Construction de peptides cycliques à l’aide d’un centre de sulfonium sur attache

Dans ce protocole, le sel de sulfonium a été construit qui pourrait agir comme une nouvelle main qui a réagi avec la protéine cystéine sur la proximité spéciale. L’avantage de cette technique était que cette réaction était rapide et efficace, et sans catalyseur Met et développait une méthode simple et efficace pour stabiliser les peptides. Pour commencer, préparer la solution de déprotection N-terminale de 9-fluorinyl-méthyloxycarbonyle de 20% de pipéridine ou 50% de morpholine et de DMF dans un bécher ou une fiole de 500 millilitres.

Ensuite, ajoutez 10 millilitres de la solution de déprotection à la colonne et faites bouillonner de l’azote dans la solution pendant 30 minutes ou deux fois pendant cinq minutes. Égoutter la solution à l’aide d’une pompe à vide et laver la résine séquentiellement cinq fois avec du dichlorométhane et du N,N-diméthylformamide. Pour détecter la résine comme une solution de couleur jaune foncé, ajoutez un millilitre de N, N-diméthylformamide à une petite quantité de résine et ajoutez 200 microlitres de 5% de ninhydrine à un tube en verre.

Chauffez-le à 130 degrés Celsius pendant trois minutes pour évaluer les changements de couleur de la résine. Pour le couplage des peptides, préparer une solution de mélange comme décrit dans le manuscrit dans un tube en polypropylène et la dissoudre dans trois millilitres de N, N-diméthylformamide. Ensuite, ajoutez 173 microlitres de N,N-diisopropyléthylamine ou 154 microlitres de N,N’diisopropylcarbodiimide à la solution pour inactiver l’acide aminé.

Ensuite, ajoutez le mélange à la colonne avec de la résine et faites-le bouillonner d’azote pendant deux heures. Après couplage, ajoutez un millilitre de N, N-diméthylformamide à une petite quantité de résine et ajoutez 200 microlitres de 5% de ninhydrine dans un tube en verre. Chauffez-le à 130 degrés Celsius pendant trois minutes pendant que la résine devient incolore, ce qui confirme l’absence d’un groupe amino libre avant l’étape de déprotection.

Après avoir égoutté la solution, lavez la résine comme démontré précédemment et ajoutez 10 millilitres de la solution de déprotection à la colonne. Ensuite, bulle d’azote pendant 30 minutes ou deux fois pendant cinq minutes. Et encore une fois, ajoutez une solution fraîche.

Ajouter 10 millilitres de méthanol anhydre à la colonne avec de la résine pour déshydrater et sécher avec de l’azote pour la prochaine utilisation. Peser 100 milligrammes de résine dans une colonne et laver la résine avec du dichlorométhane et du N,N-diméthylformamide avant l’étape de couplage. Préparer une solution pour éliminer le groupe de protection trityl-L-cystéine en ajoutant un mélange d’acide trifluoroacétique, de triisopropylsilane et de dichlorométhane dans un bécher ou une fiole de 100 millilitres pour enlever le groupe protecteur.

Ajouter cinq à 10 millilitres de la solution préparée à la colonne pour retirer le groupe de protection pendant 10 minutes. Répétez six fois avec de l’azote bouillonnant jusqu’à ce que la couleur jaune disparaisse complètement. Après avoir vidangé la solution par une pompe à vide, lavez la résine comme démontré précédemment.

Ensuite, préparez une solution pour réagir avec la cystéine déprotégée en ajoutant un agent de liaison dihalogéné et de la N, N-diisopropyléthylamine dans un bécher ou une fiole de 50 millilitres avec du N, N-diméthylformamide. Ajouter cinq à 10 millilitres de la solution réactionnelle à la colonne pour réagir avec la cystéine protégée pendant au moins trois heures avec des bulles d’azote. Encore une fois, vidangez la solution à l’aide d’une pompe à vide et lavez la résine séquentiellement comme démontré précédemment.

Pour préparer la solution de cyclisation peptidique, ajouter le mélange d’acide trifluoroacétique dans un bécher ou une fiole de 20 millilitres dans la hotte pour la cyclisation peptidique. Ensuite, ajoutez cinq à 10 millilitres de la solution de mélange dans le tube en polypropylène et coupez la résine sous le cocktail d’acide trifluoroacétique pendant trois heures. Après avoir déshydraté et lavé la résine avant que l’étape de couplage ne soit démontrée précédemment, préparer une solution aqueuse d’acide formique à 1% et un bromure de propargyle millimolaire et ajouter à la solution peptidique de méthionine.

Ensuite, agitez la réaction de couplage de la méthionine et du bromure de propargyle à température ambiante pendant 12 heures. Après la réaction, dissoudre le produit dans un tube en polypropylène et de l’acétonitrile et le filtrer à travers une membrane filtrante de 0,22 micromètre. Ensuite, purifiez immédiatement la solution par CLHP en phase inverse et lyophilisez-la en poudre pour la prochaine utilisation.

Les peptides cycliques synthétisés par bis-alkylation entre la cystéine et la méthionine ont été caractérisés par le spectre HPLC et LCMS, ce qui montre que les épimères présentaient des temps de rétention distincts et des poids moléculaires identiques. Les traces HPLC des épimères et de son produit conjugué ont démontré la conversion dépendante du temps entre le peptide cyclique et son produit. Le poids moléculaire des peptides cycliques synthétisés à l’aide d’une réaction de type thiol-yne a été déterminé par LCMS et le peptide a été isolé et purifié par HPLC.

Les peptides ont ensuite été caractérisés par la RMN du proton et des spectres cohérents quantiques hétéronucléaires uniques, révélant le changement chimique. Les spectres RMN protonique de la conversion dépendante du temps entre le peptide cyclique et le dithiothréitol et l’oxyde de deutérium ont été obtenus pour explorer la stabilité du peptide due à l’ouverture du cycle sulfonium. Les résultats ont montré qu’aucun produit d’addition ou d’ouverture d’anneau n’a été formé après 24 heures.

Cette procédure a établi une stratégie efficace pour synthétiser des peptides cycliques. La réaction indique que la sélectivité a également été améliorée en formant une confirmation qui stabilise le peptide de cyclisation, indiquant que les peptides cycliques étaient des catalyseurs médicamenteux prometteurs.