Name: Construction de peptides cycliques pénétrant dans les cellules pour une pénétration accrue des barrières biologiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Découvrez la synthèse de peptides cycliques pénétrant dans les cellules pour améliorer la traversée des barrières biologiques. Cette méthode utilise des ponts aromatiques sans catalyseur métallique pour optimiser l'administration de médicaments anticancéreux.

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Ce travail est soutenu par la Fondation des sciences naturelles de Chine (21708031), la Fondation chinoise des sciences postdoctorales (BX20180264, 2018M643519) et les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (2682021ZTPY075).

1. Préparation de l’équipement
NOTE: Effectuez toutes les procédures dans une hotte de fonctionnement avec un équipement de protection individuelle approprié.
<ol><li>Assembler l’appareil manuel de synthèse peptidique dans la hotte (Figure 1). Placez les robinets d’arrêt à trois voies (voir Tableau des matériaux) sur le collecteur à vide (voir Tableau des matériaux) et connectez-les à l’azote (N2). Assurez-vous de boucher les entrées inutilisées.</li>
	<li>Fixer une colonne de polypropylène de 10 ml (voir le tableau des matériaux) sur les robinets d’arrêt à trois voies. Vidangez le mélange réactionnel ou les solvants de la colonne en polypropylène à l’aide d’une ampoule à pipette en caoutchouc ou d’un vide via un piège à déchets.</li>
</ol>2. Synthèse du peptide R8 linéaire marqué FITC (FITC-R8) et du peptide R8 agrafé marqué FITC (FITC-sR8-4)
REMARQUE: Les peptides ont été synthétisés selon un protocole standard de synthèse de peptides en phase solide à base de Fmoc (SPPS)25. La résine 4-(2',4'-Diméthoxyphéyl-Fmoc-aminométhyl)-phénoxyacétamido-norleucyl-MBHA (résine MBHA rinkamide, voir le tableau des matériaux) a été utilisée tout au long de l’étude.
ATTENTION: N, N-diméthylformamide (DMF), N, N-diisopropyléthylamine (DIPEA), morpholine et dichlorométhane (DCM) sont tous incolores et sont nocifs s’ils sont inhalés ou absorbés par la peau. L’éther est extrêmement inflammable. Le 1,2-éthanedithiol (EDT) est une substance particulièrement odorante. L’acide trifluoroacétique (AGT) est très corrosif et son acidité est 10 à 5 fois supérieureà celle de l’acide acétique. Par conséquent, tous les réactifs et produits chimiques sont censés être traités à l’aide d’un équipement de protection dans une hotte.
<ol><li>Préparer la résine pour la synthèse peptidique.<ol><li>Calculer la masse de résine nécessaire à la synthèse :Masse de résine (mg) = échelle (mmol) / capacité de charge de résine (mmol/g) × 1 000 (mg/g) REMARQUE : Par exemple, la masse de résine MBHA amide de patinoire (0,572 mmol/g) pour 0,2 mmol = 0,2 mmol / 0,572 mmol/g × 1 000 mg/g = 350 mg.</li>
		<li>Ajouter 4-5 mL de DMF à la quantité requise de résine et transférer dans la colonne de polypropylène de 10 mL (étape 1.2) avec un léger bulle de N2 pendant 30 minutes pour gonfler adéquatement la résine, puis égoutter le DMF.</li>
		<li>Ajouter 4-5 mL de morpholine/DMF (v/v) à 50% à la résine, faire doucement des bulles deN2 pendant 30 min 2x pour éliminer le groupe Fmoc N-terminal, puis égoutter le mélange. Ensuite, lavez soigneusement la résine 3x en ajoutant 4-5 ml de DMF à la colonne et en faisant bouillonner de N2 pendant au moins 1 min à chaque fois. Continuez à laver la résine avec du DCM (3x) et du DMF (3x) de la même manière.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuez le couplage d’acides aminés protégé par Fmoc comme décrit ci-dessous. REMARQUE: Le couplage de l’arginine dans une synthèse manuelle à l’échelle de 0,2 mmol est décrit ici à titre d’exemple.<ol><li>Dissoudre le Fmoc-Arg (Pbf)-OH (5 équivalents, 648,8 mg) et le 2-(7-azobenzotriazole)-N, N, N', N'-hexafluorophosphate de tétraméthyluronium (HATU, 4,9 équiv., 372,6 mg) dans 5 mL de DMF dans un tube à centrifuger.</li>
		<li>Ajouter DIPEA (10 équivalents, 348,4 μL) pour activer la réaction de couplage, puis transférer le mélange réactionnel dans la colonne de polypropylène de 10 mL avec de la résine (préparée à l’étape 2.1.3). Ensuite, agiter doucement le mélange avec N 2 bouillonnant pendant1-2 h.</li>
		<li>Répéter la réaction de couplage (étape 2.2.1 et étape 2.2.2) une fois.</li>
		<li>Une fois le couplage terminé, égoutter le mélange réactionnel et laver la résine séquentiellement avec DMF, DCM et DMF 3x chacun pendant au moins 1 min à chaque fois.</li>
		<li>Effectuer le couplage de chaque acide aminé par étapes ordonnées: Ajouter 4-5 mL de morpholine/DMF (v/v) à 50% à la résine, barboter doucement avec N 2 pendant 30 min 2x pour éliminer le groupe N α-FmoC, puis laver la résine (comme indiqué à l’étape 2.2.4) et procéder au couplage de l’acide aminé suivant (comme indiqué aux étapes 2.2.1 et 2.2.2). Procéder à plusieurs cycles de cette étape pour réaliser la synthèse du peptide désiré. REMARQUE: Ce processus peut être suspendu ici. Condenser la résine avec du méthanol et sécher la résine avec un flux continu deN2. Capter la colonne de polypropylène puis stocker la résine à 4 °C pendant quelques jours (ou à -20 °C pour un stockage plus long). Gonfler la résine avec 4-5 mL de DMF pendant 0,5-1 h avant de commencer une nouvelle synthèse. Si vous passez directement à l’étape suivante, il n’est pas nécessaire de condenser la résine.</li>
	</ol></li>
	<li>Étiqueter les peptides avec de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) comme décrit ci-dessous.<ol><li>Couplez la bêta-alanine comme espaceur pour le marquage FITC en utilisant le même processus que celui utilisé pour le couplage d’acides aminés à l’étape 2.2.</li>
		<li>Effectuer le marquage FITC des peptides sur la résine en ajoutant un mélange de FITC (5 équiv.), DIPEA (10 equiv.) et DMF à la colonne de polypropylène et en réagissant dans l’obscurité pendant 8 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Pour la synthèse de FITC-sR8-4, effectuer la cyclisation du peptide linéaire comme décrit ci-dessous.<ol><li>Ajouter un mélange de TFA/triisopropylsilane (TIS)/DCM (3/5/92, v/v/v) dans la colonne de polypropylène pendant 2 min pour éliminer sélectivement le groupe protecteur Cys (Trt), puis égoutter le mélange. Répétez la procédure ci-dessus jusqu’à ce que la solution jaunâtre devienne incolore pour éliminer complètement le groupe protecteur Trt.</li>
		<li>Par la suite, effectuez des lavages séquentiels de la résine avec DMF et DCM au moins 3x. Ensuite, dissoudre le 4,4'-bis(bromométhyl)biphényle (2 équiv.) dans du DMF avec du DIPEA (4 équiv.), l’ajouter à la colonne et réagir pendant 4 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Cliver les peptides comme décrit: Une fois la synthèse peptidique terminée, laver la résine avec 4-5 mL de méthanol deux fois pendant 5 minutes chacune et la sécher avec un flux continu de N2. Traiter la résine avec un cocktail de clivage efficace TFA/TIS/H 2O (95/2,5/2,5, v/v/v), ou TFA/TIS/EDT/H2O(92,5/2,5/2,5/2,5, v/v/v/v) pour les peptides contenant des cystéines, en utilisant environ 1 mL de cocktail de clivage pour 100 mg de résine. Traiter la résine liée au peptide pendant 2-3 h pour cliver le peptide, puis retirer le TFA avec précaution avec un jet de N2.</li>
	<li>Pour obtenir les peptides bruts, ajouter 4-5 mL d’éther diéthylique à la préparation de peptides clivés pour précipiter les peptides bruts et centrifuger à 10 000 × g pendant 4 min. Jeter soigneusement le surnageant et sécher le peptide à l’air libre pendant 3 minutes dans une hotte efficace.</li>
	<li>Analyse des peptides : Dissoudre un peptide brut à petite échelle (clivé à partir d’environ 10 mg de résine liée au peptide) dans 800 μL d’acétonitrile (ACN)/H2O(1/1, v/v), puis analyser par chromatographie liquide haute performance en phase inverse (RP-HPLC) et chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Purifier les peptides en utilisant RP-HPLC et LC-MS.<ol><li>Dissoudre 50 mg de produit peptidique brut dans 4 mL d’ACN/H2O(1/1, v/v) et injecter la solution dans un système RP-HPLC équipé d’une colonne C18 (4,6 mm x 150 mm, taille des pores : 120 Å, granulométrie : 4 μm ; voir tableau des matières). Éluer le peptide à l’aide d’une phase mobile contenant 0,1% TFA/H2O(v/v) et ACN, avec un gradient de 10% à 90% ACN sur 30 min. Des peptides conventionnels ont été détectés à 220 nm et des peptides marqués FITC à 494 nm.</li>
		<li>Recueillir les fractions correspondant au pic peptidique majeur tel qu’identifié par la SEP, puis lyophiliser les fractions peptidiques souhaitées. Conserver le peptide purifié à −20 °C. NOTE: Les m/z trouvés du FITC-R8 purifié sont les suivants: [M + 3 H]3+: 576.63; [M + 4 H] 4+ : 432,72; [H + 5 H] 5+ : 346,39; [M + 6 H] 6+ : 288,85. Les m/z trouvés du FITC-sR8-4 purifié sont les suivants : [M + 3 H]3+: 704,74; [M + 4 H] 4+ : 528,77; [H + 5 H] 5+ : 423,34; [M + 6 H] 6+ : 352,91. Conditions d’analyse de la SM: instrument: ESI (polarisation de la sonde: +4,5 kV; détecteur: 1,2 kV); débit de gaz du nébuliseur : 1,5 L/min; ligne de désolvatation courbe (CDL) : −20 V ; Température CDL: 250 °C; température du bloc: 400 °C; débit : 0,2 mL/min; phase mobile: 50% H2O / 50% ACN.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Quantification des peptides marqués FITC
<ol><li>Dissoudre une petite quantité de peptide purifié dans du DMSO sous forme de solution mère (p. ex. 40 μmol/mL).</li>
	<li>Mesurer l’absorbance à 494 nm (A 494) de 2 μL de la solution mère dans498 μL de solution saline tamponnée au phosphate de 10 mM (1x PBS, pH 7,4) avec une plaque de microtitrage (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un lecteur de microplaques multi-technologie (voir le tableau des matériaux). Le facteur de dilution est de 500 μL/2 μL = 250, et la longueur de trajet de la plaque de microtitrage est de 0,5 mm.</li>
	<li>Calculer la concentration de la solution mère à l’aide de la formule suivante: Concentration (mM) = A494 × facteur de dilution / 0,05 (cm) / 77 000 (cm−1· M−1) × 1 000 (mM·M−1)</li>
	<li>Ajuster à une dilution appropriée de sorte que la valeur mesurée de A494 soit comprise entre 0,1 et 1,0. NOTE: Les mesures doivent être répétées plusieurs fois pour s’assurer que la concentration mesurée est exacte. Le coefficient d’extinction de 77 000 cm−1· M−1 provient du groupe FITC.</li>
</ol>4. Stabilité des peptides dans le sérum fœtal bovin (FBS)
<ol><li>Incuber le peptide à une concentration de 100 μM avec 250 μL de FBS/H2O (v/v) à 250 μL à 37 °C. Après avoir incubé pendant 0 h, 1 h, 2 h et 4 h, prélever 10 μL d’aliquotes, puis ajouter 150 μl d’acide trichloracétique à 12 % dissous dans H2O/ACN (1/3, v/v) pour précipiter les protéines sériques.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à 10 000 × g pendant 5 min et analyser le surnageant à l’aide de CLHP (comme décrit à l’étape 2.8) pour déterminer l’étendue de la dégradation peptidique.</li>
	<li>Calculer le rapport de l’aire du pic à 1 h, 2 h et 4 h à celui à 0 h pour obtenir la fraction de peptide non dégradé au moment correspondant. Le résultat est la moyenne de trois échantillons parallèles.</li>
</ol>5. Absorption cellulaire des peptides
<ol><li>Imagerie microscopique à fluorescence<ol><li>Placez une lamelle de couverture ronde dans une plaque de 12 puits. Ensuite, inoculer 1 x 105 cellules uniformément sur des lames de couverture et cultiver pendant la nuit avec 2 mL de milieu. Retirez le milieu et lavez les cellules 3x avec 1 mL de PBS. REMARQUE : Dans cette étude, des cellules HeLa et des cellules 4T1 ont été cultivées dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, voir le tableau des matériaux) complété par 10 % de FBS dans un incubateur humidifié à 37 °C contenant 5 % de CO2.</li>
		<li>Incuber les cellules avec 1 mL de 3 μM de peptides marqués FITC dans du DMEM sans FBS pendant 1 h à 37 °C. Ensuite, retirez le milieu contenant des peptides et lavez les cellules 3x avec 1 mL de PBS.</li>
		<li>Colorer les cellules avec 1 mL de Hoechst 33258 pendant 15 min. Observez l’internalisation de chaque peptide à l’aide d’un microscope à fluorescence (voir le tableau des matériaux) avec la même intensité de fluorescence et le même temps d’exposition. REMARQUE: Les paramètres suivants ont été utilisés pour la microscopie à fluorescence. Objectif: Plan-Apochromat: 63 x / 1.40 huile DIC M27; Canal 1 pour FITC: filtre d’excitation: 450-490 nm, filtre d’émission: 500-550 nm, temps d’exposition: 230 ms; Canal 2 pour Hoechst 33258 : filtre d’excitation : 335-383 nm, filtre d’émission : 420-470 nm, temps d’exposition : 27 ms.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse de cytométrie en flux<ol><li>Inoculer 5 x 105 cellules HeLa uniformément dans des plaques à 12 puits et les cultiver dans du DMEM pendant 24 h à 37 °C. Ensuite, retirez le milieu et lavez les cellules 3x avec 1 mL de PBS.</li>
		<li>Incuber les cellules avec 1 mL de 3 μM de peptides marqués FITC dans du DMEM sans FBS pendant 1 h à 37 °C. Retirer le milieu contenant des peptides, dissocier les cellules avec 0,25% (p/v) de trypsine et 0,53 mM d’EDTA dans du PBS pendant 5 min, puis recueillir les cellules par centrifugation à 306 × g pendant 4 min. Lavez la pastille de cellule avec du PBS.</li>
		<li>Incuber les cellules avec 1 mL de bleu de trypan à 0,05 % (p/v) dans du PBS pendant 3 minutes pour éteindre la fluorescence liée à la surface et effectuer une analyse quantitative de la fluorescence intracellulaire à l’aide d’un cytomètre en flux (voir le tableau des matériaux). NOTE: Paramètres de cytométrie de flux: excitation: 488 nm, émission: 530 nm. Le bleu de trypan peut également éteindre la fluorescence des cellules mortes et aider à distinguer les cellules vivantes / mortes lors de l’analyse de l’absorption des peptides.</li>
		<li>Traiter et doser les cellules 4T1 à l’aide de la cytométrie en flux en suivant le même protocole que celui décrit pour les cellules HeLa. Prélever 5 x 105 cellules par échantillon et constituer trois échantillons parallèles par groupe.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Exploration de la pénétration intercellulaire des peptides à l’aide de modèles transwell
<ol><li>Inoculer 1 x 10 5 cellules HeLa dans 2 mL de DMEM dans une chambre de 12 puits avec un insert de plaque de culture tissulaire (voir le tableau des matériaux) et incuber pendant 24 h dans un incubateur humidifié à 37 °C contenant5% de CO2. Ensuite, retirez le milieu et incuber les cellules dans les chambres avec 1 mL de 10 μM FITC-R8 ou FITC-sR8-4 (purifié par HPLC) dans du DMEM sans FBS pendant 1 h.</li>
	<li>Retirer le milieu contenant les peptides et laver les cellules 3x avec 1 mL de PBS. Ajouter 1 mL de DMEM frais sans FBS dans les chambres, puis co-incuber les cellules HeLa dans la chambre avec l’insert de plaque de culture tissulaire avec les cellules HeLa sur les lamelles rondes au fond pendant 2 h.</li>
	<li>Fixez les cellules HeLa sur les lamelles rondes avec 2,5% de glutaraldéhyde pendant 15 min, puis colorez les cellules avec DAPI pendant 15 min. Ensuite, observez les cellules HeLa sur les lames de couverture sous un microscope à fluorescence. Traiter et doser les cellules 4T1 en utilisant le même protocole que celui utilisé pour les cellules HeLa.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly%28%CE%B2-amino+esters%29+delivery+platform+for+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li>
<li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+BBB+permeability+of+osmotically+active+poly%28mannitol-co-PEI%29+modified+with+rabies+virus+glycoprotein+via+selective+stimulation+of+caveolar+endocytosis+for+RNAi+therapeutics+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease.</a> Biomaterials. 38, 61-71 (2015).</li>
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<li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+low+molecular+weight+protamine+chemical+chimera+to+enhance+monomeric+insulin+intestinal+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption.</a> Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).</li>
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<li>Muppidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+proteolytically+stable%2C+cell-permeable+peptide-based+selective+Mcl-1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).</li>
<li>Wiradharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cationic+amphiphilic+%CE%B1-helical+peptides+as+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthetic cationic amphiphilic α-helical peptides as antimicrobial agents.</a> Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La stabilisation chimique des peptides par l’incorporation de contraintes conformationnelles s’est avérée être une stratégie efficace pour améliorer la stabilité et la perméabilité cellulaire du peptide26. Dans ce protocole, une procédure étape par étape est décrite pour la synthèse de CPP cycliques avec des réticulations aromatiques et l’évaluation de leur perméabilité à travers les barrières biologiques. Par rapport aux réticulations hydrophiles lactamines ou triazoles22,27</su...

Les dernières décennies ont vu des progrès rapides dans le développement de peptides pénétrant dans les cellules (CPP) pour l’administration de médicaments. Les CPP ont été largement utilisés comme transporteurs moléculaires pour le traitement d’une gamme de maladies potentiellement mortelles, notamment les troubles neurologiques1,2, les maladies cardiaques3, le diabète4, la dermatose5 et le cancer 6,7. Le cancer reste un fardeau sanitaire mondial accompagné d’un taux élevé de morbidité et de mortalité malgré les efforts de recherche généralisés8. Un obstacle sérieux au traitement du cancer est l’accès limité des thérapies aux cellules tumorales plus profondes en raison de barrières physiologiques telles que la matrice extracellulaire compacte (ECM), le système vasculaire tumoral anormal, les barrières membranaires multiples et la pression élevée du liquide interstitiel (IFP)9. Ainsi, le développement de nouveaux CPP ayant une capacité supérieure à livrer des cargaisons à travers les barrières biologiques est considéré comme une stratégie essentielle pour le traitement du cancer10,11.
Les CPP peuvent être classés en CPP cationiques, amphipathiques et hydrophobes en termes de propriétés physico-chimiques12. Parmi ceux-ci, le peptide VIH-TAT chargé positivement et la polyarginine synthétique sont d’une importance considérable dans la recherche biomédicale et ont été largement étudiés pour faciliter l’administration intracellulairede médicaments 13. Tunnemann et al. ont rapporté qu’une longueur minimale de huit arginines est essentielle pour une pénétration cellulaire efficace des peptides synthétiques de polyarginine, sur la base d’une étude de perméabilité cellulaire menée à l’aide de peptides R3 à R1214. Cependant, ces CPP ont généralement des demi-vies plasmatiques courtes en raison de leur hydrolyse rapide in vivo. En outre, on sait peu de choses sur l’optimisation de la structure chimique des CPP afin d’augmenter leur capacité de trans-barrière, car il est difficile de pénétrer dans plusieurs membranes cellulaires15. Ainsi, le développement de nouveaux transporteurs moléculaires capables de pénétrer les barrières biologiques est fortement souhaité pour améliorer l’efficacité de l’administration des médicaments. En 2020, Komin et al.16 ont découvert un CPP appelé peptide CL, qui contient un motif hélicoïdal (RLLRLLR) et une queue de polyarginine (R7) pour traverser la monocouche épithéliale. Un ensemble de variantes peptidiques CL ont également été synthétisées en modifiant le motif hélicoïdal. Cette exploration pourrait être un guide important pour le développement de nouveaux CPP pour la livraison de cargaisons à travers les barrières biologiques. De plus, Dietrich et al. ont optimisé la perméabilité cellulaire du peptide StAX, inhibant la voie de signalisation Wnt / β-caténine en augmentant l’hydrophobicité globale des peptides17.
La restriction conformationnelle des peptides linéaires non structurés par cyclisation est un moyen efficace d’améliorer leur stabilité protéolytique et leur perméabilité18,19,20. Le renforcement structurel augmente la résistance à la protéase des peptides cycliques, les rendant plus stables in vivo par rapport à leurs homologues linéaires. De plus, la cyclisation des peptides peut potentiellement masquer le squelette peptidique polaire en favorisant la liaison hydrogène intramoléculaire, augmentant ainsi la perméabilité membranaire des peptides21. Au cours des deux dernières décennies, les méthodes de cyclisation chimiosélective sont devenues des stratégies efficaces pour la construction de peptides cycliques avec différentes architectures, telles que tous les hydrocarbures, lactamines, triazoles, m-xylène, perfluoroaryl et autres réticulationscroisées 22,23. La barrière biologique imposée par le microenvironnement tumoral sophistiqué pourrait réduire la pénétration des médicaments dans les tumeurs solides24. Nous avons déjà constaté que les CPP cycliques présentaient une résistance supérieure à la digestion enzymatique par rapport à leurs homologues linéaires20. De plus, l’hydrophobicité globale des peptides est essentielle pour améliorer leur perméabilité cellulaire22. D’après les études mentionnées ci-dessus, on peut émettre l’hypothèse que la combinaison d’un profil chargé positivement, d’une hydrophobicité globale élevée et d’une stabilité accrue de la protéolyse augmente la perméabilité des CPP à travers les barrières biologiques. Dans une étude récente, nous avons identifié deux CPP cycliques avec des réticulations aromatiques aux positions i et i+7 qui présentent une perméabilité améliorée dans les cellules et les tissus tumoraux par rapport à leurs homologues linéaires15. Ici, un protocole synthétique concis pour la synthèse de CPP cycliques marqués par fluorescence et les étapes clés pour étudier leur perméabilité sont présentés.

<table><tbody><tr><td>1,2-éthanedithiol</td><td>Aladdin</td><td>K1722093</td><td>puanteur</td></tr><tr><td>2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tétraméthyluronium hexafluorophosphate (HATU)</td><td>HEOWNS</td><td>A-0443697</td><td></td></tr><tr><td>4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl</td><td>TCI</td><td>B1921</td><td></td></tr><tr><td>4T1 cellules</td><td>ATCC</td><td></td><td>Les cellules 4T1 ont été cultivées dans un milieu DMEM complété par 10 % de FBS (Hyclone) dans un C Incubateur humidifié contenant 5 % de CO2.</td></tr><tr><td>Acétonitrile&nbsp ;</td><td>Adamas</td><td>1484971</td><td>toxicité</td></tr><tr><td>Dichlorométhane</td><td>Énergie</td><td>W330229</td><td>nocif pour la peau</td></tr><tr><td>Éther diéthylique</td><td>Aldrich</td><td>673811</td><td>inflammable</td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde</td><td>Beyotime</td><td>ST038</td><td>nocif pour la peau</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medium Eagle modifié (DMEM)</td><td>Spectromètre</td> de masse à ionisation par électronébulisation Gibco <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Waters</td><td>G2-S Tof</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td><td>BioFroxx</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum (FBS)</td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometer</td><td>Beckman Coulter CytoFLEX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isomère de l’isothiocyanate de fluorescéine ( FITC)</td><td>Microscope</td><td></td> à fluorescence E0801812500 <td></td></tr><tr><td></td><td>énergie Carl Zeiss</td><td>Axio Observer 7</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td><td>HEOWNS</td><td>F-81070</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>GL Biochem</td><td>GLS201115-35202</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-&beta ; Les cellules HeLa d’Ala-OH</td><td></td><td></td> Adamas 51341C <td></td></tr><tr><td></td><td></td> ont été cultivées dans du DMEM avec 10 % de FBS (Hyclone) dans un 37 &deg ;<td></td><td> C Incubateur humidifié contenant 5 % de CO2.</td></tr><tr><td>Chromatographie liquide haute performance</td><td>Agilent</td><td>Agilent 1260</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de chromatographie liquide haute performance</td><td>Agilent</td><td>Poroshell EC-C18 120, 4,6 &times ; 150 mm (taille des pores 120 & Aring ;, taille des particules 4 & mu ; m)</td><td></td></tr><tr><td>Lyophiliseur</td><td>SP</td><td>Scientific Vir Tis</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>toxicité</td></tr><tr><td>Plaque de microtitration</td><td>Thermo &mu ; plaque de descente</td><td>N12391</td><td></td></tr><tr><td>Morpholine</td><td>HEOWNS</td><td>M99040</td><td>irritant</td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques multi-technologies</td><td>Thermo</td><td>VARIOSKAN LUX</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropylethylamine</td><td>HEOWNS</td><td>E-81416</td><td>irritant</td></tr><tr><td>N,N-Dimethyl formamide</td><td>Energy</td><td>B020051</td><td>nocif pour la peau</td></tr><tr><td>Colonne Poly-Prep</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td>colonnes de chromatographie en polypropylène</td></tr><tr><td>Rink Amide Résine MBHA (0,572 mmol/g)</td><td>GL Biochem</td><td>GLS180301-49101</td><td></td></tr><tr><td>Robinets d’arrêt à trois voies</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>Insert de plaque de culture tissulaire</td><td>LABSELECT</td><td>14211</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique</td><td>HEOWNS</td><td>T63278</td><td>corrosif</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>HEOWNS</td><td>T-0284475</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>BioFroxx</td><td>1004</td><td></td></tr><tr><td>Collecteur sous vide</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr></tbody></table>

construction de peptides cycliques pénétrant dans les cellules pour une pénétration accrue des barrières biologiques

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Le cancer a été un grand défi pour la santé mondiale. Cependant, le microenvironnement tumoral complexe limite généralement l’accès des thérapies aux cellules tumorales plus profondes, conduisant à une récidive tumorale. Pour vaincre la pénétration limitée des barrières biologiques, des peptides pénétrant dans les cellules (CPP) ont été découverts avec une excellente capacité de translocation membranaire et sont apparus comme des transporteurs moléculaires utiles pour délivrer diverses cargaisons dans les cellules. Cependant, les CPP linéaires conventionnels présentent généralement une stabilité protéolytique compromise, ce qui limite leur perméabilité à travers les barrières biologiques. Ainsi, le développement de nouveaux transporteurs moléculaires capables de pénétrer les barrières biologiques et de présenter une stabilité protéolytique améliorée est fortement souhaité pour promouvoir l’efficacité de l’administration de médicaments dans des applications biomédicales. Nous avons déjà synthétisé un panel de CPP cycliques courts avec des réticulations aromatiques, qui ont montré une perméabilité supérieure dans les cellules et les tissus cancéreux par rapport à leurs homologues linéaires. Ici, un protocole concis est décrit pour la synthèse du peptide cyclique polyarginine R8 marqué par fluorescence et de son homologue linéaire, ainsi que des étapes clés pour étudier leur perméabilité cellulaire.

Dans ce protocole, une procédure synthétique pour contraindre la polyarginine linéaire R8 dans sa forme cyclique a été présentée. Le SPPS a été effectué manuellement à l’aide d’un appareil simple (figure 1). Le procédé synthétique détaillé de SPPS est illustré à la figure 2. Brièvement, la résine a été suffisamment gonflée, suivie d’une déprotection du groupe protecteur N α-FmoC. Ensuite, l’acide aminé protégé par N α-Fmoc ...

Ce protocole décrit la synthèse de peptides cycliques pénétrant dans les cellules avec des réticulations aromatiques et l’évaluation de leur perméabilité à travers les barrières biologiques.

Construction de peptides cycliques pénétrant dans les cellules pour une pénétration accrue des barrières biologiques

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Un obstacle sérieux pour le traitement du cancer est l’accès limité des thérapies aux cellules tumorales plus profondes en raison de barrières physiologiques. Ainsi, le développement de nouveaux transporteurs moléculaires capables de traiter les barrières biologiques est fortement souhaité pour améliorer l’efficacité de l’administration du médicament. Le but de cette procédure est de synthétiser les peptides cycliques pénétrant dans les cellules pour une pénétration accrue de cellule à cellule.L’avantage de cette méthode est que la cyclisation peptidique peut être facilement réalisée par des réactions de substitution avec des cystéines et de la résine sans nécessiter de catalyseurs métalliques. L’incorporation de réticulations aromatiques améliore l’hydrophobicité globale des peptides par rapport aux réticulations hydrophiles lactamines ou triazoles, améliorant ainsi leur perméabilité. Pour commencer, assemblez l’appareil manuel de synthèse peptidique dans la hotte.Placez les robinets d’arrêt à trois voies sur le collecteur à vide et reliez-les à l’azote. Assurez-vous de boucher les entrées inutilisées. Fixez une colonne en polypropylène de 10 millilitres sur les robinets d’arrêt à trois voies et vidangez le mélange réactionnel ou les solvants de la colonne en polypropylène à l’aide d’une ampoule à pipette en caoutchouc ou d’un vide via un piège à déchets.Pour préparer la résine à la synthèse peptidique, ajoutez 4 à 5 millilitres de DMF à la quantité requise de résine et transférez-la dans la colonne de polypropylène avec un léger bulle d’azote pendant 30 minutes pour gonfler la résine adéquatement. Vidangez le DMF et ajoutez 4 à 5 millilitres de morpholine/DMF à 50% à la résine. Faire verser doucement de l’azote pendant 30 minutes pour éliminer le groupe Fmoc N-terminal, puis égoutter le mélange.Lavez soigneusement la résine trois fois en ajoutant 4 à 5 millilitres de DMF à la colonne et en faisant bouillonner d’azote pendant au moins 1 minute à chaque fois. De la même manière, lavez la résine avec du dichlorométhane trois fois et du DMF trois fois. Ensuite, dissoudre 648,8 milligrammes de Fmoc et d’arginine protégée par PBF et 372,6 milligrammes de HATU dans 5 millilitres de DMF dans un tube à centrifuger.Ajouter 348,4 microlitres de DIPEA pour activer la réaction de couplage et transférer le mélange réactionnel dans la colonne de polypropylène avec de la résine. Agiter doucement le mélange avec de l’azote bouillonnant pendant 1 à 2 heures, puis répéter la réaction de couplage une fois. Égoutter le mélange réactionnel et laver la résine séquentiellement avec du DMF, du dichlorométhane et de nouveau du DMF trois fois chacun pendant au moins 1 minute à chaque fois.Retirez le groupe protecteur Fmoc et lavez la résine en suivant la procédure décrite précédemment avant de procéder au couplage de l’acide aminé suivant. Ensuite, couplez la bêta-alanine comme espaceur pour le marquage FITC en utilisant le même processus que celui montré pour le couplage d’acides aminés, puis ajoutez un mélange de FITC, DIPEA et DMF à la colonne de polypropylène dans l’obscurité pour effectuer le marquage FITC des peptides sur la résine. La réaction prendrait près de 8 heures.Pour effectuer la cyclisation du peptide linéaire, ajoutez un mélange d’acide trifluoroacétique, de triisopropylsilane et de dichlorométhane à la colonne de polypropylène pendant 2 minutes pour éliminer sélectivement le groupe trityl-protecteur de la cystéine. Égoutter le mélange et répéter la procédure jusqu’à ce que la solution jaunâtre devienne incolore pour éliminer complètement le groupe protecteur des trityles. Effectuer des lavages séquentiels de la résine avec du DMF et du dichlorométhane au moins trois fois et dissoudre le 4,4'bis-bromométhyl-biphényle dans le DMF avec le DIPEA.Ajouter la solution à la colonne et réagir pendant 4 heures. Lavez la résine avec 4 à 5 millilitres de méthanol deux fois pendant cinq minutes chacune, et séchez-la avec un flux continu d’azote. Pour les peptides contenant des cystéines, traiter la résine avec un cocktail de clivage efficace d’acide trifluoroacétique, de triisopropylsilane et d’eau ou d’acide trifluoroacétique, de triisopropylsilane, de 1 ,2-éthanedithiol et d’eau.Traitez la résine liée au peptide pendant 2 à 3 heures pour clivé le peptide, puis retirez soigneusement l’acide trifluoroacétique avec un jet d’azote. Pour obtenir les peptides bruts, ajouter 4 à 5 millilitres d’éther diéthylique à la préparation peptidique clivée pour précipiter les peptides bruts, et centrifuger à 10 000 x g pendant 4 minutes. Jetez soigneusement le surnageant et séchez le peptide à l’air libre pendant 3 minutes dans une hotte efficace.Dissoudre le peptide brut à petite échelle dans 800 microlitres d’acétonitrile, puis l’analyser en utilisant la chromatographie liquide haute performance en phase inverse et la chromatographie liquide-spectrométrie de masse. Inoculer 100 000 cellules HeLa dans 2 millilitres de DMEM dans une chambre de 12 puits avec un insert de plaque de culture tissulaire et incuber pendant 24 heures dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius contenant 5% de dioxyde de carbone. Retirez le milieu et incuber les cellules dans les chambres avec 1 millilitre de 10 micromolaires FITC-R8 ou FITC-sR8-4 dans du DMEM sans FBS pendant 1 heure.Après cela, retirez le milieu contenant les peptides et lavez les cellules trois fois avec 1 millilitre de PBS. Ajouter 1 millilitre de DMEM frais sans FBS dans les chambres, puis co-incuber les cellules HeLa dans la chambre avec l’insert de plaque de culture tissulaire, avec les cellules HeLa sur les lamelles rondes au fond pendant 2 heures. Fixez les cellules HeLa sur les lamelles rondes avec 2,5% de glutaraldéhyde pendant 15 minutes, puis colorez les cellules avec DAPI pendant 15 minutes.Enfin, observez les cellules HeLa sur les lames de couverture sous un microscope à fluorescence. Un diagramme schématique de la synthèse du peptide R8 linéaire marqué FITC et du peptide R8 agrafé marqué FITC est présenté ici. Les spectres HPLC et MS du peptide linéaire R8 et du peptide R8 agrafé sont représentés sur cette figure.Le temps de rétention du peptide agrafé était sensiblement plus long que celui de l’analogue linéaire, indiquant une hydrophobicité globale accrue du peptide après cyclisation avec la réticulation hydrophobe. Cette image graphique représente la stabilité du peptide linéaire et du peptide agrafé en présence de 25%FBS. Le R8 cyclique reste intact à 77,3% après incubation avec FBS pendant 4 heures, tandis que son homologue linéaire a été principalement dégradé, suggérant une stabilité protéolytique améliorée du peptide cyclique R8.Les images de microscopie à fluorescence de cellules vivantes de cellules HeLa et de cellules 4T1 après 1 heure d’incubation avec 3 peptides R8 linéaires marqués FITC micromolaires et peptide R8 agrafé marqué FITC sont présentées ici. On peut voir que les cellules traitées avec R8 cyclique avec réticulation aromatique présentaient une fluorescence intracellulaire plus élevée que celles traitées avec leur homologue linéaire. Des résultats similaires ont été obtenus avec l’analyse par cytométrie en flux.Pour étudier plus en détail si la R8 cyclique confère une pénétration accrue de cellule à cellule, des modèles transwell ont été utilisés pour simuler la perméabilité de la barrière des peptides d’une couche cellulaire à l’autre. Le R8 cyclique a clairement montré une pénétration trans-barrière plus élevée que le peptide linéaire R8, comme indiqué par une augmentation significative de la fluorescence intracellulaire. Une déprotection complète du groupe trityle de cystéine et de résine est importante pour l’étape de cyclisation suivante.En outre, l’efficacité de cyclisation dépend également des séquences spécifiques et des longueurs des peptides dues aux effets stériques. Dans un tel cas, l’utilisation d’une résine à faible capacité de charge ou de cyclisation des peptides sous des concentrations diluées en phase de solution serait utile. Ces peptides cycliques ont montré une perméabilité intercellulaire améliorée par rapport à leurs homologues linéaires.Nous pensons qu’ils sont très prometteurs pour vaincre les barrières biologiques et seront utilisés pour d’autres applications moléculaires dans le domaine de l’administration de médicaments.

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