Name: Imagerie en direct des premiers progéniteurs cardiaques dans l’embryon de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Découvrez l'imagerie en direct des progéniteurs cardiaques précoces chez l'embryon de souris. Cette méthode permet d'étudier la cardiogenèse et les processus dynamiques du développement embryonnaire en temps réel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs remercient le Dr Kenzo Ivanovitch pour ses travaux antérieurs sur cette méthode et le groupe du Dr Shigenori Nonaka (National Institutes of Natural Sciences, Japon) pour avoir fourni l’expertise initiale sur le montage d’embryons. Cette étude a été soutenue par la subvention PGC2018-096486-B-I00 du ministère espagnol de la Ciencia e Innovación et la subvention H2020-MSCA-ITN-2016-722427 du programme Horizon 2020 de l’UE à MT et la subvention 1380918 du programme opérationnel FEDER Andalucía 2014-2020 à JND. MS a été soutenu par une bourse de doctorat de la Fondation La Caixa (LCF / BQ / DE18 / 11670014) et la bourse de voyage de la Compagnie des biologistes (DEVTF181145). Le CNIC est soutenu par le ministère espagnol des Sciences et la Fondation ProCNIC.

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale du CNIC, par la Communauté de Madrid (référence PROEX 220/15) et conformes à la directive européenne 2010/63UE et à la recommandation 2007/526/CE concernant la protection des animaux utilisés à des fins expérimentales et à d’autres fins scientifiques, appliquées dans la loi espagnole en vertu du Real Decreto 1201/2005.
Ce protocole comprend l’utilisation de deux mâles de la lignée de souris transgéniques fluorescentes signalant l’activité de NOTCH Tg(CBF:H2BVenus,+)18. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur les matériaux, les animaux et l’équipement utilisés dans ce protocole.
1. Personnalisation des outils et des supports
<ol><li>Couper des morceaux de fil de tungstène de 1 cm de long et les affûter à un diamètre de 0,02 à 0,05 mm en utilisant l’une des méthodes simples disponibles, par exemple, en immergeant la pointe du fil dans une solution saturée de nitrite de sodium19.</li>
	<li>Préparez les capillaires en verre coudé.<ol><li>Placez le point médian d’un capillaire en verre standard de 1,0 mm sur un briquet Bunsen pendant 3 à 6 s, en tirant lentement des deux extrémités jusqu’à ce que le capillaire devienne mince et flexible. À ce stade, cassez le capillaire en deux et chauffez-le brièvement pour produire une courbure à 90° à 2 cm de la pointe.</li>
	</ol></li>
	<li>Scie un morceau de polyméthacrylate de méthyle mesurant environ 7 mm de long, 4 mm de large et 2 mm d’épaisseur (figure 3D). REMARQUE : Les feuilles de polyméthacrylate de méthyle peuvent être obtenues à partir d’équipement de laboratoire recyclé ou commandées neuves.</li>
	<li>Tenez le morceau de méthacrylate à l’aide d’un étau de banc. Ensuite, percez des trous de taille personnalisée transversalement sur toute la pièce (Figure 3D). REMARQUE: En règle générale, les embryons de souris E6.5 à E7.5 nécessitent l’utilisation de perceuses de 0,2 à 0,5 mm de diamètre.<ol><li>Faites pivoter la perceuse lentement tout en appliquant une pression faible mais constante. Si une perceuse se brise à l’intérieur du support, jetez la pièce, car le métal ne peut pas être retiré.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilisez une lime fine pour lisser les bords du support et ajuster sa taille. De plus, créez une pente douce sur les bords du support pour faciliter le positionnement de l’embryon (Figure 3D).</li>
	<li>Placez le support fini dans un plat avec de l’eau distillée pour le rincer.</li>
	<li>Vérifiez le support sous le stéréomicroscope pour voir si les trous contiennent de la poussière de forage. Si de la poussière est présente, utilisez des aiguilles en tungstène pour l’enlever.</li>
	<li>Pour stériliser le support, placez-le dans un tube conique rempli d’eau distillée et sonicez-le pendant 20 minutes avec une puissance de sortie minimale de 20 W.</li>
</ol>2. Préparation des médias
<ol><li>Pour inactiver thermiquement le système du complément, laissez deux aliquotes de 500 μL de sérum de 20 rats commercial ou fait maison à 56 °C pendant30 min. NOTE: Pour un protocole détaillé sur la façon de préparer le sérum de rat, voir21.</li>
	<li>Dans une hotte de culture cellulaire, préparer deux aliquotes du milieu pour la culture des embryons au microscope. Pour chacun, mélanger 490 μL de DMEM pour l’imagerie de cellules vivantes, 500 μL de sérum de rat inactivé et 10 μL de pénicilline-streptomycine pour obtenir une concentration finale de 50 μg/mL de pénicilline et de 50 μg/mL de streptomycine22. NOTE: Le volume de milieu de culture dépend du temps et du nombre d’embryons à cultiver. En règle générale, une croissance optimale nécessite un minimum de 200 μL par embryon et par jour chez les embryons E7.0.</li>
	<li>À l’aide d’une seringue de 2 mL, filtrer le milieu à travers un filtre à membrane de 0,22 μm de la taille des pores dans un nouveau tube et le placer ouvert dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C et 7 % de CO2 pendant 1 h avant la culture embryonnaire23.</li>
	<li>Préparer le milieu de dissection en ajoutant à un flacon de 500 mL de DMEM complété par une bouteille de L-glutamine : 50 mL de sérum bovin fœtal, 10 mL de HEPES-NaOH 25 mM (pH 7,2) et 10 mL de pénicilline et de streptomycine (50 mg/mL).</li>
	<li>Ensuite, séparez-le en aliquotes de 50 mL, placez trois aliquotes dans un bain à 37 °C et conservez le reste à 4 °C jusqu’à 3 mois.</li>
</ol>3. Dissection embryonnaire
<ol><li>Euthanasier une souris enceinte E6.75-E7.5.</li>
	<li>Extrayez l’utérus et placez-le sur une lingette en papier sèche et propre. Ensuite, coupez l’utérus, en insérant la pointe de ciseaux fins du côté mésométrial et en faisant glisser la lame pour exposer les décidues et les transférer dans le milieu de dissection. Pour un protocole détaillé, voir24.</li>
	<li>Disséquer les embryons en gardant intact le cône ectoplacentaire (Figure 3A,B). Pour une méthode de dissection détaillée, voir25.</li>
	<li>Ensuite, décollez la membrane de Reichert, en laissant une partie sur la région extraembryonnaire (Figure 3B). REMARQUE: Des pinces fines sont essentielles pour cette étape. Les utilisateurs inexpérimentés peuvent disséquer des embryons sur des plats enrobés de gel d’agarose à 2 % pour éviter de plier les pointes des pinces contre la surface de la boîte (Figure 3C).</li>
	<li>Pour garder le milieu de dissection chaud, remplacez-le toutes les 10 minutes. De plus, disséquer les décidues par groupes de 3-4 tout en conservant le reste dans un milieu de dissection placé dans un bain à 37 °C. Placer immédiatement les embryons disséqués dans un milieu de culture.</li>
	<li>Sélectionnez les embryons présentant les caractéristiques de fluorescence souhaitées à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence et placez-les dans le tube contenant le milieu de culture dans l’incubateur de culture cellulaire.</li>
	<li>Si les embryons sont aux stades E6.5 à E7.0, fermez le couvercle et laissez les embryons récupérer pendant 2 heures avant l’imagerie. REMARQUE: Les embryons E6.5 à E7.0 sont sensibles. Ils peuvent également être placés directement sous le microscope, mais la préculture permet de sélectionner ceux qui se rétablissent le mieux de la dissection, ce qui augmente les chances de succès.</li>
</ol>4. Préparation du microscope
<ol><li>Allumez tous les composants du microscope, y compris les lasers, l’ordinateur et les logiciels. Allumez les régulateurs de température et réglez à 37 °C 3 h à l’avance pour assurer l’équilibre.</li>
	<li>Si vous utilisez un objectif de détection par immersion, nettoyez-le à l’aide d’une lingette jetable sans résidus. Trempez la pointe de l’objectif dans de l’eau bidistillée à l’aide d’un plat de 60 mm et laissez-la jusqu’au début de l’acquisition.</li>
	<li>Allumez le contrôleur de CO2 et réglez-le sur 7%.</li>
	<li>Placez une goutte de graisse de silicium sous vide poussé sur un plat de 35 mm avec un fond en verre (14 mm de diamètre), placez le support sur le dessus de la goutte et appuyez doucement pour l’immobiliser.</li>
	<li>Sous un stéréomicroscope, ajouter le milieu de culture pour remplir la partie en verre du plat. Ce faisant, dirigez le flux vers les trous du support pour éviter la formation de bulles d’air.</li>
	<li>Si les bulles restent, utilisez le capillaire en verre préparé à l’étape 1.2, relié à un tube en silicone avec un embout buccal, pour aspirer doucement les bulles. REMARQUE: L’extrémité coudée du capillaire facilitera l’accès par les trous.</li>
</ol>5. Montage d’embryons
<ol><li>Transférez 2-3 embryons qui ont été laissés à récupérer dans l’incubateur dans le plat avec le porteur. Laissez le reste dans l’incubateur comme sauvegarde.</li>
	<li>Placez les embryons dans les trous à l’aide d’une paire de pinces et d’une aiguille en tungstène effilée. Utilisez l’aiguille pour accrocher l’embryon par le cône ectoplacentaire et insérez-le dans un trou de taille correspondante. Pour immobiliser l’embryon, faites pivoter le cône de 90 à 120° afin que la membrane de Reichter adhère aux parois du trou (Figure 3C). Pour une autre description, voir26.</li>
	<li>Déplacez délicatement la capsule contenant les embryons et le support sur la plaque de microscope (Figure 3F,G). REMARQUE: S’il n’est pas déplacé régulièrement, l’embryon peut sortir du support.</li>
	<li>Abaisser l’objectif jusqu’à ce qu’un ménisque liquide se forme à l’interface moyen-objectif.</li>
	<li>Localisez l’embryon à l’aide de la lumière transmise sous la jumelle du microscope et placez l’embryon au point.</li>
	<li>Montez la chambre d’incubation et scellez-la autour de l’objectif à l’aide de ruban adhésif (Figure 3F).</li>
	<li>À l’aide d’une capture en direct au logiciel de contrôle du microscope, ajustez les niveaux de sortie laser et de gain. REMARQUE : Pour l’acquisition à deux photons de la protéine fluorescente verte (GFP) et des rapporteurs Tdtomato, une puissance laser de sortie de 30 % à 980 nm et un gain de 70 % sur des détecteurs non numérisés ont été utilisés dans ce protocole (Figure 3G).</li>
	<li>Pour éviter l’évaporation, recouvrez le milieu d’huile de paraffine en l’égoutter lentement sur l’objectif. REMARQUE: C’est le dernier point où des embryons supplémentaires peuvent être montés dans le support. Une fois recouvert d’huile de paraffine, il faudrait nettoyer le support et remplacer le milieu pour le faire. Pour d’autres méthodes de montage, voir27.</li>
</ol>6. Acquisition d’images
<ol><li>Configurez l’enregistrement accéléré. Définissez un intervalle de temps de 5 à 10 minutes avec un espace z de 3 à 5 μm entre les piles. Laissez un espace vide au-dessus de la pile z pour anticiper la croissance de l’embryon, un minimum de 50 μm, en ajoutant 30 μm pour chaque heure où l’acquisition ne sera pas supervisée.</li>
	<li>Si disponible, activez l’option Enregistrement automatique pour permettre la supervision de l’acquisition à partir d’un ordinateur personnel afin de permettre l’ajustement de la taille de la pile z, si nécessaire, pour l’adapter à la zone d’intérêt dans le focus.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64273/64273fig03.jpg"> Figure 3 : Outils d’imagerie en direct et configuration. (A) Dissection d’embryons de souris avec une boîte enrobée d’agarose au stéréomicroscope. (B) Schéma des étapes de dissection des embryons de souris pour l’imagerie vivante. C) Positionnement de l’embryon dans le porteur. D) Conception et caractéristiques du porte-embryons. (F) Chambre d’incubateur autour de l’objectif d’immersion. (G) Schéma de la configuration finale pour l’acquisition en accéléré. Barre d’échelle = 500 μm (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64273/64273fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<ol><li>Tyser, R. C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+handling+precedes+cardiac+differentiation+to+initiate+the+first+heartbeat%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat.</a> eLife. 5, 17113(2016).</li>
<li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750(2014).</li>
<li>Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+lineage+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocardial lineage development.</a> Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).</li>
<li>Tam, P. P., Parameswaran, M., Kinder, S. J., Weinberger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allocation+of+epiblast+cells+to+the+embryonic+heart+and+other+mesodermal+lineages%3A+the+role+of+ingression+and+tissue+movement+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation.</a> Development. 124 (9), Cambridge, England. 1631-1642 (1997).</li>
<li>Kinder, S. J., Loebel, D. A. F., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allocation+and+early+differentiation+of+cardiovascular+progenitors+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Allocation and early differentiation of cardiovascular progenitors in the mouse embryo.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 11 (5), 177-184 (2001).</li>
<li>Lawson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Fate mapping the mouse embryo.</a> International Journal of Developmental Biology. 43 (7), 773-775 (1999).</li>
<li>Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+heart+tube+development+in+mouse+reveals+alternating+phases+of+cardiac+differentiation+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis.</a> eLife. 6, 30668(2017).</li>
<li>Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deployment+of+cell+lineages+that+form+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The deployment of cell lineages that form the mammalian heart.</a> Nature Reviews Cardiology. 15 (11), 705-724 (2018).</li>
<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).</li>
<li>Meilhac, S. M., Lescroart, F., Blanpain, C. D., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+cell+lineages+that+form+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiac cell lineages that form the heart.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (9), 013888(2014).</li>
<li>Sendra, M., Domínguez, J. N., Torres, M., Ocaña, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+complexity+of+early+heart+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Dissecting the complexity of early heart progenitor cells.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (1), 5(2022).</li>
<li>McDole, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+and+reconstruction+of+post-implantation+mouse+development+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level.</a> Cell. 175 (3), 859-876 (2018).</li>
<li>Saykali, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mesoderm+migration+phenotypes+in+extra-embryonic+and+embryonic+regions+of+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Distinct mesoderm migration phenotypes in extra-embryonic and embryonic regions of the early mouse embryo.</a> eLife. 8, 42434(2019).</li>
<li>Ichikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+whole+mouse+embryos+during+gastrulation%3A+Migration+analyses+of+epiblast+and+mesodermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of whole mouse embryos during gastrulation: Migration analyses of epiblast and mesodermal cells.</a> PLoS ONE. 8 (7), 64506(2013).</li>
<li>Tyser, R. C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+characterization+of+a+gastrulating+human+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo.</a> Nature. 600 (7888), 285-289 (2021).</li>
<li>Aguilera-Castrejon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+utero+mouse+embryogenesis+from+pre-gastrulation+to+late+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis.</a> Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).</li>
<li>Yue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+toto+live+imaging+of+cardiomyocyte+behaviour+during+mouse+ventricle+chamber+formation+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">in toto live imaging of cardiomyocyte behaviour during mouse ventricle chamber formation at single-cell resolution.</a> Nature Cell Biology. 22 (3), 332-340 (2020).</li>
<li>Nowotschin, S., Xenopoulos, P., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+single-cell+resolution+live+imaging+reporter+of+Notch+signaling+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A bright single-cell resolution live imaging reporter of Notch signaling in the mouse.</a> BMC Developmental Biology. 13 (1), 15(2013).</li>
<li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharpened+tungsten+needles%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Sharpened tungsten needles.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2012).</li>
<li>Tam, P. P., Snow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+culture+of+primitive-streak-stage+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The in vitro culture of primitive-streak-stage mouse embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 59, 131-143 (1980).</li>
<li>Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+serum+for+culturing+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat serum for culturing mouse embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5593(2011).</li>
<li>Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postimplantation+mouse+development%3A+Whole+embryo+culture+and+micro-+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Postimplantation mouse development: Whole embryo culture and micro- manipulation.</a> International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).</li>
<li>González Hinojosa, F. Optimización de propiedades fisicoquímicas y medios de cultivo para el cultivo del embrión de ratón ex vivo. Universidad de Jaén. Biología Experimental. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hdl.handle.net/10953.1/1400">https://hdl.handle.net/10953.1/1400</a> (2021).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+A+laboratory+manual%2C+Fourth+Edition%22">Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth Edition</a>. , Cold Harbor Laboratory Press. 814(2014).</li>
<li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), e160(2006).</li>
<li>Nonaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+mouse+nodal+flow+by+applying+artificial+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Modification of mouse nodal flow by applying artificial flow.</a> Methods in Cell Biology. 91, 287-297 (2009).</li>
<li>Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+postimplantation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of postimplantation mouse embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5595(2011).</li>
<li>Crainiciuc, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+immune+landscapes+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Behavioural immune landscapes of inflammation.</a> Nature. 601 (7893), 415-421 (2022).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Les premiers progéniteurs cardiaques s’organisent dans un tube cardiaque primitif qui commence à battre alors qu’il est encore en formation. Comprendre comment ce processus se déroule est essentiel pour identifier le large spectre des malformations cardiaques congénitales à des événements morphogénétiques spécifiques. Pour cela, l’imagerie en direct offre la possibilité d’étudier le développement embryonnaire normal et défectueux avec une résolution temporelle accrue. Ceci est particulièrement utile pour étudier les cell...

Le cœur se forme tôt au cours de l’embryogenèse pour commencer à pomper les nutriments vers l’embryon entier, tandis qu’il continue à se développer1. Chez les embryons de souris, un jour et demi après le début de la gastrulation, un organe cardiaque rudimentaire s’assemble au pôle antérieur 2,3. Au stade Early Streak (ES), les progéniteurs cardiaques de l’épiblaste pénètrent à travers la traînée primitive jusqu’à la couche mésodermique naissante 4,5,6 et commencent à migrer vers le pôle antérieur, où ils se différencient pour former le tube cardiaque primitif. Tout au long de ce processus, les premiers progéniteurs cardiaques subissent des réarrangements cellulaires, des transformations de forme et une différenciation, en plus de la migration7 (Figure 1).
Les premiers progéniteurs cardiaques attirent les chercheurs depuis près d’un siècle en raison de leur capacité remarquable à différencier et à construire un organe fonctionnel simultanément. Au cours des deux dernières décennies, l’analyse clonale et les modèles d’élimination conditionnelle ont montré que le développement cardiaque précoce implique des sources cellulaires distinctes dans un processus hautement dynamique 8,9,10. Cependant, la structure 3D du tube cardiaque primitif et la nature dynamique de sa morphogenèse le rendent difficile à étudier (Figure 1), et nous sommes loin d’en comprendre toute la complexité11.
Pour étudier ces processus cellulaires dynamiques, les méthodes d’imagerie en direct offrent maintenant un détail sans précédent 7,12,13,14. Dans le modèle murin, les approches en direct ont été essentielles pour interroger les sujets de développement qui sont difficiles à aborder par l’analyse statique 7,13,15. Alors que la culture ex vivo à long terme et les configurations de microscope robustes progressent rapidement16,17, peu de chercheurs ont l’expertise nécessaire pour imager avec succès des embryons vivants. Bien que les publications papier fournissent suffisamment de détails techniques pour reproduire des expériences d’imagerie en direct, certaines compétences et astuces sont difficiles à saisir sans exemples visuels ou assistance entre pairs. Pour accélérer ce processus d’apprentissage et étendre l’utilisation de l’imagerie en direct parmi les laboratoires, nous avons assemblé un protocole vidéo (Figure 2) qui rassemble les compétences nécessaires pour effectuer une imagerie en direct sur des embryons de souris en phase gastrulée.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64273/64273fig01.jpg"> Figure 1 : Différenciation précoce des cellules progénitrices cardiaques dans l’embryon de souris depuis le début de la gastrulation jusqu’au stade précédant la formation primitive du tube cardiaque. Les cellules progénitrices cardiaques pénètrent dans le mésoderme peu après le début de la gastrulation, migrant vers le côté opposé de l’embryon. Le stade morphologique et le stade embryonnaire du jour (E) sont écrits au-dessus des diagrammes. Les flèches pointillées représentent la trajectoire de migration des progéniteurs primitifs du tube cardiaque pendant la gastrulation. Ce chiffre a été adapté de11. Abréviations : ES = Early Streak; MS = Traînée moyenne; EHF = pli précoce de la tête. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64273/64273fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64273/64273fig02.jpg"> Figure 2 : Diagramme de flux de travail pour l’imagerie en direct des premiers progéniteurs cardiaques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64273/64273fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>#55 Pince</td><td>Dumont&nbsp ;</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Plat de 35 mm avec fond de lamelle en verre 14 mm de diamètre</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Table d’étau de 35 mm&nbsp ;</td><td>Grandado</td><td>SKU 8798771617573 Tubes de</td><td></td></tr><tr><td>50 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Eau</td><td></td><td></td><td></td>distillée</tr><tr><td>DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle</td><td>Medium Gibco</td><td>11966025</td><td>&nbsp ; avec L-Glutamine, sans glucose, sans Na Pyruvate</td></tr><tr><td>Sérum fœtal</td><td>bovin Invitrogen</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>Souris transgéniques rapporteures fluorescentes (Tg(CBF :H2BVenus,+)&nbsp ;</td><td>JAX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorobrite DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A1896701</td><td>DMEM pour l’imagerie de cellules vivantes</td></tr><tr><td>Graisse silicone sous vide poussé</td><td>Dow Corning</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Support pour fils</td><td>Perlen Pressen</td><td>pwb1</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780 Microscope droit</td><td>Zeiss&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Détecteur laser pulsé rouge lointain MaiTai Deepsee réglé à 980 nm</td><td>Détecteurs Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non Descanned équipés des ensembles de filtres jaune cyan (BP450-500/BP520-560), vert-rouge (BP500-520/BP570-610) et jaune-rouge (BP520-560/BP645-710)</td><td>Zeiss&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obj : 20x trempage dans l’eau 1.0 NA, longue distance de travail</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Pipettes <td></td><td></td><td></td><td>P1000 et P200</td></tr><tr><td>Huile de paraffine</td><td>Nidacon</td><td>VNI0049</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td> <td>(la concentration finale doit être de 50 &mu ; g/mL de pénicilline et 50 &mu ; g/mL streptomycine)</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri 35 mm x 10 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Pointes</td><td></td><td></td><td></td>de pipette</tr><tr><td>Polyméthacrylate de méthyle&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Réutilisé à partir d’anciens équipements de laboratoire</td></tr><tr><td>Rat Culture de sérum, embryon, rats mâles SPRAGUE DAWLEY RjHan SD</td><td>Janvier Labs</td><td>9979</td><td></td></tr><tr><td>Set de fines de 160 mm</td><td>RS PRO</td><td>541-6933</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre standard de 1,0 mm</td><td>Anima Lab</td><td>&nbsp ; 1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>Stérile 0,22 &mu ; Filtre à seringue Corning</td><td></td><td>431218</td><td></td></tr><tr><td>Seringue stérile de 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>15809152</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles en tungstène</td> Homogénéisateur <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>à ultrasons (sonicateur)</td><td>Bandelin</td><td>BASO_17021</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie en direct des premiers progéniteurs cardiaques dans l’embryon de souris

Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo

Les premières étapes du développement cardiaque impliquent des changements drastiques dans le comportement et la différenciation cellulaire. Alors que l’analyse d’embryons fixes permet d’étudier en détail des stades de développement spécifiques dans un instantané fixe, l’imagerie en direct capture des événements morphogénétiques dynamiques, tels que la migration cellulaire, les changements de forme et la différenciation, en imageant l’embryon au fur et à mesure de son développement. Cela complète l’analyse fixe et élargit la compréhension de la façon dont les organes se développent au cours de l’embryogenèse. Malgré ses avantages, l’imagerie en direct est rarement utilisée dans les modèles murins en raison de ses défis techniques. Les embryons précoces de souris sont sensibles lorsqu’ils sont cultivés ex vivo et nécessitent une manipulation efficace. Pour faciliter une utilisation plus large de l’imagerie en direct dans la recherche sur le développement de la souris, cet article présente un protocole détaillé pour la microscopie vivante à deux photons qui permet l’acquisition à long terme dans les embryons de souris. En plus du protocole, des conseils sont fournis sur la manipulation des embryons et l’optimisation de la culture. Cela aidera à comprendre les événements clés de l’organogenèse précoce de la souris, améliorant ainsi la compréhension de la biologie des progéniteurs cardiovasculaires.

Nous avons utilisé le protocole pour visualiser l’activation de la signalisation NOTCH chez les progéniteurs cardiaques précoces sur le point de se différencier en cellules endothéliales au cours de la morphogenèse primitive du tube cardiaque. Pour cela, nous avons croisé des souris C57BL / 6-N de type sauvage avec des souris Tg (CBF: H2BVenus, +)18 pour obtenir des embryons signalant une activité NOTCH via la protéine fluorescente jaune Vénus. À E7.5, la fluorescence de Vénus est présente dans to...

Nous présentons un protocole détaillé pour la culture et l’imagerie d’embryons de souris qui permet l’imagerie 3D + temps des cellules progénitrices cardiaques. Cette boîte à outils vidéo aborde les compétences clés requises pour réussir l’imagerie en direct autrement difficile à acquérir à partir de publications textuelles.

Imagerie en direct des premiers progéniteurs cardiaques dans l’embryon de souris

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail ...

Ce protocole permet d’imager les embryons de souris au fur et à mesure de leur développement. Cela permet d’étudier en détail la cardiogenèse précoce. Comme la prise d’images fixes de faux embryons, l’imagerie en direct donne un accès complet au processus dynamique d’étude dans le développement de l’embryon.Les compétences requises pour l’imagerie de la vie sont difficiles à saisir à partir de la publication de texte seulement. Regarder une autre personne le faire est essentiel pour apprendre. Pour commencer, coupez des morceaux de fil de tungstène d’un centimètre de long et aiguisez-les à 0,02 à 0,05 millimètre de diamètre en immergeant la pointe du fil dans une solution saturée de nitrate de sodium.Pour préparer les capillaires en verre coudé, placez le point médian d’un capillaire en verre standard d’un millimètre sur un briquet Bunsen pendant trois à six secondes, en tirant lentement des deux extrémités jusqu’à ce que le capillaire devienne mince et flexible. Ensuite, cassez le capillaire en deux et chauffez-le brièvement pour produire une courbure de 90 degrés à deux centimètres de la pointe. J’ai vu un morceau de polyméthacrylate de méthyle mesurant environ sept millimètres d

live-imaging-of-early-cardiac-progenitors-in-the-mouse-embryo

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

L'imagerie des tissus embryonnaires en temps réel est difficile sur de longues périodes de temps. Nous présentons ici une analyse pour surveiller les changements cellulaires et sub-cellulaire de la moelle épinière de poulet pendant de longues périodes avec une résolution spatiale et temporelle. Cette technique peut être adaptée pour d'autres régions du système nerveux et de l'embryon en développement.

Imagerie à haute résolution en direct du comportement des cellules dans le développement neuro-épithélium

Mort foetale et périnatale est une caractéristique commune lors de l'étude des altérations génétiques qui affectent le développement cardiaque. L'imagerie ultrasonore haute fréquence a permis d'améliorer la résolution 2-D et peut fournir d'excellents renseignements sur le développement cardiaque précoce et est une méthode idéale pour détecter l'impact sur la structure et la fonction cardiaques avant son décès.

Murin échocardiographie fœtale

Progénitrices neurales mitose est un paramètre critique de la neurogenèse. Une grande partie de notre compréhension des neurones progéniteurs mitose est basé sur l'analyse des tissus fixés. Imagerie en temps réel dans des tranches de cerveau embryonnaire est une technique souple pour évaluer la mitose avec une résolution temporelle et spatiale dans un environnement contrôlé.

Imagerie en direct de la mitose dans les développement Cortex souris embryonnaires

Nous décrivons une série de méthodes pour injecter des colorants, des vecteurs d'ADN, des virus et des cellules, afin de contrôler à la fois le destin des cellules et le phénotype des cellules endogènes et greffés dérivés de cellules embryonnaires ou pluripotentes à l'intérieur des embryons de souris au jour embryonnaire (E) de 9,5 et les étapes ultérieures de développement.

Cellule étiquetage et l&#39;injection dans le développement embryonnaires coeurs de souris

Ici, nous présentons un protocole d'injecter des agents de contraste ultrasonores de microbulles dans la vie, isolés en fin de gestation embryons murins de la scène. Cette méthode permet l'étude des paramètres de perfusion et de marqueurs moléculaires vasculaires au sein de l'embryon en utilisant à haute fréquence échographie de contraste amélioré.

Imagerie de contraste dans les embryons de souris utilisant à haute fréquence à ultrasons

Les mutations qui conduisent à des malformations cardiaques congénitales bénéficient de l’investigation in vivo de la structure cardiaque au cours du développement, mais les études structurelles à haute résolution dans le cœur embryonnaire de souris sont techniquement difficiles. Nous présentons ici une méthode robuste d’immunofluorescence et d’analyse d’images pour évaluer les structures spécifiques aux cardiomyocytes dans le cœur de souris en développement.

Analyse du développement des cardiomyocytes par immunofluorescence dans le Coeur embryonnaires de souris

Nous décrivons un protocole permettant d’imager volumétriquement des cellules marquées par des protéines fluorescentes profondément à l’intérieur de cœurs embryonnaires et postnatals intacts. En utilisant des méthodes de nettoyage des tissus en combinaison avec la coloration de l’ensemble du support, des cellules uniques marquées par des protéines fluorescentes à l’intérieur d’un cœur embryonnaire ou postnatal peuvent être imagées de manière claire et précise.

Imaging Effacé embryonnaire et postnatal coeurs à la résolution unicellulaire

Nous décrivons ici un protocole pour toute monture immunofluorescence et imageur l’analyse quantitative volumétrique des embryons de souris stade précoce. Nous présentons cette technique comme une approche puissante pour qualitativement et quantitativement évaluer les structures cardiaques au cours du développement et proposer qu’il peut être largement adaptable à d’autres systèmes d’organe.

Analyse quantitative Immunofluorescence entier-montent des Populations de progéniteurs cardiaques chez des embryons de souris

Dans cette méthode, les tissus cardiaques embryonnaires sont chirurgicalement microdissected, dissocié, fluorescent étiquetés et implanté dans les tissus embryonnaires de l’hôte. Ceci fournit une plate-forme pour l’étude de l’organisation du développement niveau individuel ou de tissus dans des conditions hémodynamiques ectopiques, et/ou altération paracrine/juxtacrine environnements.

Microinjection-based System for In Vivo l’Implantation des Cardiomyocytes embryonnaires chez l’embryon aviaire

Nous présentons les protocoles afin d’examiner le développement de coeur de souris au microscope de toute monture épifluorescente sur des embryons de souris disséqués de ventriculaire spécifiques MLC-2v-tdTomato journaliste souris knock-in. Cette méthode nous permet de directement visualiser chaque étape de la formation ventriculaire au cours du développement de coeur de souris sans fastidieuses méthodes histochimiques.

Analyse du développement de la chambre cardiaque durant l’embryogenèse de souris à l’aide de toute monture épifluorescence

Découvrez l'imagerie en direct des progéniteurs cardiaques précoces chez l'embryon de souris. Cette méthode permet d'étudier la cardiogenèse et les processus dynamiques du développement embryonnaire en temps réel.

Imagerie en direct des premiers progéniteurs cardiaques dans l’embryon de souris

Explorer plus de vidéos