Name: Hybridation fluorescente in situ et marquage de la 5-éthynyl-2-désoxyuridine pour les cellules souches de la méduse hydrozoaire Cladonema pacificum (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Découvrez l'hybridation fluorescente in situ et le marquage EdU pour visualiser les cellules souches proliférantes et non proliférantes chez la méduse Cladonema pacificum. Cette méthode permet d'étudier l'hétérogénéité des cellules souches.

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Ce travail a été soutenu par AMED sous le numéro de subvention JP22gm6110025 (à Y.N.) et par le numéro de subvention JSPS KAKENHI 22H02762 (à Y.N.).

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole.
1. Synthèse de sonde
<ol><li>Extraction d’ARN<ol><li>Placez trois Cladonema medusae vivants cultivés dans de l’eau de mer artificielle (ASW) dans un tube de 1,5 mL à l’aide d’une pipette de transfert de 3,1 mL avec l’embout coupé, et retirez autant d’ASW que possible. NOTE: ASW est préparé en dissolvant un mélange de sels minéraux dans l’eau du robinet avec un neutralisant de chlore; la densité finale (S.G.) est de 1,018 ou les parties pour mille (ppt) sont ~27.</li>
		<li>Congeler les tubes de 1,5 mL dans de l’azote liquide pour inhiber l’activité de la RNase. Ajouter 30 μL de tampon de lyse à partir du kit d’isolement d’ARN total dans lequel du 2-mercaptoéthanol (1 μL/100 μL de tampon de lyse) a été ajouté et homogénéiser les échantillons dans le tampon de lyse à l’aide d’un homogénéisateur. REMARQUE: Pour éviter le débordement du tampon et de l’échantillon des tubes, l’homogénéisation avec une petite quantité de tampon de lyse est recommandée.</li>
		<li>Ajouter 570 μL de tampon de lyse et extraire l’ARN total en suivant le protocole du kit d’isolement de l’ARN total (Figure 1).</li>
		<li>Mesurer la concentration de l’ARN extrait à l’aide d’un spectrophotomètre et conserver à −80 °C jusqu’à utilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse de l’ADNc<ol><li>À l’aide d’un kit, synthétiser l’ADNc en utilisant l’ARN total extrait des méduses comme matrice (Figure 1 et Tableau 1).</li>
		<li>Incuber à 65 °C pendant 5 min.</li>
		<li>Refroidir rapidement sur la glace.</li>
		<li>Effectuer la synthèse de l’ADNc avec le mélange de l’étape 1.2.1 (Tableau 1). Bien mélanger par pipetage et incuber à 42 °C pendant 60 min.</li>
		<li>Incuber à 95 °C pendant 5 min.</li>
		<li>Refroidir rapidement sur la glace.</li>
		<li>Mesurer la concentration de l’ADNc synthétisé à l’aide d’un spectrophotomètre et conserver à −20 °C ou moins jusqu’à utilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse de produits PCR<ol><li>Pour créer un modèle de PCR, concevez l’amorce spécifique à l’aide de Primer-BLAST. Source de la séquence de référence à partir des données NCBI ou des données RNA-seq. REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour les amorces utilisées dans ce protocole.</li>
		<li>Pour amplifier la séquence cible, effectuez le clonage TA, qui ne nécessite pas l’utilisation d’enzymes de restriction. Pour obtenir un produit PCR dans lequel une adénine est ajoutée à l’extrémité 3', utilisez les réglages suivants : 98 °C pendant 2 min ; 35 cycles de 98 °C pendant 10 s, 55-60 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 1 min. Utiliser Taq ADN polymérase pour les réactions (tableau 1). REMARQUE: Pour déterminer les conditions de PCR, suivez le protocole qui accompagne l’ADN polymérase à utiliser, qui fournit généralement une température de recuit recommandée et un temps de prolongation.</li>
		<li>Passez le produit PCR dans un gel d’agarose à 1% et découpez la bande d’intérêt. Extraire les produits PCR des gels coupés à l’aide d’un kit d’extraction de gel.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligature<ol><li>Litérer le produit de PCR sur le vecteur avec des surplombs de thymine 3' en mélangeant les réactifs (tableau 1) et en incubant à 37 °C pendant 30 min (Figure 1). NOTE: Le rapport moléculaire du vecteur:PCR devrait être de 1:>3. La taille du vecteur pTA2 est d’environ 3 kb. Si le produit PCR (insert) est A (kb) et B (ng/μL), le volume de l’insert (X dans le tableau 1) à prélever peut être calculé par ([50 ng de vecteur × A kb d’insert])/(vecteur 3 kb × [ 1/3]) = 50· Un ng d’insert. Si la concentration de l’insert est de B ng/μL, le volume prélevé est de 50· A/B μL d’insert.</li>
	</ol></li>
	<li>Transformation et placage<ol><li>Pour la transformation, décongeler les cellules compétentes sur de la glace et les distribuer en aliquotes de 20 μL chacune. Ajouter 1 μL des plasmides contenant le produit de PCR (moins de 5% du volume cellulaire compétent) et vortex pendant 1 s. Incuber sur glace pendant 5 min, puis incuber à 42 °C pendant 45 s et vortex pendant 1 s.</li>
		<li>Ajouter 180 μL de bouillon Super Optimal avec milieu de répression des catabolites (SOC) (un milieu de culture bactérienne riche sur le plan nutritionnel) aux cellules compétentes et incuber à 37 °C pendant 30 min. Après 30 min, étaler les cellules compétentes sur une plaque de gélose contenant de l’ampicilline, du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-bêta-D-galacto-pyranoside (X-gal) et de l’isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG), et incuber à 37 °C pendant 12-16 h (Figure 1). REMARQUE: X-gal et IPTG sont utilisés pour sélectionner les colonies bleues et blanches.</li>
	</ol></li>
	<li>Culture liquide<ol><li>Choisissez une colonie blanche parmi les colonies blanches et bleues de l’assiette. Ajoutez-le à 3-5 mL de milieu LB avec de l’ampicilline et incuber sur un agitateur pendant 12-16 h à 37 °C (Figure 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Miniprep<ol><li>Extraire le plasmide du milieu LB à l’aide d’une miniprep plasmidique (Figure 1).</li>
		<li>Quantifier la concentration plasmidique à l’aide d’un spectrophotomètre.</li>
	</ol></li>
	<li>Lisez la séquence.<ol><li>Pour lire la séquence d’ADN du plasmide, envoyez le plasmide pour le séquençage de Sanger, puis utilisez un logiciel pour l’aligner avec la séquence génome/transcriptome afin de confirmer si la séquence cible est correctement synthétisée et d’évaluer dans quelle direction la séquence cible est insérée dans le plasmide (5' à 3' ou 3' à 5'). REMARQUE: Si la séquence cible est insérée dans le plasmide dans la direction 5' à 3' à partir du site de liaison de l’ARN polymérase près de l’extrémité 3', une sonde antisens peut être générée par transcription in vitro . Si la séquence cible est insérée dans la direction inverse de 3' à 5', une sonde de détection (contrôle négatif) peut être générée. Si vous utilisez des vecteurs tels que pTA2, deux sites de liaison à la transcription peuvent être utilisés en fonction de l’objectif.</li>
	</ol></li>
	<li>Transcription in vitro <ol><li>Préparer la matrice d’ADN à partir du plasmide créé en effectuant une PCR à l’aide d’amorces à l’extérieur du site de liaison de l’ARN polymérase (p. ex. sites de liaison T7/T3) dans le plasmide (Figure 1). REMARQUE: Les amorces universelles telles que l’amorce directe M13-20 et l’amorce inversée M13 peuvent être utilisées pour préparer un modèle d’ADN qui comprend des sites de liaison à l’ARN polymérase.</li>
		<li>Purifiez le gabarit après amplification PCR à l’aide d’un kit d’extraction gel/PCR.</li>
		<li>Mélanger les réactifs illustrés ci-dessous et effectuer la réaction de transcription à 37 °C pendant 3 h (Figure 1 et Tableau 1).</li>
		<li>Ajouter 1,5 μL de DNase et incuber à 37 °C pendant 30 min.</li>
		<li>Ajouter 10 μL d’eau exempte de RNase et purifier la sonde de la solution de réaction de transcription à l’aide d’une colonne de nettoyage.</li>
		<li>Vérifiez la taille de l’ARN synthétisé en chargeant 1 μL sur un gel d’agarose à 1% et déterminez la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre. REMARQUE : Les sondes à ARN synthétisées doivent avoir une concentration d’au moins 100 ng/μL.</li>
		<li>Ajouter 30 μL de formamide pour stockage à une température égale ou inférieure à −20 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Incorporation et fixation d’EdU
<ol><li>Placer Cladonema medusae (5 à 10 animaux par tube) dans des tubes de 1,5 mL à l’aide d’une pipette de transfert de 3,5 mL et ajouter l’ASW jusqu’à un volume total de 500 μL. Ajouter 7,5 μL de solution mère d’EdU à 10 mM et incuber les échantillons pendant 1 h à 22 °C (figure 2). La concentration finale d’EdU est de 150 μM. REMARQUE : Utilisez des méduses âgées de 5 à 7 jours pour surveiller la formation de la troisième branche (figure 3A). Le jour où les méduses se détachent du polype est compté comme jour 1, et le jour 5, les méduses commencent généralement à présenter une troisième branche sur leurs tentacules principaux.</li>
	<li>Après 1 h, enlever autant d’ASW contenant de l’EdU que possible.</li>
	<li>Pour anesthésier les méduses, ajouter 7% de MgCl2dans H2Oet incuber pendant 5 min.</li>
	<li>Prélever le MgCl2 à 7 % dansH2Oet fixer les méduses pendant une nuit (O.N.) à 4 °C avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans de l’ASW (Figure 2). REMARQUE : Lors de l’exécution de FISH sans incorporation d’EdU, les échantillons peuvent être fixés de la même manière que ceux traités avec EdU après anesthésie (étapes 2.3-2.4).</li>
</ol>3. Hybridation fluorescente in situ
<ol><li>Traitement protéinase et post-fixation<ol><li>Retirer le PFA et laver les échantillons avec du PBS contenant 0,1 % de Tween-20 (PBST) pendant 3 x 10 min. Utilisez 300-500 μL de PBST par lavage. NOTE: De cette étape à la fin de l’hybridation, l’expérience doit être réalisée dans un environnement sans RNase, en portant des gants et un masque. Le 1x PBS dans cette étape doit être fabriqué avec de l’eau traitée DEPC. Après hybridation, 1x PBS fabriqué avec de l’eau sans traitement DEPC peut être utilisé. Certains protocoles ISH et FISH déshydratent les échantillons en utilisant des étapes de méthanol, ce qui permet de conserver les échantillons fixés à -20 ° C jusqu’à utilisation. Pour éviter un travail superflu, le processus de déshydratation est omis de ce protocole, d’autant plus que les échantillons peuvent être conservés dans PBST jusqu’à quelques jours.</li>
		<li>Après la fixation, placer l’échantillon dans des tubes de 1,5 mL sur un agitateur, à l’exception de l’étape d’incubation de l’anticorps anti-DIG-POD O.N. (étape 3.4.2). Après le lavage, ajouter 10 mg/mL de solution mère de protéinase K dans du PBST et incuber les méduses avec la protéinase K (concentration finale : 10 μg/mL) à 37 °C pendant 10 min.</li>
		<li>Prélever la solution de protéinase K et laver les échantillons pendant 2 x 1 min avec du PBST.</li>
		<li>Pour postfixer les méduses, ajouter 4% PFA dans 1x PBS et incuber à 37 °C pendant 15 min.</li>
		<li>Retirer la solution de PFA et laver les échantillons pendant 2 x 10 min avec du PBST. REMARQUE: Si le gène cible est fortement exprimé avec un faible signal de fond, les étapes 3.1.2-3.1.5 peuvent être ignorées.</li>
	</ol></li>
	<li>Hybridation<ol><li>Supprimez le PBST et ajoutez le tampon d’hybridation (tampon HB, tableau 1). Incuber les échantillons dans HB Buffer pendant 15 min à température ambiante (RT). Utilisez 300 à 400 μL de tampon HB, qui fournit suffisamment de volume pour une hybridation réussie. REMARQUE: HB Buffer, Wash Buffer 1 et Wash Buffer 2 sont préparés avec 20x SSC stock. HB Buffer est conservé à une température égale ou inférieure à −20 °C et doit être apporté à RT avant utilisation.</li>
		<li>Retirez la mémoire tampon HB et ajoutez une nouvelle mémoire tampon HB. Préhybrider à 55 °C pendant au moins 2 h dans un incubateur d’hybridation.</li>
		<li>Retirer le tampon HB et incuber avec le tampon HB contenant les sondes stockées à l’étape 1.9.7 (concentration finale de la sonde : 0,5-1 ng/μL dans le tampon HB). Hybrider à 55 °C pendant 18-24 h (Figure 2) dans un incubateur d’hybridation. REMARQUE: L’intensité et la spécificité du signal FISH peuvent varier en fonction de l’expression du gène cible, ainsi que de la longueur et de la spécificité de la sonde. Pour augmenter l’intensité, des paramètres tels que la durée d’hybridation (18-72 h) et la température (50-65 °C) peuvent être ajustés et différentes sondes peuvent être testées. Pour éviter les signaux non spécifiques, le traitement par la protéinase K (concentration et durée) peut être modifié19.</li>
	</ol></li>
	<li>Retrait de la sonde<ol><li>Retirez le tampon HB contenant les sondes, puis ajoutez le tampon de lavage 1 (Tableau 1). Laver les échantillons avec le Wash Buffer 1 pendant 2 x 15 min à 55 °C. Utilisez 300-400 μL de tampon de lavage. REMARQUE: Les sondes contenant HB Buffer peuvent être utilisées à plusieurs reprises, jusqu’à environ dix fois. Au lieu de les jeter, entreposer le tampon HB usagé contenant des sondes à une température inférieure ou égale à −20 °C. Préchauffer le tampon de lavage 1, le tampon de lavage 2, 2x SSC et PBST à 55 °C avant utilisation.</li>
		<li>Retirez la mémoire tampon de lavage 1, puis ajoutez la mémoire tampon de lavage 2 (Tableau 1). Laver les échantillons avec le Wash Buffer 2 pendant 2 x 15 min à 55 °C.</li>
		<li>Retirez Wash Buffer 2, puis ajoutez 2x SSC. Laver les échantillons avec 2x SSC pendant 2 x 15 min à 55 °C.</li>
		<li>Retirez 2x SSC, puis ajoutez PBST préchauffé. Lavez les échantillons pendant 1 x 15 min avec PBST at RT.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubation d’anticorps anti-DIG<ol><li>Supprimez PBST, puis ajoutez un tampon bloquant de 1 %. Incuber les échantillons pendant au moins 1 h à TA tout en agitant lentement sur une bascule. REMARQUE : Préparer fraîchement le tampon de blocage à 1 % en diluant le stock de tampon de blocage à 5 % (Tableau 1). Vérifiez les échantillons avant la prochaine réaction d’anticorps, car l’échantillon a tendance à coller à l’arrière du couvercle ou de la paroi à la suite de secousses.</li>
		<li>Après le blocage, retirer le tampon bloquant à 1 %, ajouter une solution anti-DIG-POD (1:500, dans un tampon bloquant à 1 %) et incuber les échantillons O.N. à 4 °C (Figure 2). REMARQUE: Veillez à maintenir le temps d’incubation dans les 12-16 heures pour éviter la détection de signaux non spécifiques.</li>
	</ol></li>
	<li>Détection de sonde marquée DIG<ol><li>Retirez la solution anti-DIG-POD, puis ajoutez le tampon Tris-NaCl-Tween (TNT, Tableau 1). Laver les échantillons avec du TNT pendant 3 x 10 min à TA. REMARQUE: L’utilisation de la technique d’amplification du signal tyramide (TSA) fournit une meilleure résolution d’image contre les réactifs marqués à la peroxydase de raifort (par exemple, anti-DIG-POD).</li>
		<li>Diluer la solution mère de tyramide (Cy5-tyramide) conjugué à un colorant fluorescent (1:50) dans le tampon de diluant d’amplification pour obtenir la solution active de Cy5-tyramide (Figure 2).</li>
		<li>Retirez autant de TNT que possible, puis ajoutez la solution active de Cy5-tyrmide. Incuber les échantillons pendant 10 min dans l’obscurité.</li>
		<li>Laver les échantillons avec PBST pendant 3 x 10 min dans l’obscurité.</li>
	</ol></li>
	<li>Détection d’EdU REMARQUE : Le kit EdU détecte les signaux fluorescents EdU incorporés (Figure 2).<ol><li>Pour préparer le cocktail de détection EdU, mélangez les composants comme indiqué dans le tableau 1. Utilisez 100 μL de cocktail de détection EdU pour chaque échantillon. REMARQUE: Préparez 1x additif tampon de réaction en diluant 10x additif tampon de réaction avec de l’eau ultrapure.</li>
		<li>Supprimez PBST, puis ajoutez le cocktail de détection EdU. Incuber dans le noir pendant 30 min.</li>
		<li>Laver avec PBST pendant 3 x 10 min dans l’obscurité.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloration de l’ADN<ol><li>Diluer Hoechst 33342 (1:500) dans PBST pour préparer la solution de Hoechst. Supprimez le PBST, puis ajoutez la solution Hoechst. Incuber les échantillons pendant 30 min dans l’obscurité (Figure 2).</li>
		<li>Lavez les échantillons avec du PBST pendant 3-4 x 10 min dans l’obscurité.</li>
	</ol></li>
	<li>Montage<ol><li>Faites une banque sur la lame de verre pour éviter que l’échantillon ne soit écrasé. Appliquez du ruban vinyle sur la lame de verre et creusez le centre.</li>
		<li>Transférer les méduses à la banque sur le verre coulissant à l’aide d’une pipette de transfert de 3,1 ml avec l’embout coupé. REMARQUE: Veillez à ne pas laisser les tentacules se chevaucher.</li>
		<li>Retirez tout PBST à l’aide d’une pipette P200, puis ajoutez lentement 70 % de glycérol comme support de montage (Figure 2). REMARQUE: Au lieu de 70% de glycérol, un support de montage anti-décoloration peut être utilisé pour empêcher la fluorescence de s’estomper.</li>
		<li>Placez délicatement un couvercle sur la méduse à l’aide d’une pince et scellez le côté du couvercle avec du vernis à ongles transparent.</li>
		<li>Gardez les lames à 4 °C dans l’obscurité si vous n’effectuez pas immédiatement une observation microscopique.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagerie<ol><li>Utilisez un microscope confocal à balayage laser pour acquérir des images. Pour une résolution à cellule unique, utilisez une lentille à huile 40x ou une lentille pour un grossissement plus élevé.</li>
		<li>Après l’acquisition de l’image, ouvrez les images à l’aide du logiciel ImageJ/FIJI et comptez les cellules positives pour EdU+ et/ou Nanos1+ par l’outil multipoint20.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Les cellules proliférantes et les cellules souches sont des sources cellulaires importantes dans divers processus tels que la morphogenèse, la croissance et la régénération21,22. Cet article décrit une méthode de co-coloration du marqueur de cellules souches Nanos1 par marquage FISH et EdU chez Cladonema medusae. Des travaux antérieurs utilisant le marquage EdU ou BrdU ont suggéré que les cellules prolifératives se localisent aux bulbes tentacul...

Cnidaria est considéré comme un phylum métazoaire à ramification basale contenant des animaux dotés de nerfs et de muscles, les plaçant dans une position unique pour comprendre l’évolution du développement et de la physiologie des animaux 1,2. Les cnidaires sont classés en deux groupes principaux: les anthozoaires (par exemple, les anémones de mer et les coraux) ne possèdent que des larves de planula et des stades de polypes sessiles, tandis que les méduses (membres des hydrozoaires, des staurozoaires, des scyphozoaires et des cubozoa) prennent généralement la forme de méduses nageant librement, ou méduses, ainsi que de larves et de polypes planula. Les Cnidaires présentent généralement une capacité de régénération élevée, et leurs mécanismes cellulaires sous-jacents, en particulier leur possession de cellules souches adultes et de cellules prolifératives, ont attiré beaucoup d’attention 3,4. Initialement identifiées dans Hydra, les cellules souches hydrozoaires sont situées dans les espaces interstitiels entre les cellules épithéliales ectodermiques et sont communément appelées cellules interstitielles ou cellules i3.
Les cellules i hydrozoaires partagent des caractéristiques communes qui comprennent la multipotence, l’expression de marqueurs de cellules souches largement conservés (par exemple, Nanos, Piwi, Vasa) et le potentiel de migration 3,5,6,7,8. En tant que cellules souches fonctionnelles, les i-cellules sont largement impliquées dans le développement, la physiologie et les réponses environnementales des animaux hydrozoaires, ce qui atteste de leur capacité de régénération élevée et de leur plasticité3. Alors que les cellules souches, similaires aux cellules i, n’ont pas été identifiées en dehors des hydrozoaires, même chez l’espèce modèle établie Nematostella, les cellules prolifératives sont toujours impliquées dans le maintien et la régénération du tissu somatique, ainsi que dans la lignée germinale9. Comme les études sur le développement et la régénération des cnidaires ont été principalement menées sur des animaux de type polype tels que Hydra, Hydractinia et Nematostella, la dynamique cellulaire et les fonctions des cellules souches chez les espèces de méduses restent largement ignorées.
La méduse hydrozoaire Clytia hemisphaerica , une espèce de méduse cosmopolite avec différents habitats à travers le monde, y compris la mer Méditerranée et l’Amérique du Nord, a été utilisée comme animal modèle expérimental dans plusieurs études développementales et évolutives10. Avec sa petite taille, sa manipulation facile et ses œufs volumineux, Clytia convient à l’entretien en laboratoire, ainsi qu’à l’introduction d’outils génétiques tels que les méthodes de transgénèse et d’élimination11 récemment établies, ouvrant la voie à une analyse détaillée des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la biologie des méduses. Dans le tentacule de Clytia medusa, les cellules i sont localisées dans la région proximale, appelée bulbe, et les progéniteurs tels que les nématoblastes migrent vers l’extrémité distale tout en se différenciant en types cellulaires distincts, y compris les nématocytes12.
Lors de la régénération du Clytia manubrium, l’organe buccal des méduses, les cellules Nanos1+ i présentes dans les gonades migrent vers la région où le manubrium est perdu en réponse à des dommages et participent à la régénération du manubrium7. Ces résultats soutiennent l’idée que les cellules i de Clytia se comportent également comme des cellules souches fonctionnelles impliquées dans la morphogenèse et la régénération. Cependant, étant donné que les propriétés des cellules i diffèrent parmi les animaux représentatifs de type polype tels que Hydra et Hydractinia3, il est possible que les caractéristiques et les fonctions des cellules souches soient diversifiées parmi les espèces de méduses. De plus, à l’exception de Clytia, les techniques expérimentales ont été limitées pour les autres méduses, et la dynamique détaillée des cellules prolifératives et des cellules souches est inconnue13.
La méduse hydrozoaire Cladonema pacificum est un organisme modèle émergent qui peut être conservé dans un environnement de laboratoire sans pompe à eau ni système de filtration. Le Cladonema medusa a des tentacules ramifiés, une caractéristique commune dans la famille des Cladonematidae, et un organe photorécepteur appelé ocelle sur la couche ectodermique près du bulbe14. Le processus de ramification du tentacule se produit à un nouveau site de ramification qui apparaît le long du côté adaxial du tentacule. Au fil du temps, les tentacules continuent de s’allonger et de se ramifier, les branches les plus anciennes étant poussées vers la pointe15. De plus, les tentacules du cladonème peuvent se régénérer quelques jours après l’amputation. Des études récentes ont suggéré le rôle des cellules proliférantes et des cellules souches dans la ramification et la régénération des tentacules chez Cladonema16,17. Cependant, alors que l’hybridation in situ conventionnelle (ISH) a été utilisée pour visualiser l’expression génique dans Cladonema, en raison de sa faible résolution, il est actuellement difficile d’observer en détail la dynamique des cellules souches au niveau cellulaire.
Cet article décrit une méthode de visualisation de cellules souches dans Cladonema par FISH et de co-coloration avec EdU, un marqueur de prolifération cellulaire18. Nous visualisons le modèle d’expression de Nanos1, un marqueur de cellules souches 5,17, par FISH, qui permet l’identification de la distribution des cellules souches au niveau de la cellule unique. De plus, la co-coloration de l’expression de Nanos1 avec le marquage EdU permet de distinguer les cellules souches qui prolifèrent activement. Cette méthode de surveillance des cellules souches et des cellules prolifératives peut être appliquée à un large éventail de domaines d’investigation, y compris la ramification des tentacules, l’homéostasie tissulaire et la régénération des organes chez Cladonema, et une approche similaire peut être appliquée à d’autres espèces de méduses.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoéthanol&nbsp ;</td><td>Wako</td><td>137-06862</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert 3,1 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>233-20S</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta ;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td><td>Wako</td><td>029-15043</td><td></td></tr><tr><td>anti-DIG-POD</td><td>Roche</td><td>11207733910</td><td></td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Nanos1 amorce</td><td></td><td></td> avant <td>5'- AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3'</td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Nanos1 amorce</td><td></td><td></td> inversée <td>5'-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3'</td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Piwi amorce</td><td></td><td></td> avant <td>5'- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3'</td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Piwi amorce</td><td></td><td></td> inversée <td>5'- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3'</td></tr><tr><td>Kit de prolifération cellulaire Click-iT EdU pour l’imagerie, colorant Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>C10337</td><td>Kit EdU</td></tr><tr><td>Coroline off</td><td>GEX Co. ltd</td><td>N/A</td><td>Neutralisateur de chlore</td></tr><tr><td>DIG Kit de détection d’acide nucléique Réactif de blocage</td><td>Roche</td><td>11175041910</td><td>tampon de blocage&nbsp ;</td></tr><tr><td>Mélange de marquage de l’ARN DIG³</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp ;</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>ECOS cellule compétente DH5&alpha ;</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-06233</td><td>cellule compétente</td></tr><tr><td>Kit d’extraction rapide de gènes Gel/PCR Kit d’extraction</td><td>de gènes rapides</td><td>FG-91302</td><td>Kit d’extraction de gel</td></tr><tr><td>de gènes rapides Mini kit de plasmide</td><td>de gènes rapides Gène</td><td>rapide FG-90502</td><td>miniprep</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Wako&nbsp ;</td><td>068-00426</td><td></td></tr><tr><td>Sel d’héparine sodique de porc</td><td>SIGMA-ALDRICH&nbsp ;</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl-&beta ;-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Wako</td><td>096-05143</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Invitrogen</td><td>22700-025</td><td>plaque</td>de</tr><tr><td>gélose LB Base de bouillon</td><td>Invitrogen</td><td>12780-052</td><td>LB medium</td></tr><tr><td>Acide maléique</td><td>Wako</td><td>134-00495</td><td></td></tr><tr><td>mini Colonnes d’ARN à spin rapide</td><td>Roche</td><td>11814427001</td><td>colonne de nettoyage</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako&nbsp ;</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop OneC Spectrophotomètre UV-Vis microvolume avec Wi-Fi</td><td>Thermo Scientific</td><td>Spectrophotomètre</td><td>ND-ONEC-W</td></tr><tr><td>Polyoxyéthylène (20) Monolaurate de sorbitan (Tween-20)</td><td>Wako&nbsp ;</td><td>166-21115</td><td></td></tr><tr><td>Presse-Batteur 2</td><td>nippi&nbsp ;</td><td>891300</td><td>homogénéisateur</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Nacarai Tesque&nbsp ;</td><td>29442-14</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de RNase</td><td>TaKaRa</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen&nbsp ;</td><td>74004</td><td>kit d’isolement de l’ARN total</td></tr><tr><td>RQ1 RNase sans RNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Tampon salin de citrate de sodium 20x poudre (20x SSC)</td><td>TaKaRa</td><td>T9172</td><td></td></tr><tr><td>SEA LIFE</td><td>Marin Tech</td><td>N/A</td><td>mélange de sels minéraux</td></tr><tr><td>T3 ARN polymérase&nbsp ;</td><td>ARN</td><td></td> polymérase Roche 11031163001 <td></td></tr><tr><td>T7</td><td>Roche</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>TAITEC HB-100</td><td>TAITEC</td><td>0040534-000</td><td>Incubateur d’hybridation</td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq&nbsp ;</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>Taq DNA polymérase</td></tr><tr><td>TaKaRa PrimeScript 2 1st brin Kit</td> de <td>synthèse d’ADNc</td><td>TaKaRa</td><td>6210A</td></tr><tr><td>Clone</td> cible <td>TOYOBO&nbsp ;</td><td>TAK101</td><td>pTA2 Vector</td></tr><tr><td>ARNt</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>TSA Plus Cyanine 5</td><td>AKOYA Biosciences</td><td>NEL745001KT</td><td>technique d’amplification du signal tyramide (TSA)</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>microscope confocal à balayage laser</td></tr></tbody></table>

hybridation fluorescente in situ et marquage de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine pour les cellules souches de la méduse hydrozoaire cladonema pacificum

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Les cnidaires, y compris les anémones de mer, les coraux et les méduses, présentent une morphologie et des modes de vie variés qui se manifestent par des polypes sessiles et des méduses nageant librement. Comme l’illustrent les modèles établis tels que Hydra et Nematostella, les cellules souches et/ou les cellules prolifératives contribuent au développement et à la régénération des polypes cnidaires. Cependant, les mécanismes cellulaires sous-jacents chez la plupart des méduses, en particulier au stade de la méduse, sont largement flous et, par conséquent, le développement d’une méthode robuste pour identifier des types cellulaires spécifiques est essentiel. Cet article décrit un protocole pour visualiser les cellules proliférantes de type souche chez la méduse hydrozoaire Cladonema pacificum. Cladonema medusae possède des tentacules ramifiés qui se développent continuellement et maintiennent une capacité de régénération tout au long de leur stade adulte, fournissant une plate-forme unique pour étudier les mécanismes cellulaires orchestrés par la prolifération et / ou les cellules souches. L’hybridation in situ fluorescente à montage entier (FISH) à l’aide d’un marqueur de cellules souches permet la détection de cellules de type souches, tandis que le marquage par impulsions avec la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU), un marqueur de phase S, permet l’identification des cellules proliférantes. En combinant à la fois l’étiquetage FISH et EdU, nous pouvons détecter la prolifération active de cellules souches sur des animaux fixes, et cette technique peut être largement appliquée à d’autres animaux, y compris des espèces de méduses non modèles.

Les tentacules du cladonème ont été utilisés comme modèle pour étudier les processus cellulaires de morphogenèse et de régénération15,16,17. La structure du tentacule est composée d’un tube épithélial où des cellules de type souche, ou cellules i, sont situées dans la région proximale, appelée bulbe tentacule, et de nouvelles branches sont ajoutées séquentiellement à l’arrière de la région distale du bulbe le long du cô...

Ici, nous décrivons un protocole pour visualiser les cellules proliférantes de type souche dans la méduse Cladonema. L’hybridation in situ fluorescente à montage entier avec un marqueur de cellules souches permet la détection de cellules souches, et le marquage de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine permet l’identification des cellules proliférantes. Ensemble, des cellules souches proliférant activement peuvent être détectées.

Hybridation fluorescente in situ et marquage de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine pour les cellules souches de la méduse hydrozoaire Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

La co-coloration de l’expression de Nanos1 avec le marquage EdU permet de distinguer les cellules souches qui prolifèrent activement. Nous pouvons identifier la distribution des cellules souches au niveau de la cellule unique chez la méduse Cladonema. Nous pouvons visualiser des cellules souches et des cellules proliférantes dans le même échantillon de méduses, ce qui permet de détecter des cellules souches proliférantes et non proliférantes, ce qui permet de comprendre l’hétérogénéité des cellules souches.Biologie du développement et études de régénération utilisant des modèles animaux incluant des cellules souches. La méduse hydrozoaire Cladonema pacificum est un organisme modèle émergent qui peut être conservé dans un environnement de laboratoire sans aucun système spécialisé. Cladonema medusae a des tentacules ramifiés.La ramification se produit à un nouveau site le long du côté adaxial du tentacule. Au fil du temps, les tentacules continuent de s’allonger et de se ramifier, les branches plus anciennes étant poussées vers la pointe. Les tentacules peuvent également se régénérer quelques jours après l’amputation.La petite taille, la facilité de manipulation et la présence de cellules souches adultes ou de cellules souches font de Cladonema un bon système pour étudier le rôle des cellules souches dans différents processus. Pour commencer, placez Cladonema medusae dans des tubes de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette de transfert de 3,5 millilitres et ajoutez ASW jusqu’à un volume total de 500 microlitres. Ajouter 7,5 microlitres de solution mère d’EdU 10 millimolaires et incuber les échantillons pendant une heure à 22 degrés Celsius.Attendez une heure et retirez autant d’ASW contenant EdU que possible. Après avoir anesthésié les méduses, incuber pendant cinq minutes. Fixer les méduses pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec 4% de paraformaldéhyde dans ASW.Pour le traitement par protéinase et la post-fixation, retirer le paraformaldéhyde et laver les échantillons avec du PBS contenant 0,1% Tween 20 trois fois pendant 10 minutes chacun. Retirez le PBST et ajoutez le tampon d’hybridation. Incuber les échantillons dans le tampon d’hybridation pendant 15 minutes à température ambiante.Supprimez le tampon d’hybridation et ajoutez le nouveau tampon d’hybridation. Pré-hybrider à 55 degrés Celsius pendant au moins deux heures dans un incubateur d’hybridation. Retirez le tampon d’hybridation et incuber avec le tampon d’hybridation contenant les sondes.Hybrider à 55 degrés Celsius pendant 18 à 24 heures dans un incubateur d’hybridation. Ensuite, procédez au retrait de la sonde. Commencez par retirer le tampon d’hybridation contenant les sondes, puis ajoutez un tampon de lavage.Lavez les échantillons avec un tampon de lavage deux fois pendant 15 minutes à 55 degrés Celsius. Retirez le tampon de lavage un et ajoutez le tampon de lavage deux. Lavez les échantillons avec un tampon de lavage deux fois pendant 15 minutes à 55 degrés Celsius.Retirez le tampon de lavage deux, puis ajoutez 2X SSC. Lavez les échantillons avec 2X SSC deux fois pendant 15 minutes à 55 degrés Celsius. Retirez 2X SSC, puis ajoutez PBST préchauffé.Lavez les échantillons pendant 15 minutes avec du PBST à température ambiante. Pour l’incubation d’anticorps anti-DIG, commencez par supprimer le PBST, puis ajoutez un tampon bloquant à 1%. Incuber les échantillons pendant au moins une heure à température ambiante tout en agitant lentement sur une bascule.Après le blocage, supprimez le tampon 1%blocking. Ajouter la solution anti-DIG-POD et incuber les échantillons pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Pour détecter la sonde marquée DIG, retirez la solution anti-DIG-POD et ajoutez le tampon Tris sodium chlorure Tween.Laver les échantillons avec le tampon Tris sodium chlorure Tween trois fois pendant 10 minutes à température ambiante. Diluer la solution mère de tyramide conjuguée à colorant fluorescent dans le tampon de diluant d’amplification pour obtenir la solution active de tyramide Cy5. Retirer autant de tampon Tris sodium chlorure Tween que possible, puis ajouter la solution active de Cy5 tyramide.Incuber les échantillons pendant 10 minutes dans l’obscurité. Lavez les échantillons avec du PBST trois fois pendant 10 minutes dans l’obscurité. Pour préparer le cocktail de détection EdU, mélangez les composants.Retirez PBST, puis ajoutez le cocktail de détection EdU. Incuber l’échantillon dans l’obscurité pendant 30 minutes. Laver avec PBST trois fois pendant 10 minutes dans l’obscurité.Pour la coloration de l’ADN, diluer Hoechst dans du PBST pour préparer la solution de Hoechst. Retirez le PBST, puis ajoutez la solution Hoechst. Incuber les échantillons pendant 30 minutes dans l’obscurité.Lavez les échantillons avec du PBST trois à quatre fois pendant 10 minutes dans l’obscurité. Ensuite, pour le montage, transférez les méduses sur la banque sur le verre coulissant à l’aide d’une pipette de transfert avec la pointe coupée. Placez délicatement un bordereau sur la méduse avec une pince et scellez le côté du couvercle avec du vernis à ongles transparent.Le co-marquage de l’expression de Nanos1 et des cellules positives EdU a révélé le modèle spatial des cellules souches et des cellules prolifératives dans le tentacule. Les cellules EdU positives étaient plus largement réparties dans le bulbe tentacule, tandis que les cellules positives Nanos1 accumulées plus localement au bulbe tentacule et au nouveau site de ramification, suggèrent que des distributions distinctes de cellules souches et de cellules proliférantes sont détectées en fonction du moment du développement et des différents stades. Le comarquage d’EdU et de Nanos1 a été observé dans 19,79% des cellules, ce qui suggère que ces cellules constituent une population de cellules souches en prolifération active.Curieusement, 14,46% des cellules se sont avérées EdU positives Nanos1 négatives au milieu du bulbe et au nouveau site de ramification, suggérant la présence de cellules prolifératives non souches. En revanche, 26,32 % des cellules ont été observées comme étant Nanos1 positives à la base du bulbe et au nouveau site de ramification, ce qui indique la présence d’une population de cellules souches à cycle lent ou au repos, dont aucune n’est détectée par le marquage des impulsions EdU. Le marquage par impulsions EdU avec un temps d’incubation court permet de détecter uniquement des cellules prolifératives parmi les cellules souches et les cellules non souches.Lors de la modification du temps d’incubation de l’EdU et de la combinaison d’expériences de poursuite à long terme, les cellules souches à cycle lent ou d’autres types de cellules, y compris la descendance et les cellules différenciées, peuvent être marquées.

fluorescent-situ-hybridization-5-ethynyl-2-deoxyuridine-labeling-for

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Biologie du développement

Monter toute l'hybridation in situ est l'une des techniques les plus utilisées en biologie du développement. Ici, nous présentons une haute résolution double fluorescentes dans le protocole de l'hybridation in situ pour analyser le profil d'expression précise d'un seul gène et de déterminer le chevauchement des domaines d'expression de deux gènes. Nous incluons une iodure de propidium nucléaires contre-coloration pour mettre en évidence l'organisation tissulaire.

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Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Nous rapportons ici l'expression robuste et efficace de protéines fluorescentes après l'injection d'ARNm dans des ovocytes non fécondés de Branchiostoma lanceolatum. Le développement de la technique de micro-injection dans ce chordés basale ouvrira la voie à grande portée des innovations techniques dans ce système de modèle émergent, y compris l'imagerie in vivo et les manipulations spécifiques de gènes.

L'expression de protéines fluorescentes en Branchiostoma lanceolatum Par injection dans l'ARNm non fécondés ovocytes

Nous décrivons un montage entier hybridation in situ (MC-WISH) procédure chromogène multi-cible dans embryons de drosophile intactes permettant la détection simultanée et spécifique de trois modes de distribution de l'ARNm différents en comparant précipités de couleur.

Multi-cible chromogénique totalité montage<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation pour la comparaison des gènes domaines d&#39;expression dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

L'imagerie de la morphogenèse des embryons d'insectes avec la microscopie de fluorescence à base de feuille de lumière est devenu état de la technique. Ce protocole décrit et compare trois techniques de montage appropriées pour les embryons Tribolium castaneum, introduit deux nouvelles lignées transgéniques sur mesure bien adapté pour l' imagerie en direct, discute des contrôles de qualité essentiels et indique les limites expérimentales actuelles.

Feuille à base de lumière de la vie Microscopie Fluorescence ou fixe et Stained<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; embryons

Ce manuscrit décrit une méthode pour l’étiquetage individuel ARN messager (ARNm) transcriptions avec sondes d’ADN marquées fluorescent, pour une utilisation en single-molecule fluorescence in situ (smFISH) expériences d’hybridation chez e. coli. smFISH est une méthode de visualisation qui permet la détection simultanée, de localisation et quantification des molécules d’ARNm uniques dans des cellules individuelles fixes.

Méthode pour l’étiquetage des transcriptions dans les cellules individuelles Escherichia coli pour Single-molecule Fluorescence In Situ des expériences d’hybridation

L’objectif de ce protocole consiste à effectuer l’hybridation in situ sur des échantillons de corail adultes qui ont été incorporés à la paraffine et sectionnés sur lames de verre. Il s’agit d’une méthode qualitative permettant de visualiser l’expression spatiale d’une sonde d’ARN anti-sens dans les tissus inclus en paraffine.

In Situ Techniques d’hybridation pour échantillons de corail adultes paraffine

Nous présentons un protocole en deux parties qui combine l’imagerie fluorescente de calcium avec l’hybridation in situ, permettant à l’expérimentateur de corréler des modèles de l’activité de calcium avec des profils d’expression de gène sur un niveau unicellulaire.

Imagerie de calcium fluorescent et hybridation in situ subséquente pour la caractérisation neuronale de précurseur dans Les laevis de Xenopus

Découvrez l'hybridation fluorescente in situ et le marquage EdU pour visualiser les cellules souches proliférantes et non proliférantes chez la méduse Cladonema pacificum. Cette méthode permet d'étudier l'hétérogénéité des cellules souches.

Hybridation fluorescente in situ et marquage de la 5-éthynyl-2-désoxyuridine pour les cellules souches de la méduse hydrozoaire Cladonema pacificum (Vidéo) | JoVE Journal

Hybridation fluorescente in situ et marquage de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine pour les cellules souches de la méduse hydrozoaire Cladonema pacificum

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