Système d’analyse cellulaire hybride pour évaluer les changements structurels et contractiles de cardiomyocytes humains dérivés de CSPi pour l’évaluation préclinique du risque cardiaque

La méthode peut aider à répondre à une question préclinique liée à la sécurité cardiaque et à la toxicité en utilisant des données humaines réelles pour une transition sûre des nouveaux médicaments candidats aux stades cliniques. Au lieu d’utiliser un ensemble de différentes techniques in vitro et in vivo, le principal avantage de ce système hybride est l’évaluation simultanée du cardiomyocyte humain dérivé de l’iPC, des paramètres électrophysiologiques et de viabilité, et l’analyse des propriétés contractiles dans des conditions physiologiques. Cette méthode peut être appliquée à la découverte de médicaments car elle couvre les changements électrophysiologiques, structurels et contractiles des cardiomyocytes et un système à débit plus élevé qui permet de tester 69 puits simultanément.

Pour commencer le revêtement de la plaque, laissez le fond de la plaque de contraction recouvert par le protecteur de membrane fourni en plus jusqu’à la mesure dans le module de contractilité. Pour l’ensemencement des cardiomyocytes, préparez une solution diluée d’enrobage de gel EHS en transférant 2,75 millilitres de solution de gel EHS prête à l’emploi et 8,25 millilitres de DPBS avec du calcium et du magnésium dans un tube centrifuge stérile. Ensuite, mélangez la solution.

Retirez le protège-membrane de la plaque de contraction. Transférer la solution de revêtement préparée dans un réservoir de réactifs stérile dans le robot d’automatisation du laboratoire. Utilisez le programme, ajoutez 100 microlitres avec le robot d’automatisation de laboratoire et ajoutez 100 microlitres de solution de revêtement par puits.

Replacez ensuite le couvercle sur la plaque de 96 puits et incuber pendant trois heures à 37 degrés Celsius. Après avoir décongelé et compté les cellules, ajustez les cellules dans le milieu de placage recommandé conformément aux instructions du fabricant de la cellule, ce qui donne 11 fois 10 à la sixième cellule par 11 millilitres pour ensemencer une plaque entière de 96 puits. Utilisez le programme retirer 100 microlitres pour retirer la solution de gel EHS des puits avec le robot d’automatisation de laboratoire.

Ensuite, transférez les 11 millilitres de suspension cellulaire dans un réservoir de réactifs stériles placé dans le robot d’automatisation du laboratoire et ensemencez les cellules avec 100 microlitres de suspension par puits. En utilisant le programme, les cellules ajoutent 100 microlitres. Immédiatement après l’ensemencement cellulaire, transférez la plaque flexible de 96 puits dans l’incubateur à humidité contrôlée à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone, et laissez les cellules se déposer pendant la nuit.

Chauffer 22 millilitres de milieu d’entretien cardiomyocytaire à ajouter à chaque plaque à 37 degrés Celsius dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. 18 à 24 heures après l’ensemencement des plaques, transférez le milieu frais dans un réservoir de réactif stérile et laissez-le à côté du robot d’automatisation du laboratoire. Ensuite, effectuez l’élimination du milieu avec le programme, retirez 100 microlitres.

Ensuite, placez le réservoir de réactif contenant le milieu frais dans le robot d’automatisation du laboratoire et distribuez 200 microlitres de milieu frais par puits avec le programme, ajoutez 100 microlitres. Effectuez cette étape deux fois pour atteindre 200 microlitres par puits. Immédiatement après l’échange de milieu, transférez la plaque dans l’incubateur.

Effectuer un échange moyen tous les deux jours jusqu’à l’ajout du composé. Quatre à six heures avant l’ajout du composé, effectuez un dernier changement de milieu en transférant 22 millilitres de tampon de dosage frais et chaud dans un réservoir de réactifs stérile et en le laissant à côté du robot d’automatisation du laboratoire. Immédiatement après l’échange moyen, transférez la plaque flexible dans l’incubateur.

Une heure avant la mesure de référence, transférez la plaque à l’appareil de mesure respectif. Dans le logiciel de contrôle, ouvrez Modifier le protocole et sélectionnez le mode de mesure, le site Flex ou l’EFP d’impédance correspondant. Définissez la durée ou la durée de balayage d’une mesure à 30 secondes et un intervalle de répétition à 10 minutes avant d’enregistrer le numéro de protocole.

Sélectionnez ensuite Démarrer le protocole et continuez à remplir les champs demandés. Lorsque les paramètres sont définis, sélectionnez Démarrer la mesure. Effectuer au moins trois mesures de base à intervalles de cinq minutes peu de temps avant l’ajout du composé.

Retirer 50 microlitres du tampon d’essai de chaque puits sans retirer la plaque flexible de 96 puits de l’appareil de mesure, puis ajouter 50 microlitres de la solution composée quatre fois concentrée dans chaque puits de la plaque selon le plan de mesure. Après l’ajout du composé, sélectionnez Ajouter un marqueur de réactif pour définir la disposition de la plaque composée et le volume de la solution composée. Sélectionnez ensuite Procéder à la mesure standard ou Continuer avec la série de mesures selon le plan expérimental.

L’analyse représentative montre les effets de l’inhibiteur de kinase Erlotinib sur la contractilité des cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC. À la concentration la plus faible, l’erlotinib a induit une diminution statistiquement non significative de l’amplitude, tandis que les concentrations micromolaires d’erlotinib ont montré des effets cardiotoxiques dépendants du temps et de la dose. L’apparition de l’effet a été observée à partir de 96 heures avec un erlotinib micromolaire, tandis que le traitement par 10 micromolaires d’erlotinib a entraîné une diminution significative 24 heures après l’ajout du composé.

Après l’application de 10 micromolaires Epirubicin, les cellules ont cessé de battre dans les 24 heures. Avec l’application d’une épirubicine micromolaire, une diminution drastique de l’amplitude après 24 heures a été suivie d’un arrêt complet du battement jusqu’à 48 heures. À 100 nanomolaires, une diminution de l’amplitude du battement en fonction du temps a été observée.

À la concentration la plus faible de 10 nanomolaires, l’amplitude fluctuait régulièrement, confirmant que l’effet de l’épirubicine n’était que dose-dépendante. Le traitement par doxorubicine et nifédipine pendant 24 heures réduit la viabilité cellulaire de manière dépendante de la concentration et du temps. Lors de l’application de concentrations croissantes de nifédipine, les enregistrements du potentiel de champ sur les cellules révèlent un raccourcissement dépendant de la concentration de la durée du champ normalisée.

L’évaluation de la nifédipine concernant la contractilité cardiaque a également montré une diminution significative de l’amplitude dépendante de la concentration lors de la mesure aiguë avec 10 concentrations nanomolaires et 13 nanomolaires. Il est important de se rappeler que les cellules sont généralement sensibles aux paramètres environnementaux tels que les changements de température et de pH ainsi qu’à la simulation mécanique qui est particulièrement prise en charge sur les plaques de contraction.