Construction de peptides cycliques pénétrant dans les cellules pour une pénétration accrue des barrières biologiques

Un obstacle sérieux pour le traitement du cancer est l’accès limité des thérapies aux cellules tumorales plus profondes en raison de barrières physiologiques. Ainsi, le développement de nouveaux transporteurs moléculaires capables de traiter les barrières biologiques est fortement souhaité pour améliorer l’efficacité de l’administration du médicament. Le but de cette procédure est de synthétiser les peptides cycliques pénétrant dans les cellules pour une pénétration accrue de cellule à cellule.

L’avantage de cette méthode est que la cyclisation peptidique peut être facilement réalisée par des réactions de substitution avec des cystéines et de la résine sans nécessiter de catalyseurs métalliques. L’incorporation de réticulations aromatiques améliore l’hydrophobicité globale des peptides par rapport aux réticulations hydrophiles lactamines ou triazoles, améliorant ainsi leur perméabilité. Pour commencer, assemblez l’appareil manuel de synthèse peptidique dans la hotte.

Placez les robinets d’arrêt à trois voies sur le collecteur à vide et reliez-les à l’azote. Assurez-vous de boucher les entrées inutilisées. Fixez une colonne en polypropylène de 10 millilitres sur les robinets d’arrêt à trois voies et vidangez le mélange réactionnel ou les solvants de la colonne en polypropylène à l’aide d’une ampoule à pipette en caoutchouc ou d’un vide via un piège à déchets.

Pour préparer la résine à la synthèse peptidique, ajoutez 4 à 5 millilitres de DMF à la quantité requise de résine et transférez-la dans la colonne de polypropylène avec un léger bulle d’azote pendant 30 minutes pour gonfler la résine adéquatement. Vidangez le DMF et ajoutez 4 à 5 millilitres de morpholine/DMF à 50% à la résine. Faire verser doucement de l’azote pendant 30 minutes pour éliminer le groupe Fmoc N-terminal, puis égoutter le mélange.

Lavez soigneusement la résine trois fois en ajoutant 4 à 5 millilitres de DMF à la colonne et en faisant bouillonner d’azote pendant au moins 1 minute à chaque fois. De la même manière, lavez la résine avec du dichlorométhane trois fois et du DMF trois fois. Ensuite, dissoudre 648,8 milligrammes de Fmoc et d’arginine protégée par PBF et 372,6 milligrammes de HATU dans 5 millilitres de DMF dans un tube à centrifuger.

Ajouter 348,4 microlitres de DIPEA pour activer la réaction de couplage et transférer le mélange réactionnel dans la colonne de polypropylène avec de la résine. Agiter doucement le mélange avec de l’azote bouillonnant pendant 1 à 2 heures, puis répéter la réaction de couplage une fois. Égoutter le mélange réactionnel et laver la résine séquentiellement avec du DMF, du dichlorométhane et de nouveau du DMF trois fois chacun pendant au moins 1 minute à chaque fois.

Retirez le groupe protecteur Fmoc et lavez la résine en suivant la procédure décrite précédemment avant de procéder au couplage de l’acide aminé suivant. Ensuite, couplez la bêta-alanine comme espaceur pour le marquage FITC en utilisant le même processus que celui montré pour le couplage d’acides aminés, puis ajoutez un mélange de FITC, DIPEA et DMF à la colonne de polypropylène dans l’obscurité pour effectuer le marquage FITC des peptides sur la résine. La réaction prendrait près de 8 heures.

Pour effectuer la cyclisation du peptide linéaire, ajoutez un mélange d’acide trifluoroacétique, de triisopropylsilane et de dichlorométhane à la colonne de polypropylène pendant 2 minutes pour éliminer sélectivement le groupe trityl-protecteur de la cystéine. Égoutter le mélange et répéter la procédure jusqu’à ce que la solution jaunâtre devienne incolore pour éliminer complètement le groupe protecteur des trityles. Effectuer des lavages séquentiels de la résine avec du DMF et du dichlorométhane au moins trois fois et dissoudre le 4,4'bis-bromométhyl-biphényle dans le DMF avec le DIPEA.

Ajouter la solution à la colonne et réagir pendant 4 heures. Lavez la résine avec 4 à 5 millilitres de méthanol deux fois pendant cinq minutes chacune, et séchez-la avec un flux continu d’azote. Pour les peptides contenant des cystéines, traiter la résine avec un cocktail de clivage efficace d’acide trifluoroacétique, de triisopropylsilane et d’eau ou d’acide trifluoroacétique, de triisopropylsilane, de 1 ,2-éthanedithiol et d’eau.

Traitez la résine liée au peptide pendant 2 à 3 heures pour clivé le peptide, puis retirez soigneusement l’acide trifluoroacétique avec un jet d’azote. Pour obtenir les peptides bruts, ajouter 4 à 5 millilitres d’éther diéthylique à la préparation peptidique clivée pour précipiter les peptides bruts, et centrifuger à 10 000 x g pendant 4 minutes. Jetez soigneusement le surnageant et séchez le peptide à l’air libre pendant 3 minutes dans une hotte efficace.

Dissoudre le peptide brut à petite échelle dans 800 microlitres d’acétonitrile, puis l’analyser en utilisant la chromatographie liquide haute performance en phase inverse et la chromatographie liquide-spectrométrie de masse. Inoculer 100 000 cellules HeLa dans 2 millilitres de DMEM dans une chambre de 12 puits avec un insert de plaque de culture tissulaire et incuber pendant 24 heures dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius contenant 5% de dioxyde de carbone. Retirez le milieu et incuber les cellules dans les chambres avec 1 millilitre de 10 micromolaires FITC-R8 ou FITC-sR8-4 dans du DMEM sans FBS pendant 1 heure.

Après cela, retirez le milieu contenant les peptides et lavez les cellules trois fois avec 1 millilitre de PBS. Ajouter 1 millilitre de DMEM frais sans FBS dans les chambres, puis co-incuber les cellules HeLa dans la chambre avec l’insert de plaque de culture tissulaire, avec les cellules HeLa sur les lamelles rondes au fond pendant 2 heures. Fixez les cellules HeLa sur les lamelles rondes avec 2,5% de glutaraldéhyde pendant 15 minutes, puis colorez les cellules avec DAPI pendant 15 minutes.

Enfin, observez les cellules HeLa sur les lames de couverture sous un microscope à fluorescence. Un diagramme schématique de la synthèse du peptide R8 linéaire marqué FITC et du peptide R8 agrafé marqué FITC est présenté ici. Les spectres HPLC et MS du peptide linéaire R8 et du peptide R8 agrafé sont représentés sur cette figure.

Le temps de rétention du peptide agrafé était sensiblement plus long que celui de l’analogue linéaire, indiquant une hydrophobicité globale accrue du peptide après cyclisation avec la réticulation hydrophobe. Cette image graphique représente la stabilité du peptide linéaire et du peptide agrafé en présence de 25%FBS. Le R8 cyclique reste intact à 77,3% après incubation avec FBS pendant 4 heures, tandis que son homologue linéaire a été principalement dégradé, suggérant une stabilité protéolytique améliorée du peptide cyclique R8.

Les images de microscopie à fluorescence de cellules vivantes de cellules HeLa et de cellules 4T1 après 1 heure d’incubation avec 3 peptides R8 linéaires marqués FITC micromolaires et peptide R8 agrafé marqué FITC sont présentées ici. On peut voir que les cellules traitées avec R8 cyclique avec réticulation aromatique présentaient une fluorescence intracellulaire plus élevée que celles traitées avec leur homologue linéaire. Des résultats similaires ont été obtenus avec l’analyse par cytométrie en flux.

Pour étudier plus en détail si la R8 cyclique confère une pénétration accrue de cellule à cellule, des modèles transwell ont été utilisés pour simuler la perméabilité de la barrière des peptides d’une couche cellulaire à l’autre. Le R8 cyclique a clairement montré une pénétration trans-barrière plus élevée que le peptide linéaire R8, comme indiqué par une augmentation significative de la fluorescence intracellulaire. Une déprotection complète du groupe trityle de cystéine et de résine est importante pour l’étape de cyclisation suivante.

En outre, l’efficacité de cyclisation dépend également des séquences spécifiques et des longueurs des peptides dues aux effets stériques. Dans un tel cas, l’utilisation d’une résine à faible capacité de charge ou de cyclisation des peptides sous des concentrations diluées en phase de solution serait utile. Ces peptides cycliques ont montré une perméabilité intercellulaire améliorée par rapport à leurs homologues linéaires.

Nous pensons qu’ils sont très prometteurs pour vaincre les barrières biologiques et seront utilisés pour d’autres applications moléculaires dans le domaine de l’administration de médicaments.