Name: Comptage rapide des unités formant des colonies sous forme de plaque à 96 puits appliqué au microbiome de la drosophile (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Découvrez un comptage rapide et automatisé des unités formant des colonies en plaque à 96 puits appliqué au microbiome intestinal de Drosophila. Cette méthode offre un gain de temps centuple par rapport aux techniques traditionnelles.

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Le Dr Kerwyn Casey Huang, le Dr Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper et les membres du laboratoire de Ludington ont apporté une contribution précieuse à l’élaboration de ce protocole. Le financement a été fourni par la subvention NSF IOS 2032985, la subvention DP5OD017851 des NIH, une subvention de l’Institut Carnegie du Canada et le Fonds de dotation du Carnegie Institute for Science.

1. Colonisation des mouches
REMARQUE: Cette méthode convient à l’analyse quantitative des mouches avec un microbiome intestinal cultivable par placage de croissance des UFC. Un protocole détaillé pour l’élevage de mouches gnotobiotiques a déjà été publié12.
<ol><li>Établir une colonisation stable par une espèce bactérienne commensale.<ol><li>Préparer une culture bactérienne fraîche, granuler par centrifugation à 400 x g pendant 3 min à température ambiante, et remettre en suspension le granulé cellulaire dans du PBS à un OD600 de 1,0. Pour ce protocole, Lactiplantibacillus plantarum (anciennement connu sous le nom de Lactobacillus plantarum) a été cultivé pendant la nuit à une OD600 de 2,0.</li>
		<li>Pipeter 100 μL sur l’aliment dans un flacon anti-mouches (voir le tableau des matériaux). Étaler uniformément et laisser le liquide absorber pendant 15-30 min.</li>
		<li>Transférer 20 mouches exemptes de germes dans ce flacon en utilisant la technique standard de retournement de flacon à flacon34. Chaque mouche mangera une quantité à peu près égale de la dose bactérienne35. Alternativement, des œufs sans germes peuvent être ajoutés.</li>
		<li>Transférer les mouches dans des aliments frais et stériles tous les jours pendant 3 jours. Faites tout cela dans une enceinte de biosécurité et utilisez une technique stérile (Figure 1A-1).</li>
	</ol></li>
	<li>Avant de mesurer la charge en UFC, transférer les mouches dans un flacon contenant de l’eau de gélose stérile pendant 4 heures pour éliminer les bactéries passagères de l’intestin. Les flacons d’eau de gélose fournissent une source d’humidité pour la mouche, mais pas de nutrition pour la mouche ou les bactéries à la surface. Ils sont préparés dans les mêmes flacons de mouches stériles qu’avec les aliments standard, mais ne contiennent que de l’eau désionisée et 1,5% d’agar.</li>
</ol>2. Homogénéisation des mouches individuellement dans une plaque PCR à 96 puits
<ol><li>Préparez les plaques de batteur de perles à l’avance.<ol><li>Versez des billes de verre de 0,5 μm (voir Tableau des matériaux) sur le plateau de mesure des billes (imprimées en 3D à l’aide du fichier de codage supplémentaire 1 S1-bead-measurer.stl). Étalez les perles sur le plateau afin que tous les puits soient pleins et de niveau, puis brossez les perles en excès dans un tube conique pour les récupérer.</li>
		<li>Placez une plaque PCR semi-jupe (voir le tableau des matériaux) à l’envers sur le plateau de mesure et alignez-la avec les puits en l’insérant dans l’indentation sur le plateau de mesure. Ensuite, retournez-le rapidement pour transférer les perles.</li>
		<li>Enlevez les billes en excès de la surface de la plaque PCR et recouvrez-la de papier d’aluminium. Inspectez la plaque PCR pour vous assurer que tous les puits contiennent des billes. Utilisez une pelle de pesée si nécessaire pour ajouter des perles à un seul puits. Si l’électricité statique provoque le collage de billes sur les surfaces de la plaque, essuyez ou vaporisez l’arrière du plateau de mesure et de la plaque PCR avec de l’éthanol à 70%.</li>
		<li>Couvercle avec papier d’aluminium. De nombreuses plaques peuvent être préparées de cette manière, puis autoclavées et stockées pour une utilisation ultérieure. Lorsque vous êtes prêt à l’emploi, ajoutez 100 μL de PBS à chaque puits à l’aide du pipeteur à 96 canaux (voir le tableau des matériaux).</li>
	</ol></li>
	<li>Stériliser en surface les mouches colonisées par les microbes (voir étape 1) avec de l’éthanol à 70 % avant l’homogénéisation.<ol><li>Anesthésier les mouches avec 100% de CO2 pendant 5 s. Transférer les mouches anesthésiées du flacon dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL à l’aide d’un petit entonnoir (figure 1A-2). Dans cette étude, 25 mouches ont généralement été ajoutées par tube.</li>
		<li>Vaporiser immédiatement ~1 mL d’éthanol à 70% dans le tube, fermer le tube et mélanger par inversion pendant 10 s. Ensuite, aspirez l’éthanol avec une pipette P1000, en prenant soin de ne pas aspirer de mouches. Répéter une fois de plus avec de l’éthanol, puis deux fois avec du PBS stérile (figure 1A-3).</li>
	</ol></li>
	<li>Après le lavage final du PBS, fermez le tube et, avec le capuchon vers le bas, tapotez-le fort plusieurs fois sur le banc pour que les mouches pénètrent dans le bouchon.</li>
	<li>Ouvrez le tube et distribuez les mouches dans les puits à l’aide de pinces (figure 1A-4). Placez une mouche dans chaque puits (figure 1A-5). Gardez l’assiette sur la glace pendant le chargement pour garder les mouches anesthésiées.</li>
	<li>Scellez la plaque à l’aide d’une feuille de thermosoudage Thermal Bond (voir le tableau des matériaux).<ol><li>Tout d’abord, enlevez toutes les perles perdues qui se trouvent près des puits, car elles peuvent causer des fuites dans le joint de feuille. Assurez-vous que le côté terne de la feuille est orienté vers le bas sur la plaque et le côté brillant vers le haut vers le thermoscellant. Appuyez fermement sur le thermosoudeur (voir le tableau des matériaux) pendant 5 s (figure 1A-6). Polir avec l’applicateur à main (voir le tableau des matériaux) pour fixer la feuille. REMARQUE: Une mauvaise étanchéité est une cause de perte d’échantillon.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixez la plaque dans le vibreur de plaque. Homogénéiser pendant 5 min (figure 1A-7). Faire tourner la plaque de cordon pendant 30 s dans une mini-centrifugeuse (voir le tableau des matériaux) à 350 x g pour éliminer le liquide de la feuille d’étanchéité.</li>
	<li>Retirez la feuille tout en tenant la plaque afin de ne pas éclabousser des gouttelettes d’homogénat de mouches hors des puits.</li>
</ol>3. Dilution en série de l’homogénat de mouches et taches sur les plaques d’UFC
<ol><li>Placez quatre plaques rectangulaires de croissance de gélose MRS (voir le tableau des matériaux) dans l’enceinte de biosécurité et retirez leurs couvercles. Dans ce protocole, la gélose MRS a été utilisée pour la croissance de L. plantarum. Laissez sécher ces assiettes pendant au moins 10 minutes (20 minutes si elles sont fraîchement versées ou froides après l’entreposage). REMARQUE: Si les plaques sont humides, les gouttelettes de la plaque de 96 puits couleront ensemble et ruineront les comptes.</li>
	<li>Préparer trois plaques de dilution en ajoutant 100 μL de PBS à chaque puits d’une plaque stérile de 96 puits à l’aide d’un pipeteur à 96 canaux. Chargez un rack de pointes P20 sur le pipetor à 96 canaux.</li>
	<li>Effectuer une dilution de 1:10 en aspirant 11,1 μL d’homogénat de la plaque d’échantillonnage préparée dans la section 2 (figure 1A-8). Assurez-vous de puiser au milieu des puits plutôt qu’au fond des puits, car l’homogénat de mouches et les perles de verre obstrueront les pipettes. Les billes coulent et les particules de mouches flottent, laissant la couche intermédiaire presque claire.</li>
	<li>Verser les 11,1 μL dans la première plaque de dilution, qui contient déjà 100 μL de PBS stérile par puits. Maintenir la plaque de dilution sur l’agitateur à plaques pendant 10 s à 600 tr/min. Mélanger à nouveau en pipetant de haut en bas pendant cinq cycles. Transférer 11,1 μL de la première plaque de dilution à la deuxième plaque de dilution et répéter les étapes de mélange pour les deux plaques de dilution suivantes.</li>
	<li>Effectuer le placage en série de dilution comme décrit ci-dessous.<ol><li>Récupérez les plaques de croissance de l’armoire de biosécurité.</li>
		<li>En commençant par la plaque la plus diluée, repérer 2 μL de chaque puits sur les plaques de gélose à l’aide du pipeteur à 96 puits (figure 1A-9).<ol><li>Abaissez lentement la tête du pipeteur sur la plaque, en prenant soin de ne pas poignarder dans l’agar. Examinez attentivement la plaque et assurez-vous que toutes les taches ont été distribuées; sinon, ajoutez manuellement 2 μL à la position appropriée. Vérifiez que les taches liquides pénètrent rapidement dans la gélose et ne coulent pas ensemble.</li>
			<li>Si les taches courent ensemble, sécher un nouvel ensemble de plaques de gélose fraîche pendant une période plus longue et refaire les taches. S’il existe plusieurs types de plaques (p. ex. milieux différents ou avec des antibiotiques), repérez-les aussi. Remettre toute solution restante dans la plaque de dilution et passer à la concentration immédiatement plus élevée. NOTA: Lors de la détection de dilutions, mélanger cinq fois la dilution suivante pour s’assurer que le contenu des embouts de la pipette est débarrassé de la dilution précédente. Les plaques de dilution peuvent être conservées >8 h à 4 °C sans affecter le nombre de colonies35.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Répéter le procédé de placage décrit à l’étape 3.5 pour les plaques de dilution restantes, en passant de la plus diluée à la plus concentrée jusqu’à la tôle contenant l’homogénat d’origine.</li>
	<li>Lorsque tout le liquide a été absorbé dans l’agar-agar, retourner les plaques et les placer dans l’incubateur (figure 1A-10). Pour Lactiplantibacillus et Acetobacter de Drosophila, la température optimale est de 30 °C sur milieu MRS. Incuber jusqu’à ce que les colonies aient atteint la taille optimale : les colonies sont assez grandes pour les voir clairement, mais pas au point de fusionner ou d’interférer avec la croissance des autres (voir les résultats représentatifs pour la quantification de la taille optimale). REMARQUE : Les conditions de croissance optimales dépendent de la déformation et doivent être déterminées empiriquement. Pour Lactiplantibacillus de Drosophila, le temps optimal d’incubation est de 26 h à 30 h sur gélose MRS. Pour Acetobacter de Drosophila, le temps optimal d’incubation est de 30 h à 48 h sur MRS selon la souche.</li>
	<li>Après l’incubation, conserver les plaques à 4 °C si nécessaire jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour le comptage.</li>
</ol>4. Quantification des UFC
<ol><li>Quantifier les UFC en photographiant les plaques, puis en comptant les colonies à l’aide d’un logiciel automatisé, comme indiqué ci-dessous. Si les plaques ont été stockées à 4 °C, laissez-les d’abord atteindre la température ambiante afin qu’il n’y ait pas de condensation sur les plaques, ce qui produit de l’éblouissement.</li>
	<li>Organisez les plaques dans un ordre logique et conservez-les dans cet ordre pendant la photographie - il est plus facile de nommer les fichiers. Orientez toutes les plaques de sorte que A1 soit dans le coin supérieur gauche pour toutes les plaques. Il est recommandé d’étiqueter le coin A1 avec un identifiant unique pour éviter toute confusion des photos. Empiler chaque série de dilution dans l’ordre.</li>
	<li>Retirez le couvercle de la plaque et placez la plaque sur la scène avec A1 orienté dans le coin correct. Des dessins sont inclus pour la boîte à photos de plaque (fichier supplémentaire 1, fichier supplémentaire 2), qui est optimisée pour photographier ces plaques de plateau et comprend des options d’éclairage et de filtre pour imager les colonies fluorescentes.</li>
	<li>Imaginez les plaques. Utilisez l’appareil photo (voir Tableau des matériaux) avec des réglages manuels pour obtenir un niveau d’exposition constant entre les plaques. Un réglage de distance focale longue est recommandé pour minimiser la distorsion de perspective. Capturez la photo à l’aide d’un obturateur à distance pour minimiser le flou dû au tremblement de l’appareil photo.</li>
	<li>Transférez les images sur un ordinateur et renommez-les, y compris le nom de l’expérience, le type de média, le facteur de dilution et tout autre détail pertinent. Certains systèmes d’exploitation (voir Tableau des matières) disposent d’une fonction utile de changement de nom par lots dans le Finder en cliquant avec le bouton droit de la souris sur une sélection de fichiers.</li>
</ol>5. Comptage automatisé des colonies à l’aide de la suite Count-On-It (fichier supplémentaire 3)
<ol><li>Recadrez les images à l’aide du plugin Croptacular fourni (fichier de codage supplémentaire 2) pour ImageJ. Ce plugin permet de diviser l’image en un tableau ordonné de sous-régions (par exemple, 8 x 12 pour une plaque de 96 puits). Les sous-régions seront comptées individuellement. Remarque : Un plug-in séparé pour compter les plaques circulaires appelé Circus est décrit dans le fichier de codage supplémentaire 3 Circus_.ijm.<ol><li>Organisez les images à traiter pour la quantification dans un dossier. Choisissez des noms de fichiers qui distinguent les plaques, car ces noms de fichiers deviennent des titres de colonne pour chaque ensemble de comptes. Dans ce dossier, créez des sous-dossiers nommés « cropped » et « receipts ».</li>
		<li>Lancez Croptacular, puis cliquez sur OK pour commencer le recadrage. REMARQUE:Les paramètres par défaut sont affichés et sont généralement suffisants. Selon la résolution de l’image, l’éclairage, la taille du spot, etc., il peut être utile d’ajuster les paramètres de base.</li>
		<li>Si l’image est déjà droite, appuyez simplement sur Espace. Sinon, redressez l’image en traçant une ligne le long d’un bord qui doit devenir horizontal. Redessinez la ligne autant de fois que nécessaire si l’image n’apparaît toujours pas redressée.</li>
		<li>Ensuite, tracez une zone de délimitation de la zone pour laquelle le comptage doit être effectué. Ajustez la taille et la proportion jusqu’à ce que toutes les taches soient dans leurs cellules. Faites glisser le curseur en dehors de la zone de limite pour actualiser la grille. Lorsque la grille semble bonne, appuyez sur Espace.</li>
		<li>Assurez-vous que l’image suivante pivote automatiquement sous le même angle que la première; Le plugin suppose que toutes les photos sont alignées de la même manière. Si cela est exact, appuyez sur Espace pour continuer. Sinon, redressez l’image comme avant. La grille rappelle également la même position que l’image précédente; ajustez si nécessaire, puis appuyez sur Espace.</li>
	</ol></li>
	<li>Énumérez les colonies sur les plaques à l’aide du plug-in Count-On-It: Gridiron fourni pour ImageJ (fichier de codage supplémentaire 4). Des instructions détaillées pour l’installation et l’utilisation du plugin sont incluses dans le fichier supplémentaire 3.<ol><li>Lancez Count-On-It > Gridiron. Utilisez les mêmes paramètres de grille qu’avec Croptacular. Les utilisateurs peuvent regrouper un dossier entier, analyser une seule image ou partir de l’image actuelle.</li>
		<li>Définissez le seuil en fonction d’une valeur d’intensité de pixels supérieure et inférieure. Rendre le seuil aussi strict que possible tout en sélectionnant toutes les colonies. Idéalement, il y aura un peu d’espace entre les colonies sélectionnées, mais le logiciel est capable de segmenter les blobs dans une certaine mesure. Cliquez sur OK dans la boîte de dialogue « Action requise » lorsque le seuil est satisfaisant.</li>
		<li>Pour inspecter les résultats, zoomez et regardez de plus près le nombre de colonies. Cliquez sur Annuler pour abandonner le plugin. Cliquez sur OK pour continuer.</li>
		<li>Sur la première image, assurez-vous que l’option est donnée pour continuer ou revenir au menu de configuration, par exemple, pour modifier la taille minimale de la colonie. Pour poursuivre le traitement par lots, cliquez sur OK. Ensuite, sélectionnez un dossier pour conserver le tableau des reçus et des résultats. Utilisez le dossier « reçus » ou créez un nouveau dossier.</li>
		<li>Après la première image, les images suivantes seront par défaut au même seuil que les paramètres précédents. Cliquez sur OK pour utiliser ces paramètres ou ajuster les paramètres. Si les photos sont cohérentes et que le paramètre est précis, cliquez sur OK dans la boîte de dialogue « Action requise ». REMARQUE: Une fois que toutes les images du lot sont terminées, le tableau des résultats est automatiquement enregistré dans le même dossier que les reçus.</li>
		<li>Passez en revue les reçus de comptage produits par le logiciel et corrigez manuellement les erreurs de comptage. Le plug-in ImageJ est statistiquement précis, mais des erreurs se produisent. Prouvez les reçus pour examiner les valeurs aberrantes et identifier les erreurs de comptage. Le logiciel enregistre les données CFU sous forme de fichier .csv dans le même dossier que les reçus.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysez les données à l’aide du logiciel préféré de l’utilisateur.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les techniques détaillées présentées ici permettent de multiplier par > 100 le nombre d’échantillons pouvant être évalués dans une expérience de comptage de l’UFC. Cette technique fait progresser les méthodes existantes pour les expériences sur le microbiome chez la drosophile 12,35,36 en utilisant le format de plaque à 96 puits pour tester les mouches individuelles. En outre, il applique une méthode de placage ponctuelplus efficace 19,31 et un flux de travail automatisé avec une plate-forme de photographie et de comptage de colonies. L’importance de cette méthode pour la drosophile est de standardiser les expériences au format de plaque à 96 puits, ce qui permet la manipulation simultanée d’un grand nombre de réplicats biologiques avec automatisation pour obtenir une quantification à haut débit des UFC.
La plateforme de 96 puits montre que l’augmentation de la fréquence de transfert et de « l’élimination » des bactéries transitoires entraîne une réduction significative de l’abondance moyenne et de la variation entre les échantillons (Figure 1B,C), démontrant la rigueur de ce protocole amélioré. L’une des limites des mouches de cohabitation est le transfert horizontal de bactéries entre les mouches. Une solution proposée consiste à garder les mouches individuellement dans un format de plaque de 96 puits, comme le plat d’alimentation des animaux entiers38.
Bien qu’une réduction significative de la charge bactérienne n’ait pas été observée lorsque les mouches ont été lavées à l’éthanol, ces mouches n’avaient été gardées en présence de bactéries externes que pendant 3 jours. Le logement pendant de plus longues périodes pourrait permettre à une plus grande charge bactérienne de s’accumuler39. Par conséquent, le lavage à l’éthanol est toujours recommandé.
Le transfert des mouches dans la plaque de 96 puits est la première étape critique pour la mise en place du flux de travail (Figure 1A). Une fois les mouches lavées, elles sont distribuées dans les puits une à la fois. Un tableau des plaques est utile à ce stade pour noter quelles conditions sont présentes dans chaque puits et ajouter des notes telles que « la mouche a été perdue ». L’homogénéisation est une autre étape critique avec quelques mises en garde importantes. Les bactéries survivent au processus d’homogénéisation en présence d’une mouche (Figure 1D,E), et vraisemblablement, ce principe est également vrai lorsque les bactéries sont à l’intérieur de l’intestin de la mouche. Cependant, les bactéries sont également tuées lorsqu’elles sont homogénéisées uniquement dans des plaques de battement de billes, démontrant que l’homogénéisation peut tuer les cellules bactériennes dans certaines circonstances, une limitation qui peut être importante si l’on homogénéise des intestins disséqués, par exemple. Notamment, la perte d’UFC lors de l’homogénéisation dépend du nombre d’UFC dans l’échantillon, et la perte est minime lorsque ~105 UFC par puits sont utilisés. Une préservation plus poussée des UFC peut être obtenue en arrêtant l’homogénéisation à mi-chemin et en refroidissant la plaque sur la glace.
L’homogénéisation a été effectuée pendant 5 minutes dans ce protocole sur la base d’expériences de contrôle où un nombre connu d’UFC ont été mélangées avec une mouche exempte de germes, ce qui a fonctionné empiriquement pour les bactéries de mouches. Moins de coups ont entraîné la présence de plus grandes parties de mouches, ce qui interfère avec le pipetage, tandis que des temps d’homogénéisation significativement plus longs de ~ 10 min ont rendu le nombre d’UFC plus variable. On a observé que le plus petit volume et la forme inclinée des puits à plaques coniques réduisaient l’efficacité du battage des billes par rapport aux tubes cylindriques de 2 mL. De nombreuses variantes de cette approche générale sont possibles, y compris quelles souches bactériennes, quel récipient de battage de perles, quelles perles et quel génotype de mouche sont utilisés. Les cas d’utilisation individuels doivent utiliser des contrôles positifs pour établir leur approche.
La méthode de placage ponctuel a été utilisée d’une manière spécifique : des dilutions 1:2 de L. plantarum WF dans le PBS ont été repérées sur des plaques MRS et incubées à 30 °C pendant 2 jours (des temps d’incubation plus courts peuvent être mis en œuvre pour générer des colonies plus petites). La méthode nécessite un certain investissement initial dans l’équipement, principalement le batteur de billes et le pipettor à 96 canaux (figure 2A), ce qui est nécessaire à la fois pour la série de dilution et le placage ponctuel. Cependant, des options moins coûteuses sont disponibles, y compris un réplicateur de plaques de 96 puits avec des broches fendues. La série de dilutions est une étape critique qui affecte l’exactitude des résultats du comptage de l’UFC. En termes de modes de défaillance, il est possible de boucher les pointes de pipette avec des pièces de mouche ou des perles de verre et que les extrémités de pipette ne scellent pas correctement sur la pipette ou tombent en panne pour une autre raison. Tous ces problèmes entraînent un sous-dénombrement des puits touchés et doivent être surveillés. Un mélange adéquat à chaque étape de la série de dilution est également crucial. Chaque dilution doit être soigneusement mélangée soit en mettant la plaque sur un agitateur à plaques, soit en pipetant de haut en bas 15 à 20 fois, ce qui sert également à rincer les pointes. En repérant de la tôle la plus diluée à la moins diluée, les embouts peuvent être réutilisés pour toute la série de dilution. Avec des dilutions de 1:2, le comptage est précis sur une plage de 2 à 25 colonies, couvrant un ordre de grandeur (Figure 2C). Par conséquent, les dilutions 1:10 permettent d’économiser du temps et des matériaux. Une autre variable dont on peut tirer parti est le temps d’incubation, qui peut être ajusté pour produire des colonies plus petites et, ainsi, augmenter la gamme des taches dénombrables en empêchant la fusion des colonies adjacentes.
Une photo de qualité de la plaque est essentielle car elle devient la source brute des données à partir desquelles les UFC sont analysées et peuvent être archivées indéfiniment. La FluoroBox est conçue pour produire des photos des plaques avec une intensité lumineuse uniforme, ce qui minimise l’éblouissement sur la surface de la gélose. De plus, la conception est capable de photographier sélectivement des colonies fluorescentes à l’aide de lumières LED unicolores et de filtres photo colorés (Figure 3A). La construction d’une installation comme la FluoroBox, avec un éclairage contrôlé et des réglages de caméra, peut augmenter considérablement la reproductibilité des images CFU, ce qui est important pour l’analyse automatisée. La morphologie des colonies, l’intensité de fluorescence et les effets du temps ou de la densité sur la croissance des colonies ne sont que quelques-unes des propriétés qui peuvent être analysées à l’aide des photographies. La boîte à photos peut être construite sans les filtres de couleur et les lumières unicolores si aucune bactérie fluorescente n’est utilisée, ce qui réduit le coût et la complexité. Différents feux d’excitation et filtres d’émission pourraient être substitués à ceux recommandés ici si un fluorophore différent est utilisé par un laboratoire. Une caméra connectée à une tablette via WiFi à l’aide d’une application est utile à la fois pour la fonction d’obturateur automatisé afin d’éviter les tremblements et pour faciliter le transfert de données. Les images peuvent être transférées sur la tablette, puis sur un ordinateur portable à l’aide d’un logiciel de transfert de fichiers sans fil. Les caméras recommandées avec ces capacités sont indiquées dans le tableau des matériaux.
Count-On-It est un plug-in écrit en ImageJ. Le logiciel de comptage CFU automatisé segmente l’image de la plaque dans une grille uniforme de 96 puits, compte les colonies dans chaque cellule de grille et regroupe les résultats dans une simple feuille de calcul. Comme il y a toujours une variation dans la position de la grille spot sur la plaque et sur la photo, l’utilisateur doit conformer manuellement la grille à la photo à l’aide du plug-in Croptacular . Cela permet également d’exclure les zones proches du bord de la plaque, qui présentent un éblouissement. La définition du seuil est essentielle pour obtenir le nombre d’UFC le plus précis à partir de l’image. Si le seuil est fixé trop haut, les colonies fusionneront; Si le seuil est fixé trop bas, les colonies seront exclues. Une fois le seuil défini, la macro applique un flou gaussien pour adoucir les bords et réduire le repliement, le filtre du bassin versant divise les colonies qui se chevauchent et les taches sont comptées à l’aide des particules d’analyse. 
Parfois, la densité de colonies est trop élevée à un endroit particulier. Count-On-It fournit un moyen de faire face à cela. Pour estimer le nombre de colonies dans une cellule de grille avec des colonies partiellement fusionnées, on considère d’abord la surface moyenne d’un blob circulaire de la plaque entière comme C moyenne. Ensuite, l’aire du blob A 1 est divisée par la surface moyenne d’un blob circulaire A1/Cmoyenne. Ce nombre est arrondi à l’entier le plus proche, et c’est l’estimation du nombre de colonies dans un blob. Cette fonction est l’une des raisons pour lesquelles le seuil peut influencer les résultats du comptage : la surface moyenne relative de la colonie par rapport à une zone d’objets blob fusionnés sera différente selon la façon dont le seuil affecte les objets blob fusionnés.
Les méthodes présentées ont plusieurs limites. Il s’agit notamment de la nécessité de disposer d’équipements pour distribuer avec précision les fluides liquides à partir de plaques à 96 puits. Cet équipement, qu’il s’agisse d’un pipeteur à 96 canaux ou d’un outil à broche de réplicateur à fente, peut coûter des milliers de dollars à obtenir. Des alternatives moins chères existent mais sont moins précises. Le comptage automatisé via Count-On-It présente également certaines limites. Par exemple, si deux types de colonies dans une population mixte étaient délimités en fonction de la taille seule, le comptage des blob ne serait pas en mesure d’affecter les colonies au type correct. Dans ce cas, les taches avec des blobs devraient être éliminées des dénombrements. Une différenciation plus poussée des colonies en fonction de la morphologie serait une extension précieuse de la méthode qui n’est pas actuellement mise en œuvre. L’utilisation de milieux sélectifs, y compris des nutriments spécifiques à la souche et des antibiotiques, simplifie le besoin d’analyse d’images complexes.
Le maintien des expériences sur les mouches des fruits dans des plaques de 96 puits multiplie le nombre d’échantillons et les conditions qui peuvent être testés dans une seule expérience et peut faciliter les criblages à haut débit dans les phénotypes d’association drosophile-bactérie. Nous envisageons que cette méthode puisse être étendue en utilisant des milieux sélectifs pour différencier de nombreuses souches bactériennes dans des mélanges complexes. La méthode ne se limite pas à l’étude du microbiome des mouches. La quantification des UFC est courante dans de nombreuses applications de la microbiologie, de la numération des coliformes dans l’eau potable à l’identification des agents pathogènes. Le système de placage CFU présenté ici permet des criblages à haut débit, ainsi que l’acquisition, le traitement, le stockage et la livraison automatisés des résultats.

La relation entre le microbiote intestinal et leur hôte animal est de plus en plus au premier plan des études biologiques1, qui montrent que la composition de la souche du microbiome est importante pour la physiologie de l’hôte 2,3,4. Le rythme des découvertes a été limité par des facteurs de confusion tels qu’une forte variation naturelle interindividuelle et une grande diversité de bactéries colonisatrices 5,6,7. La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est apparue comme un modèle prometteur en raison de son microbiome naturellement peu diversifié, de sa facilité de manipulation et de sa génétique hôte robuste 8,9,10,11. Les mouches peuvent être exemptes de germes et réassociées à un microbiote défini12, et il a été démontré que la flore influence les traits physiologiques des mouches13,14. La flore innée se compose d’un ensemble limité de bactéries qui sont toutes cultivables, et leurs proches parents sont également endogènes à l’intestin des mammifères, y compris les lactobacilles, les protéobactéries et les entérocoques15.
L’étude de l’influence du microbiome sur les traits de l’hôte nécessite de quantifier le microbiome en termes d’espèces présentes et d’abondances absolues16. Les méthodes prédominantes d’analyse du microbiome de la mouche sont le nombre d’unités formant des colonies (UFC)17, le séquençage de l’amplicon du gène de l’ARNr16S 9 et la qPCR du gène 18S de l’ARNr16S. Le nombre d’UFC peut être obtenu sans réactifs coûteux, et ils confirment la viabilité des cellules bactériennes19. Les techniques 16S, y compris la qPCR, présentent des avantages en ce sens que les identités taxonomiques des microbes peuvent être déterminées sans tenir compte de leurs besoins de croissance ou de la morphologie des colonies20.
Dans le cas où les expériences utilisent des mouches avec un microbiome défini de bactéries connues (mouches gnotobiotiques), le nombre d’UFC présente des avantages particuliers par rapport au séquençage21. Le séquençage est coûteux, nécessitant une extraction d’ADN, une préparation de bibliothèque basée sur la PCR et un séquençage à haut débit pour obtenir des abondances relatives22. En raison de leur coût élevé, les méthodes de séquençage à haut débit doivent généralement être effectuées en vrac pour réduire le prix par échantillon23. D’autres méthodes telles que la qPCR sont nécessaires pour obtenir des abondances absolues16. En revanche, le nombre d’UFC est rapide et bon marché et donne le nombre absolu de cellules viables. La drosophile8 et d’autres petits modèles de microbiome 24, y compris le ver, Caenorhabditis elegans 25,26, et le poisson-zèbre larvaire, Danio rerio, cultivé gnotobiotiquement 27, ont une gamme limitée de bactéries, qui ont des caractéristiques de croissance connues 28. Dans ces cas, en particulier chez les animaux gnotobiotiques, le comptage de l’UFC peut différencier toutes les espèces de bactéries au sein des communautés intestinales multi-espèces21,27,29. Des méthodes de comptage CFU à débit plus élevé amélioreraient encore la rentabilité et la rapidité de la mesure de la composition du microbiome et pourraient être appliquées à de nombreuses autres expériences de microbiologie.
Le comptage des UFC par dilution en série d’une suspension bactérienne sur un milieu de croissance à base d’agar est une méthode standard dans le domaine de la microbiologie. Les colonies qui poussent sur les plaques sont ensuite comptées manuellement. Les dilutions permettent au chercheur de sélectionner une densité de colonies qui est dénombrable (p. ex., ~100 UFC par plaque), ce qui signifie que les colonies ne se développent pas les unes dans les autres et peuvent être comptées dans un laps de temps raisonnable. La plupart des microbiologistes utilisent essentiellement la même méthode de comptage de l’UFC développée il y a 140 ans dans le laboratoire de Robert Koch, et pour de nombreuses applications, cette méthode est encore adéquate. Cependant, un problème se pose lorsqu’on cherche à quantifier un grand nombre d’échantillons. Un seul échantillon peut nécessiter le placage de 1 à 10 dilutions en série de l’échantillon pour obtenir des UFC dénombrables, de sorte que les expériences impliquant plus de quelques dizaines d’échantillons deviennent éprouvantes. Diverses méthodes ont été mises au point pour accroître l’efficacité du dénombrement des UFC. Le placage en spirale automatisé élimine le besoin de dilutions en série30, ce qui rend une seule plaque nécessaire pour le comptage de l’UFC mais augmente le temps nécessaire pour plaquer l’échantillon. Le repérage de dilution sur plaque unique en série (SP-SDS) permet d’estimer l’UFC à partir d’un nombre réduit de plaques par échantillon31. Ces méthodes constituent une amélioration par rapport à la méthode traditionnelle de placage à tartiner, mais nécessitent toujours la manipulation et le placage d’échantillons bactériens seuls et ne sont donc pas idéales pour un débit élevé. La manipulation d’échantillons dans des plaques à 96 puits et le placage ponctuel de ces 96 échantillons sur des plaques de gélose rectangulaires améliorent considérablement le débit des échantillons19.
Les microbiomes sont généralement composés de plusieurs souches et espèces. Alors que les espèces peuvent souvent être distinguées par la morphologie de la colonie ou les milieux de croissance, la fluorescence peut être utilisée pour distinguer davantage différents types de bactéries et leurs caractéristiques de croissance32. Par exemple, différents génotypes de la même espèce peuvent être marqués avec différentes protéines fluorescentes codées génétiquement. Les méthodes d’imagerie sur plaque qui intègrent la fluorescence permettent aux chercheurs de tirer parti de ces techniques génétiques dans les tests basés sur l’UFC32. L’intégration de la fluorescence dans les méthodes de comptage des UFC à haut débit améliorerait encore leur utilité.
Le comptage manuel des UFC devient fastidieux lorsqu’il y a un grand nombre d’échantillons. Le comptage automatisé des UFC peut être effectué en photographiant la plaque et en traitant l’image à l’aide d’un logiciel spécialisé33. Sieuwerts et al. ont combiné l’efficacité améliorée du placage ponctuel avec le comptage automatisé des colonies à l’aide de la photographie numérique conventionnelle et du logiciel ImageJ19.
Une méthode à haut débit pour dépister les phénotypes de microbes spécifiques et les associations d’hôtes faciliterait les études sur l’assemblage de la communauté du microbiome et l’impact sur la santé et la forme physique de l’hôte. Pour les études du microbiome de la drosophile , une plateforme de microbiologie à haut débit intégrerait la manipulation d’échantillons de mouches dans un format de plaque à 96 puits, la lyse des mouches sans lyse bactérienne, l’efficacité du placage ponctuel, la capacité d’utiliser la fluorescence et de distinguer plusieurs fluorophores, un environnement lumineux contrôlé pour l’imagerie reproductible des plaques d’UFC et un logiciel de comptage de colonies automatisé fiable. Cet article décrit une méthode optimisée pour le dosage des UFC chez les mouches gnotobiotiques, qui est simple, rapide et automatisée. Ce protocole décrit un nouveau flux de travail combinant le meilleur des méthodes précédemment publiées et optimisé pour explorer le microbiome intestinal chez la drosophile.

<table><tbody><tr><td>Battage de billes et placage localisé</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacons anti-mouches</td><td>Genesee</td><td>32-121</td><td>autoclavable</td></tr> Bouchons de <tr><td>flacons anti-mouches</td><td>Genesee</td><td>59-201</td><td></td></tr><tr><td>Applicateur manuel</td><td>autoclavable 3M</td><td>3M PA1</td><td></td></tr><tr><td>Thermosoudeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater 96</td><td>BioSpec</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Mini-BeadBeater Perles de verre, 0,5 mm</td><td>BioSpec&nbsp ;</td><td></td><td></td>11079105</tr><tr><td>MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner</td><td>Labnet</td><td>LI-CF-P1000</td><td></td></tr><tr><td>Rainin BenchSmart 96 pipette semi-automatisée</td><td>Mettler Toledo</td><td>30296705</td><td>Options moins coûteuses disponibles, y compris l’outil à goupille fendue à 96 puits de VP Scientific</td></tr><tr><td>TempPlate Plaque PCR à 96 puits semi-jupe, jupe droite, naturelle</td><td>USA scientific</td><td>1402-9220</td><td>Doit être en polypropylène pour la thermosoudeuse</td></tr><tr><td>Feuille de thermoscellage à liaison thermique</td><td>4titude</td><td>4ti-0591</td><td>Maintenir stérile</td></tr><tr><td>Plaque de plateau, 128 x 85 mm, Polystyrène, stérile</td><td>SPL Sciences de la vie</td><td>31001</td><td>Pour la fabrication de plaques de gélose rectangulaires</td></tr><tr><td><forte>Construction Photobox</forte>&frac14</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ; "-20 X &frac12 ; &rdquo; Boulons (X2)</td><td>Amazon</td><td>ASIN : B07BP1WR3H</td><td>Pour fixer le support de caméra. La marque n’a pas d’importance. N’importe quel boulon 1/4 »-20 1/2 » fonctionne.</td></tr><tr><td>&frac14 ; "-20 x &frac12 ; &rdquo; Écrou du connecteur&nbsp ;</td><td>Amazon</td><td>UPC : 799862376780</td><td>alias écrou d’assemblage ou boulon de connecteur. Il s’agit de fixer les élastiques sur le support de plaque. La marque n’a pas d’importance.</td></tr><tr><td>&frac14 ; "-20 x &frac34 ; &rdquo; boulons (X3)</td><td>Amazon</td><td>ASIN : B003QZSZY4</td><td>Pour le support de plaque. La marque n’a pas d’importance.</td></tr><tr><td>1/8" x &frac12 ; &rdquo; rondelle</td><td>Amazon</td><td>UPC : 611982484599</td><td>Rondelle pour les écrous borgnes à l’extérieur de la boîte. La marque n’a pas d’importance. Vaporisez de la peinture noire avant de la fixer pour la fondre avec l’acrylique.</td></tr><tr><td>Fil de calibre 18 - Fil d’alimentation à deux conducteurs - 18 AWG Fil d’alimentation &ndash ; 10ft</td><td>Superbrightleds.com</td><td>WP18-2</td><td></td></tr><tr><td>22-10 AWG Red Wire Nut - WN-R2210 &ndash ; Quantity 4Superbrightleds.com</td><td></td> <td>WN-R2210</td><td></td></tr><tr><td>22-18 AWG 3/16in Connecteur femelle à encastrer - 22-18 AWG Quantity 3</td><td>Superbrightleds.com</td><td>SCFP-2218</td><td></td></tr><tr><td>Connecteur cavalier à pince sans soudure 4" - Bande lumineuse LED monochrome de 8 mm - Quantity 3</td><td>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-2</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur de queue de cochon sans soudure de 4 po - Bande lumineuse LED monochrome de 8 mm &ndash ; Quantity 3</td><td>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-1&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Poignée de tiroir</td><td>6" Amazon</td><td>ASIN : B07Z331P99 N’importe</td><td>quelle poignée de tiroir devrait fonctionner.</td></tr><tr><td>6 pouces Glissières de tiroir</td><td>Btibpse</td><td>UPC : 712243424979</td><td>Coupez les bouchons en caoutchouc à fermeture douce sur les glissières de tiroir.</td></tr><tr><td>8-32 x et frac12 ; &rdquo; Écrous borgnes (x4)</td><td>Amazon</td><td>ASIN : B00HYLZB98</td><td>Fixe les boulons coulissants du tiroir à l’extérieur de la boîte. La marque n’a pas d’importance. Le nylon n’endommagera pas l’acrylique. Vaporisez de la peinture noire avant de la fixer pour la fondre avec l’acrylique.</td></tr><tr><td>8-32 x et frac12 ; &rdquo; Boulons en nylon (x4)</td><td>Amazon</td><td>ASIN : B07KX9T7NF</td><td>Pour fixer les glissières de tiroir. La marque n’a pas d’importance. Tout boulon ou vis mécanique répondant aux spécifications fonctionne. Le nylon n’endommagera pas l’acrylique et vous permet de couper le boulon au ras de l’écrou. Vaporisez de la peinture noire avant de la fixer pour la fondre avec l’acrylique.</td></tr><tr><td>Colle acrylique</td><td>SCIGRIP</td><td>Ean : 7844908489337</td><td>SCIGRIP Weld-On #4 Adhésif, pinte et bouteille applicatrice à souder avec aiguille</td></tr><tr><td>Attaches de câble noires - Paquet de 10 - 4 pouces de long&nbsp ;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>CT-B04-10</td><td></td></tr><tr><td>Support en L pour appareil photo</td><td>WLPREOE, Vikerer,</td><td>ASIN sans marque : B09X46YKQZ</td><td>Le support doit être « inversé » par rapport à sa configuration prévue afin que l’appareil photo se trouve à « l’extérieur » du L. Certains supports sont livrés en deux pièces et permettent cette configuration alternative, d’autres non, vous en aurez besoin d’un qui peut être retourné. Devrait également avoir des trous de 1/4" pour la fixation. WLPREOE, Vikerer, sans marque. Numéro d’identification de série Amazon donné à titre d’exemple.</td></tr><tr><td>Appareil photo Canon série T pour l’option de connexion OU</td><td>Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.</td><td>1894C002</td><td>Les appareils photo de la série Canon Ti sont une bonne option et peuvent être reliés à un ordinateur. À utiliser avec l’objectif standard 18-55 mm. Les options utilisées sont recommandées du Canon T5 au T7 (modèle actuel).</td></tr><tr><td>Bande lumineuse LED monochrome de longueur personnalisée - Ruban lumineux de la série Eco - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Bleu - 2 mètres</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BBLU-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>Bande lumineuse LED unicolore de longueur personnalisée - Ruban lumineux de la série Eco - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Vert &ndash ; 2 mètres</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BGRE-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>Bande lumineuse LED monochrome de longueur personnalisée - Ruban lumineux de la série Eco - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Blanc naturel 4000K &ndash ; 2 mètres&nbsp ;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-A40K80-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>Perceuse avec &frac14 ; « , 1/8 » forets</td><td>Noir & Decker</td><td>&lrm ; BDCDD12PK</td><td>La marque n’a pas d’importance.</td></tr><tr><td>Peinture en aérosol noir mat, 2X Rustoleum ultra-mat</td><td></td><td>331182</td><td>Peignez l’intérieur de tout NOIR PLAT. La marque n’a pas d’importance.</td></tr><tr><td>Murs en acrylique découpés au laser</td><td>Big Blue Saw</td><td>www.bigbluesaw.com</td><td>Utilisez le PDF ci-joint, supprimez toutes les découpes dans la pièce supérieure sauf le trou souhaité pour l’appareil photo.</td></tr><tr><td>Alimentation à découpage LED Mean Well - Série LPV 20-100W Alimentation LED à sortie unique - 24V DC - 20 Watt&nbsp ;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>LPV-20-24</td><td></td></tr><tr><td>Panasonic ZS100 pour la connexion wifi à un téléphone, une tablette ou un ordinateur</td><td>Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.</td>Les appareils photo <td>DMC-ZS100K</td><td>Panasonic peuvent être connectés sans fil à un ordinateur pour le transfert de données et les options d’obturateur à distance. Les options d’occasion sont bonnes.</td></tr><tr><td>Plaque de dégagement rapide</td><td>Neewer Aluminium 50 mm Plaque de dégagement rapide QR Clamp 3/8 de pouce avec ASIN de 1/4 de pouce</td><td>: B07417F21D</td><td>Ajoutez-la au support afin que l’appareil photo puisse être facilement retiré pour changer de filtre de couleur. Numéro d’identification de série Amazon donné à titre d’exemple.</td></tr><tr><td>Élastiques, Tailles assorties</td><td>BAZIC Products</td><td>Alliance Rubber 26649</td><td>Les élastiques se montent sur le support de plaque. La marque n’a pas d’importance.</td></tr><tr><td>Attaches de câble vis/adhésives Bases de montage - Base 3/4 pouce &ndash ; Quantity 4</td><td>Superbrightleds.com</td><td>CTMB-20</td><td></td></tr><tr><td>SPST Interrupteur à bascule rond - Sans LED Quantity 3</td><td>Superbrightleds.com</td><td>RRS-SP</td><td></td></tr><tr><td>Tiffen 29 Filter (Rouge) 72 mm&nbsp ;</td><td>Tiffen</td><td>72R29</td><td></td></tr><tr><td>Filtre Tiffen 58 (Vert) 72 mm</td><td>Tiffen</td><td>7258</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ64</td><td>https://imagej.net/downloads</td><td>N/A</td><td>Gratuit. Il suffit de citer : Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., &hellip ; Cardona, A. (2012). Fidji : une plateforme open-source pour l’analyse d’images biologiques. Nature Methods, 9(7), 676-682. doi :10.1038/nmeth.2019</td></tr><tr><td>MacOSX</td><td>Apple</td><td>N/A</td><td>Dispose d’une fonction utile de renommage par lots dans le Finder pour renommer un groupe de photos afin de faciliter l’organisation et l’analyse dans Count-on-it.</td></tr><tr><td>Unix</td><td>BSD</td><td>N/A</td><td>64 bits</td></tr><tr><td>Windows</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>64 bits</td></tr></tbody></table>

comptage rapide des unités formant des colonies sous forme de plaque à 96 puits appliqué au microbiome de la drosophile

Fast Colony Forming Unit Counting in 96-Well Plate Format Applied to the Drosophila Microbiome

Les intestins des animaux sont colonisés par des microbes commensales, qui ont un impact sur le développement, la santé et le comportement de l’hôte. Une quantification précise de la colonisation est essentielle pour étudier les interactions complexes entre l’hôte et le microbe à la fois pour valider la composition microbienne et étudier ses effets. Drosophila melanogaster, qui a une faible diversité microbienne native et est économique à élever avec une composition microbienne définie, est apparu comme un organisme modèle pour l’étude du microbiome intestinal. L’analyse du microbiome d’un organisme individuel nécessite l’identification des espèces microbiennes présentes et la quantification de leur abondance absolue. Cet article présente une méthode pour l’analyse d’un grand nombre de microbiomes de mouches individuelles. Les mouches sont préparées dans des plaques de 96 puits, ce qui permet de manipuler un grand nombre d’échantillons à la fois. L’abondance microbienne est quantifiée en plaquant jusqu’à 96 homogénats de mouches entières sur une seule plaque de gélose dans un ensemble de taches, puis en comptant les unités formant colonie (UFC) qui se développent dans chaque endroit. Ce système de placage est associé à une plate-forme automatisée de quantification CFU, qui intègre la photographie des plaques, la différenciation des colonies fluorescentes et le comptage automatisé des colonies à l’aide d’un plugin ImageJ. Les avantages sont que (i) cette méthode est suffisamment sensible pour détecter les différences entre les traitements, (ii) la méthode de placage ponctuel est aussi précise que les méthodes de placage traditionnelles, et (iii) le processus de comptage automatisé est précis et plus rapide que le comptage manuel. Le flux de travail présenté ici permet une quantification à haut débit des UFC dans un grand nombre de réplicats et peut être appliqué à d’autres systèmes d’étude microbiologique, y compris in vitro et d’autres modèles de petits animaux.

Cette méthode quantifie l’abondance microbienne à l’aide d’un format de plaque de 96 puits pour les unités formant colonie (UFC) et est appliquée au microbiome de la drosophile dans des échantillons d’homogénat de mouches entières. Les UFC sont comptées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images automatisé fourni ici.

Comptage rapide des unités formant des colonies sous forme de plaque à 96 puits appliqué au microbiome de la drosophile

The intestines of animals are colonized by commensal microbes, which impact host development, health, and behavior. Precise quantification of colonization ...

Le comptage des unités formant colonies, ou UFC, est une technique standard en microbiologie, mais elle est lente et nécessite beaucoup de plaques de gélose. Notre technique offre un avantage cent fois supérieur aux méthodes traditionnelles de comptage de l’UFC dans les deux plaques de gélose temporelle. Nous avons appliqué la méthodologie pour mesurer le microbiome intestinal de modèles de petits animaux, en particulier les mouches des fruits.Ce protocole est un moyen simple, rapide et automatisé de quantifier les UFC chez les mouches gnotobiotiques. Ce protocole fournit un flux de travail avec des instruments fabriqués à bricolage pour photographier les UFC et un logiciel personnalisé pour automatiser leur comptage. Ce protocole pourrait être utilisé dans n’importe quelle expérience de microbiologie où des méthodes plus efficaces de placage et de comptage de l’UFC pourraient être utiles.Manipuler efficacement les mouches et repérer les plaques nécessite une dextérité manuelle, cela devrait donc être pratiqué. L’utilisation du logiciel de comptage automatisé nécessite un jugement sur le seuil, de sorte que les reçus doivent être comparés aux comptages manuels pour identifier les meilleurs paramètres pour votre expérience. Pour commencer, versez des perles de verre de 0,5 micron sur le plateau de mesure des perles.Étalez les perles sur le plateau afin que tous les puits soient pleins et nivelés. Ensuite, brossez les perles en excès dans un tube conique. Maintenant, placez une plaque PCR semi-jupe à l’envers sur le plateau de mesure et alignez-la avec les puits en l’insérant dans l’indentation sur le plateau de mesure.Ensuite, retournez-le rapidement pour transférer les perles. Enlevez les billes en excès de la surface de la plaque PCR. Assurez-vous que tous les puits contiennent des perles.Si nécessaire, utilisez une pelle de pesée pour ajouter des perles à un seul puits. Ensuite, couvrez la plaque avec du papier d’aluminium et de l’autoclave. Avant d’utiliser la plaque, ajoutez 100 microlitres de PBS à chaque puits immédiatement avant d’ajouter les mouches à l’aide du pipetter à 96 canaux.Pour stériliser en surface les mouches anesthésiées, transférer les mouches du flacon dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre à l’aide d’un petit entonnoir. Vaporisez immédiatement un millilitre d’éthanol à 70% dans le tube, fermez le tube et mélangez par inversion pendant 10 secondes. Ensuite, aspirez l’éthanol avec une pipette P-1000 tout en évitant d’aspirer les mouches.Après le lavage final du PBS, fermez le tube et tapotez-le fort sur le banc plusieurs fois avec le côté du capuchon vers le bas pour que les mouches pénètrent dans le bouchon. Après avoir ouvert le tube, distribuez les mouches dans les puits à l’aide de forceps et placez une mouche dans chaque puits. Gardez les mouches anesthésiées en gardant la plaque sur de la glace pendant le chargement.Enlevez les billes perdues près des puits, car elles peuvent briser le joint d’aluminium et causer des fuites. Assurez-vous que le côté terne de la feuille d’étanchéité est orienté vers le bas sur la plaque et que le côté brillant est orienté vers le thermosoudant. Appuyez fermement sur le thermoscellant pendant cinq secondes et polissez avec l’applicateur à main pour fixer la feuille.Homogénéiser les mouches pendant cinq minutes. Assurez-vous que les mouches sont complètement homogénéisées et que la solution devient colorée. Pour éliminer le liquide de la feuille d’étanchéité, faites tourner la plaque de perles pendant 30 secondes dans un mini essoreuse à 350 G.Retirez la feuille tout en tenant la plaque pour éviter d’éclabousser des gouttelettes d’homogénat de mouches.Placez trois plaques rectangulaires de croissance de gélose MRS avec leurs couvercles ouverts dans l’enceinte de biosécurité pour sécher pendant au moins 10 minutes. Préparer deux plaques de dilution en ajoutant 100 microlitres de PBS à chaque puits d’une plaque stérile de 96 puits à l’aide d’un pipetter à 96 canaux. Chargez un rack de pointes P-20 sur le pipetter à 96 canaux.Faire une dilution de 1:10 en aspirant 11,1 microlitres d’homogénat de la plaque d’échantillonnage. Maintenant, distribuez-le dans la première plaque de dilution contenant 100 microlitres de PBS stérile par puits. Maintenir la plaque de dilution sur l’agitateur à plaques pendant 10 secondes à 600 tr/min.Mélanger à nouveau en tuyautant de haut en bas au moins 10 fois. Transférer 11,1 microlitres de la première plaque de dilution à la deuxième plaque de dilution et répéter les étapes de mélange pour toute autre dilution. Pour repérer les plaques, chargez deux microlitres de chaque puits dans la pipette à 96 canaux.Abaissez lentement la tête de pipette sur la plaque, en évitant de poignarder dans la gélose et assurez-vous que toutes les taches ont été distribuées. Ensuite, vérifiez que les taches liquides pénètrent rapidement dans la gélose et ne coulent pas ensemble. Répéter le processus de placage pour les plaques de dilution restantes comme décrit dans le manuscrit.Une fois que le liquide a été complètement absorbé dans l’agar-agar, inversez les plaques et incuberez-les jusqu’à ce que les colonies aient atteint la taille optimale. Organisez les assiettes logiquement et conservez-les dans un ordre spécifique lorsque vous photographiez. Orientez-les de sorte que A1 soit dans le coin supérieur gauche pour toutes les plaques.Après avoir retiré le couvercle de la plaque, placez la plaque sur la scène avec A1 orienté dans le coin correct. Imaginez les plaques. Transférez les images sur un ordinateur et renommez-les, y compris le nom de l’expérience, le type de support, le facteur de dilution et d’autres détails pertinents.Organisez les images à traiter pour la quantification dans un dossier. Les noms de fichiers qui distinguent les plaques deviennent des titres de colonne pour chaque ensemble de comptes dans la feuille de calcul de sortie. Créez des sous-dossiers nommés Recadré et Reçus dans le dossier.Ces dossiers recevront les fichiers de sortie. Maintenant, lancez le plugin Croptacular à partir d’ImageJ et cliquez sur OK pour commencer le recadrage. Une boîte de dialogue pour choisir le dossier source apparaîtra.Cliquez sur OK. Sélectionnez le dossier source et cliquez sur Ouvrir. Ensuite, cliquez sur OK dans la boîte de dialogue pour choisir le répertoire de destination. Sélectionnez le dossier de destination et appuyez sur Ouvrir.Si l’image est déjà droite, appuyez simplement sur Espace. Sinon, redressez l’image en traçant une ligne le long d’un bord qui doit devenir horizontal. Redessinez la ligne autant de fois que nécessaire si l’image n’apparaît pas droite.Ensuite, dessinez une zone de délimitation pour la zone de comptage et ajustez sa taille et sa proportion jusqu’à ce que toutes les taches se trouvent dans leurs cellules. Faites glisser le curseur en dehors de la zone de limite pour actualiser la grille. Lorsque la grille semble bonne, appuyez sur Espace.Étant donné que le plugin suppose que toutes les photos sont alignées de manière identique, assurez-vous que l’image suivante pivote automatiquement sous le même angle que la première. Si cela est exact, appuyez sur Espace pour continuer. Sinon, redressez l’image comme avant.La grille rappelle également la même position que l’image précédente. Ajustez si nécessaire et appuyez sur Espace. Lancez Count-On-It et sélectionnez Gridiron.Définissez l’intensité de la colonie de seuil en fonction d’une valeur d’intensité de pixels supérieure et d’une valeur d’intensité de pixels inférieure. Rendez le seuil aussi strict que possible, tout en sélectionnant toutes les colonies. Cliquez sur OK dans la boîte de dialogue Action requise lorsque le seuil est satisfaisant, puis cliquez sur OK pour continuer.Sur la première image, l’option est donnée pour continuer ou revenir au menu de configuration. Pour poursuivre le traitement par lots, cliquez sur OK. Ensuite, sélectionnez un dossier pour conserver le tableau des reçus et des résultats. Utilisez le dossier Reçus créé précédemment.Après la première image, les images suivantes seront par défaut au même seuil que les paramètres précédents. Cliquez sur OK pour utiliser ces paramètres ou ajuster les paramètres. Passez en revue les reçus de comptage produits par le logiciel et corrigez manuellement les erreurs de comptage.Le plugin ImageJ est statistiquement précis, mais des erreurs se produisent. Prouvez les reçus pour examiner les valeurs aberrantes et identifier les erreurs de comptage. Le logiciel enregistre les données CFU sous forme de fichier CSV dans le même dossier que les reçus.Pour les mouches colonisées par Lactobacillus plantarum, il y avait une diminution significative des bactéries pour les mouches qui ont été transférées quotidiennement à des aliments stériles, transférées quotidiennement, gardées sur des aliments stériles quatre heures avant l’analyse, ou transférées quotidiennement et gardées sur gélose stérile quatre heures avant l’analyse par rapport aux mouches qui n’ont jamais été transférées dans des aliments stériles après inoculation. Des résultats similaires ont été observés chez les mouches nourries à Acetobacter indonesiensis, où les mouches transférées, post-transférées et éliminées ont montré une réduction significative des UFC, mais le lavage n’a pas eu d’effet mesurable, suggérant que la réduction des UFC était due à la clairance des bactéries de l’intestin plutôt que de la cuticule. Le nombre d’UFC dans les endroits comptant de 2 à 25 colonies par endroit n’a montré aucune différence par rapport à la méthode traditionnelle.Les taches comptant en moyenne 35 colonies présentaient des UFC inférieures à celles des plaques témoins. Cette réduction pourrait être due au chevauchement des colonies dans des endroits denses. Sur les photos de plaques, l’intensité de la colonie était 300% plus élevée que l’arrière-plan.Les colonies de Lactobacillus plantarum mCherry-positive ont montré une intensité rouge 1 000% plus élevée que les colonies mCherry-négatives. Les colonies d’Acetobacter indonesiensis GFP positives ont montré une intensité verte 200% plus élevée que les colonies GFP négatives. Le plugin Count-On-It pour ImageJ automatise le comptage CFU à partir des photos de plaques.Les colonies sont détectées avec précision, avec des comptages comparables au comptage manuel. Les reçus de comptage peuvent être utilisés pour identifier les erreurs de comptage. La modification des seuils de taille et des longueurs d’onde de fluorescence permet de compter séparément les différentes morphologies des colonies.Il est essentiel de s’assurer que la plaque est bien scellée avant de perler. Il est également important de concevoir des contrôles positifs pour calibrer vos mesures. Nous utilisons également cette technique pour étudier in vitro des populations de bactéries dans des plaques de 96 puits, ce qui nous permet d’étudier des communautés mixtes de bactéries.Cette technique permet des approches de criblage à haut débit pour mesurer la colonisation intestinale ainsi que la variation biologique de la colonisation.

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Source : Dodge, R., et al. Comptage rapide d’unités de formation de colonies sous forme de plaque à 96 puits appliquée au microbiome de la drosophile . J. Vis. Exp. (2023)Cette vidéo démontre la quantification des unités formant des colonies (UFC) de bactéries associées à l’intestin chez les mouches drosophiles à l’aide d’une approche de dilution et de placage en série. Des échantillons de mouches homogénéisés contenant des bactéries intestinales sont dilués en série, placés sur de la gélose et...

Quantification des unités formant des colonies de bactéries associées à l’intestin chez la drosophile

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Découvrez un comptage rapide et automatisé des unités formant des colonies en plaque à 96 puits appliqué au microbiome intestinal de Drosophila. Cette méthode offre un gain de temps centuple par rapport aux techniques traditionnelles.

Comptage rapide des unités formant des colonies sous forme de plaque à 96 puits appliqué au microbiome de la drosophile

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