant les puits pour empêcher l’évaporation de la solution de revêtement. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres, retirez la majeure partie du milieu de matrice extracellulaire de la surface du puits dans la même rangée ou colonne sans toucher les électrodes. Ensemencer 50 000 cellules par puits dans une gouttelette de huit microlitres de milieu d’ensemencement sur la zone de l’électrode d’enregistrement.

Répétez jusqu’à ce que tous les puits aient été plaqués avec des cellules. Incuber ensuite les plaques de réseau de microélectrodes dans un incubateur de culture cellulaire humidifié. Ajouter lentement 150 microlitres de milieu d’ensemencement à chaque puits des plaques de réseau de microélectrodes.

Le jour 10 après le placage, vérifier la densité de la monocouche CM iPSC humaine battante spontanément au microscope. Placez la plaque de réseau de microélectrodes à 48 puits dans l’instrument d’enregistrement. Assurez-vous que la température est de 37 degrés Celsius et que le dioxyde de carbone est de 5%Ouvrez le logiciel de navigation.

Dans la fenêtre de configuration expérimentale, sélectionnez la configuration cardiaque en temps réel et les enregistrements de potentiel sur le terrain. Appliquez des configurations de battement spontanées ou collées. Dans les paramètres de détection des battements, définissez le seuil de détection sur 300 microvolts, la période de battement minimale sur 250 millisecondes et la période de battement maximale sur cinq secondes.

Sélectionnez la régression polynomiale pour le calcul de la durée potentielle du champ. Vérifiez si le signal d’activité électrique de base est mature et stable, et acquérez les activités cardiaques de base pendant une à trois minutes. Effectuez l’enregistrement 10 jours après le placage.

Remplacez le milieu de maintenance iPSC CM humain par la solution de tyrode et laissez les cellules s’acclimater pendant 15 minutes. Insérez les capteurs de température dans la chambre et placez l’antenne parabolique de 35 millimètres à l’intérieur. Ajustez la température à 37 degrés Celsius.

Tirez les micropipettes des capillaires en verre borosilicaté à l’aide d’un extracteur de micro-pipettes. Remplissez les micropipettes avec la solution intracellulaire et insérez-les dans le support connecté à la platine de l’amplificateur de patch campl. Ouvrez le logiciel d’acquisition, chargez le protocole d’enregistrement du potentiel d’action et sélectionnez la configuration de la pince de tension.

Insérez la micropipette dans la solution du bain et sélectionnez les CM iPSC humains appropriés. Ajustez et abaissez la position de la micropipette à côté de la cellule sélectionnée à l’aide d’un micromanipulateur. Lorsque l’embout de la pipette est inséré dans la solution du bain, vérifiez la résistance de la pipette sur le moniteur de l’oscilloscope.

Placez la pipette près de la cellule, et les impulsions de courant diminueront légèrement pour refléter la résistance croissante de l’étanchéité. Appliquez une aspiration douce avec une pression négative pour augmenter la résistance. Cela formera un gigasceau.

Appliquez ensuite la fonction de sceau. Appliquez une aspiration supplémentaire pour briser la membrane afin d’obtenir une configuration d’enregistrement de cellule entière. À ce stade, passez du mode de serrage de tension au mode de serrage de courant, ou pas d’injection de courant à l’aide du dialogue de l’amplificateur.

Appuyez sur le bouton d’enregistrement pour générer et enregistrer les fichiers d’enregistrement potentiels d’action. Effectuez la mesure transitoire du calcium au moins 10 jours après le placage. Préparer la solution de tyrode frais et la solution de chargement Fura-2 AM.

Aspirez le milieu de maintenance humain iPSC CM et lavez deux fois les chambres avec la solution de tyrode. Appliquez 100 microlitres de solution de chargement Fura-2 AM et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Remplacer la solution de chargement Fura-2 AM par la solution de tyrode et incuber pendant au moins cinq minutes pour une deestérification complète de Fura-2 AM. Ajouter une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif d’immersion d’huile 40x d’un microscope à épifluorescence inversée.

Placez la chambre cellulaire dans l’adaptateur de scène du microscope. Installez les fils du régulateur de température dans la chambre du bain et réglez-la à 37 degrés Celsius. Installez les électrodes de stimulation de champ électrique et réglez les impulsions à 0,5 hertz avec une durée de 20 millisecondes.

Allumez la source lumineuse de commutation de longueur d’onde ultra haute vitesse et réglez-la sur le mode de commutation rapide de 340 nanomètres et 380 nanomètres. Appliquez un temps d’exposition de 20 millisecondes pour les deux longueurs d’onde et un temps d’enregistrement de 20 secondes. Enregistrez la vidéo reflétant les changements en temps réel du calcium transitoire, exportez les données vers une feuille de calcul pour analyse.

La monocouche de cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC a été utilisée pour la mesure du mouvement de contraction. L’analyse d’une trace du mouvement de relaxation de contraction à l’aide du logiciel d’analyse a détecté le début des contractions, le pic de contraction, la fin de la contraction, le pic de relaxation et la fin de relaxation. Une couverture complète de la monocouche de cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC a été observée sur toutes les électrodes dans les plaques de réseau de microélectrodes.

Les formes d’onde matures enregistrées par chaque électrode reflétaient le potentiel du champ cardiaque avec des caractéristiques identifiables. Après analyse, la période de battement, la durée potentielle du champ et l’amplitude du pic ont été obtenues. Les enregistrements de patch de cellules entières en mode de serrage actuel ont enregistré les potentiels d’action spontanée de cardiomyocytes simples.

Après analyse, plusieurs paramètres, dont l’amplitude, le potentiel diastolique maximal et la durée du potentiel d’action, ont été obtenus. Après l’analyse de l’imagerie calcique, le rapport F340 par F380 au fil du temps a été obtenu et des traces brutes de transitoires de calcium stimulés ont été tracées. De plus, des paramètres tels que l’amplitude, le calcium diastolique et la désintégration du calcium tau ont été obtenus.

Il est important d’utiliser les cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC qui sont dans de bonnes conditions de battement, ainsi que d’assurer la haute pureté des cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC. Ce protocole comprend quatre techniques spécifiques pour étudier la fonctionnalité des cardiomyocytes dérivés de l’iPSC humaine, d’autres configurations, ou l’étude automatique des courants ioniques cardiaques qui jouent un rôle crucial dans le