Transfection efficace d’ARNm transcrit in vitro dans des cellules cultivées à l’aide de nanoparticules de peptide-poloxamine

Les nanoparticules de peptide-poloxamine sont l’un des systèmes potentiels de livraison d’ARNm pulmonaire. Notre protocole fabrique les nanoparticules peptide-poloxamine avec une productivité et une efficacité plus élevées, ce qui facilite le développement du vaccin à ARNm muqueux. Les matériaux requis par la technique sont peu coûteux et le protocole peut être complété en peu de temps.

Les nanoparticules de peptide-poloxamine ont la capacité de servir de médiateur à une transfection efficace de l’ARNm. Les nanoparticules de peptide-poloxamine ont montré une transfection réussie de l’ARNm dans les cellules épithéliales bronchiques humaines, ce qui implique des applications supplémentaires pour les vaccins muqueux contre la COVID-19, le traitement des cancers du poumon et la thérapie génique de la fibrose kystique. Je m’attends à ce que la personne ait des connaissances de base dans un domaine connexe et avec le protocole et beaucoup de techniques aussi, avant de commencer à effectuer les expériences.

Après avoir synthétisé le cadre de lecture ouvert de Metridia luciferase et l’avoir cloné dans le vecteur pUC57, préparez un modèle d’ADN linéarisé en utilisant BamHI et KpnI à 37 degrés Celsius pendant une heure. Préparer une réaction de volume de 20 microlitres pour la synthèse de l’ARNm à l’aide d’un kit de transcription T7 et de pseudouridine comme décrit dans le manuscrit. Bien mélanger les composants et incuber à 37 degrés Celsius pendant trois heures.

Ensuite, retirez la structure secondaire de 50 microgrammes d’ARNm IVT non coiffé en le chauffant à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Utiliser le système de coiffage de la coiffe de la coiffe de l’ARNm de la IVT et préparer la coiffe de la coiffe de la 7-méthylguanosine à l’aide de la S-adénosylméthionine et des 2'O-méthyltransférases à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Mesurer la concentration d’ARNm IVT coiffé avec un spectrophotomètre UV-visible.

À l’aide d’un marqueur d’ARN, analyser la taille moléculaire de l’ARNm IVT coiffé dans un gel d’agarose dénaturant à 1% de formaldéhyde contenant 18% de formaldéhyde. Préparer une solution mère de poloxamine 704 à 10 milligrammes par millilitre en solubilisant le T704 dans de l’eau exempte de nucléase. Préparer 2 milligrammes par millilitre de solution mère du peptide en solubilisant le peptide dans de l’eau sans nucléase.

Conservez la solution préparée à 4 degrés Celsius. Décongeler l’ARNm IVT sur la glace. Avant d’ouvrir le tube, centrifuger le tube à 300 fois G pendant trois secondes à température ambiante et diluer la solution d’ARNm IVT avec de l’eau sans nucléase.

Préparer T704 et la solution de mélange de peptides synthétiques en diluant la solution de T704 à huit microgrammes par concentration de microlitre et la solution de peptide synthétique à 0,555 microgramme par concentration de microlitre, avec de l’eau sans nucléase, respectivement. Incuber la solution mélangée pendant 15 minutes à température ambiante avant de l’utiliser à nouveau. Aspirez la solution d’ARNm IVT dans une seringue d’un millilitre, en évitant les trous d’air ou les bulles dans l’extrémité de la seringue.

Chargez la seringue sur un côté de la cartouche, à côté du bloc rotatif. Ensuite, remplissez une seringue d’un millilitre avec T704 et une solution de mélange de peptides synthétiques, et retirez les bulles ou les espaces d’air à l’extrémité de la seringue. Placez la seringue dans l’autre entrée de la pompe et réglez la pompe avec un débit total de 4 à 10 millilitres par minute.

Placez un tube conique sans RNase de dix millilitres pour recueillir la solution mixte IVT ARNm/PP-sNp à la fin du trajet d’écoulement du dispositif de mélange. Faites fonctionner la pompe pour démarrer le mélange, en vous assurant que les paramètres sont entrés correctement. Après avoir fait fonctionner la pompe pendant six secondes, prélever l’échantillon d’ARNm/PP-sNp IVT dans le tube conique.

Plaquez des cellules épithéliales bronchiques humaines et une lignée cellulaire dendritique dans des plaques de 96 puits 24 heures avant la transfection. Cultiver les cellules dans un milieu de culture supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur et 1% de streptomycine à la pénicilline. Après avoir retiré le milieu de croissance, lavez les cellules plaquées avec 0,2 millilitre par puits PBS.

Ajouter 170 microlitres de milieu de culture sans sérum à chaque puits contenant les cultures cellulaires plaquées. Ensuite, ajoutez 30 microlitres de formulation IVT mRNA/PP-sNp contenant 0,4 microgramme d’ARNm Metridia luciferase goutte à goutte dans chaque puits. Incuber les cellules avec la formulation IVT mRNA/PP-sNp dans une atmosphère humidifiée enrichie en dioxyde de carbone à 5% à 37 degrés Celsius pendant quatre heures.

Aspirer le milieu de transfection et ajouter 0,2 millilitre de milieu de culture frais complété par 10% de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur et 1% de streptomycine pénicilline. Incuber les cellules transfectées pendant 24 heures comme démontré précédemment et recueillir les surnageants à détecter dans chaque puits. Préparer une solution de dosage fraîche en ajoutant du PBS au substrat de la coelentérazine.

Bien mélanger la solution en tourbillonnant pendant 10 secondes. Ajouter 50 microlitres du surnageant collecté à une plaque de 96 puits. Configurez le lecteur de microplaques avec un temps de lecture de 1 000 millisecondes et ajoutez 30 microlitres de solution de coelentérazine à chaque puits manuellement ou par injection automatisée.

Immédiatement après avoir ajouté la solution de coelentérazine au surnageant, cliquez sur Démarrer pour mesurer le signal de luminescence. Le plasmide recombinant a été isolé et digéré pour produire le modèle d’ADN linéarisé. La transcription in vitro a produit un ARNm de MetLuc coiffé et plafonné.

Les cellules transfectées avec l’ARNm/PP-sNp de Metridia luciférase ont montré une expression significativement plus élevée de luciférase par rapport à celles transfectées avec un réactif de transfection à base de lipides disponible dans le commerce, un ARNm de Metridia luciferase nu, PBS ou peptides synthétiques T7044, une solution mixte dans des cellules épithéliales bronchiques humaines, 16 HBE, et la lignée cellulaire dendritique DC2.4 Metridia luciferase mRNA / PP-sNp a montré une expression de luciférase plus élevée que LP.suggère que le système d’administration PP-sNp est important pour protéger l’ARNm MetLuc contre la dégradation et promouvoir l’efficacité de la transfection de l’ARNm exogène Metridia luciferase. Veuillez vous assurer que la structure synthétique de l’ARNm Met non coiffé est éliminée avec succès. Calculez et téléchargez soigneusement l’ARNm Met-T704 et le composé peptidique pour préparer et compacter les nanoparticules de poloxamine.

La microscopie électronique à transmission peut être réalisée pour observer la morphologie des nanoparticules de peptide-poloxamine. Cette technique aide les chercheurs à développer des vaccins à ARNm muqueux et permet un criblage à haut débit des formulations de thérapie génique pour toutes les cellules apparentées.