Name: Préparation, caractéristiques, toxicité et évaluation de l’efficacité du vaccin nasal auto-assemblé contre les tumeurs en nanoémulsion in vitro et in vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Découvrez la préparation d'un vaccin nasal nanoémulsion auto-assemblé pour l'immunothérapie antitumorale. Cette méthode évalue l'efficacité in vitro et in vivo avec une faible toxicité systémique.

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Cette étude a été soutenue par les projets spéciaux n ° 31670938, 32070924, 32000651 du programme de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine, n ° 2014jcyjA0107 et n ° 2019jcyjA-msxmx0159 du programme de projet de la Fondation des sciences naturelles de Chongqing, n ° 2020XBK24 et n ° 2020XBK26 des projets spéciaux de l’Université médicale de l’armée, et n ° 202090031021 et n ° 202090031035 du programme national d’innovation et d’entrepreneuriat pour les étudiants.

Les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux lignes directrices sur les animaux de laboratoire pour l’examen éthique du bien-être animal (GB / T 35892-2018) et ont été approuvées par le Comité du bien-être et de l’éthique des animaux de laboratoire de la troisième Université médicale militaire. Les souris ont été euthanasiées par injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de pentobarbital sodique à 1 %.
1. Préparation de l’I-OVA NE
<ol><li>Mélangez 1 mg de monophosphoryl lipid A (MPLA) avec 100 μL de DMSO, vortex pendant 5 min, et laissez-le reposer pendant 4 h à température ambiante (RT) pour se dissoudre complètement.</li>
	<li>Ajouter Tween 80 et I-OVA quantitativement et mélanger. NOTE: Tween 80 et I-OVA ont été mélangés à un rapport de masse de 25: 119.</li>
	<li>Ajouter le squalène dans le mélange préparé à l’étape 1.2 (7:3, Smix: squalène).</li>
	<li>Ajouter 100 μL de solution de MPLA (10 mg/mL) au mélange préparé à l’étape 1.3.</li>
	<li>Préparer le vaccin à base de nanoémulsion à l’aide de méthodes d’émulsification à faible énergie19: ajouter la solution mélangée aux gouttelettes d’eau à environ 70% du volume total et remuer doucement pour obtenir un mélange transparent et facile à écouler. NOTE: Le contrôle BNE (émulsion blanche) a été préparé par la même méthode, en remplaçant l’eau par I-OVA.</li>
</ol>2. Caractérisation physico-chimique et stabilité
REMARQUE : Évaluer la distribution de la taille des gouttelettes, le potentiel zêta et d’autres données physico-chimiques du vaccin I-OVA NE, en suivant les étapes 2.1 à 2.3; effectuer la caractérisation morphologique du vaccin I-OVA Ne en suivant les étapes 2.4 à 2.7; et examiner la structure 3D du vaccin I-OVA NE en suivant les étapes 2.8 à 2.9.
<ol><li>Mélanger 50 mg de protéines de mucine avec 100 mL d’eau pour injection afin de préparer une solution de mucine à 0,05 %.</li>
	<li>Diluer 4 mg/mL D’I-OVA NE 200 fois avec 0,05 mg/mL de protéine de mucine ou d’eau désionisée.</li>
	<li>Observez la taille des particules, le potentiel zêta, l’indice de polydispersité (PDI) et la mobilité électrophorétique à 25 °C à l’aide d’un nanoanalyseur19.</li>
	<li>Diluer 10 μL d’I-OVA NE 200 fois avec 2 mL d’eau désionisée.</li>
	<li>Placer 5 μL de vaccin I-OVA NE prédilué (étape 2.4) sur une grille de cuivre recouverte de carbone et la recouvrir de 10 μL d’acide phosphotungstique à 1 % pendant 3 minutes.</li>
	<li>Retirez l’excès d’acide phosphotungstique avec du papier filtre.</li>
	<li>Obtenez des images à l’aide de TEM. Placer un échantillon de 10 μL dilué 50 fois sur une grille de carbone cuivre à 100 mailles et le laisser reposer à température ambiante (RT) pendant 5 minutes avant d’ajouter 10 μL d’acide phosphotungstique (1%, pH 7,4). Examiner tous les échantillons par TEM à une tension de 120 kV.</li>
	<li>Caractériser la morphologie moléculaire de l’I-OVA NE à l’aide d’un microscope à force atomique à haute résolution. Obtenir les images couleur d’I-OVA NE dans les conditions suivantes : pour les sondes en tungstène (constante de force : 0,06 N·m-1) ; Plage de balayage: 450 nm x 450 nm; Mode de tapotement: mode d’imagerie; et méthode de balayage: balayage point par point à RT.</li>
</ol>3. Essais de toxicité in vitro et in vivo
REMARQUE : La toxicité in vitro du vaccin I-OVA NE NE a été évaluée qu’aux étapes 3.1 à 3.9, et la toxicité in vivo du vaccin contre les OVA d’électronétiques a été évaluée selon les étapes 3.10 à 3.13.
<ol><li>Raviver les cellules épithéliales humaines BEAS-2B en suivant les étapes 3.1.1-3.1.4 et les cultiver dans un milieu de croissance complet à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 . NOTE: Pour préparer le milieu de croissance complet, ajouter du sérum fœtal bovin (FBS) et de la pénicilline/streptomycine au milieu RPMI-1640 à des concentrations finales de 10% et 1%, respectivement.<ol><li>Allumez le bain-marie et réglez la température à 37 °C. Retirer les flacons cellulaires congelés dans de l’azote liquide et décongeler rapidement au bain-marie à 37 °C.</li>
		<li>Après décongélation, pipeter rapidement les cellules dans un tube à centrifuger stérile de 15 mL, ajouter 2 mL du milieu de croissance complet et centrifuger à 129 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Retirer le surnageant, ajouter 2 mL du milieu de croissance complet pour remettre les cellules en suspension et centrifuger à 129 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Retirer le surnageant, ajouter 6 mL de milieu de croissance complet pour remettre les cellules en suspension et transférer les cellules dans une fiole de culture T25 pour mettre les cellules en culture à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 .</li>
	</ol></li>
	<li>Lorsque la densité cellulaire atteint 80% à 90%, jetez le milieu de culture et lavez les cellules deux fois avec 2 ml de PBS. Ajouter 1 mL de trypsine à 0,25% pour digérer les cellules pendant 1-2 min. Lorsque l’arrondi des cellules est observé, ajouter immédiatement 4 mL du milieu de croissance complet pour neutraliser la trypsine.</li>
	<li>Mélanger et aspirer les échantillons dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml et centrifuger à 129 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu complet RPMI-1640. Utilisez 20 μL pour le comptage cellulaire et diluez les cellules à 1 x 105 cellules/mL.</li>
	<li>Plaquer les cellules BEAS-2B à une densité de 1 x 104 cellules/puits dans des plaques de 96 puits dans 100 μL de milieu complet RPMI-1640 et préincuber les plaques pendant 24 h à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 .</li>
	<li>Jeter le surnageant et ajouter 100 μL d’I-OVA NE, 100 μL d’I-OVA+BNE (physiquement mélangé) et 100 μL d’I-OVA prédilué avec un milieu de croissance complet à diverses concentrations finales (0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 4 mg/mL, 8 mg/mL), avec BNE comme témoin. Incuber pendant 24 h à 37 °C. REMARQUE : Ajouter 100 μL de milieu de croissance complet aux groupes témoins négatifs et 100 μL de suspension cellulaire (1 x 105/mL) aux groupes témoins positifs.</li>
	<li>Retirer le milieu et ajouter 90 μL de milieu de croissance complet et 10 μL de solution CCK-8 à chaque puits de la plaque.</li>
	<li>Incuber la plaque pendant 2 h à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 .</li>
	<li>Mesurer l’absorbance de chaque puits à 450 nm à l’aide d’un lecteur de plaques marqué par des enzymes.</li>
	<li>Calculer le rapport de survie des cellules BEAS-2B comme indiqué dans l’équation suivante : (Échantillon OD450 − témoin négatif OD450/témoin positif OD450− témoin négatif OD450) × 100 %</li>
	<li>Divisez au hasard les souris C57BL/6 âgées de 6 semaines en cinq groupes (n = 5 dans chaque groupe) et anesthésiez-les avec de l’isoflurane à 4 % pour l’induction. Maintenir l’anesthésie avec 2% d’isoflurane. Utilisez une pommade au sulfate de néomycine sur les yeux des souris pour prévenir la sécheresse.</li>
	<li>Utilisez des embouts de pipette de 10 μL pour effectuer l’immunisation nasale des souris avec 10 μL/narine d’I-OVA, I-OVA+BNE et IOVA NE à 4 mg/mL pendant les 3 jours. Utiliser le BNE et le PBS comme témoins expérimentaux. REMARQUE: Fournir un soutien thermique jusqu’à ce que l’animal se rétablisse de l’anesthésie.</li>
	<li>Euthanasier toutes les souris par injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de pentobarbital sodique à 1 % au jour 4.</li>
	<li>Couper des échantillons de tissus nasaux d’environ 3 mm d’épaisseur avec des ciseaux et retirer les tissus pulmonaires.</li>
	<li>Fixer les tissus nasaux et les tissus pulmonaires entiers dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 24 h. Déshydrater les tissus à l’aide d’un gradient d’alcool et de xylène en série, puis les incorporer dans de la paraffine. Trancher les blocs de cire finis sur une trancheuse à paraffine d’une épaisseur de 4 μm.</li>
	<li>Colorer les sections avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E). Ensuite, observez la toxicité des muqueuses, y compris l’hyperémie, l’œdème, l’infiltration de neutrophiles et les dommages structurels dans la muqueuse nasale et le tissu pulmonaire, au microscope (100x et 200x)7.</li>
</ol>4. Absorption cellulaire in vitro
<ol><li>Plaquer des cellules BEAS-2B à une densité de 5 x 10 5 cellules/puits dans des plaques de 12 puits avec des lames de recouvrement dans 2 mL du milieu de croissance complet et préincuber les plaques pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur à5 % de CO2 .</li>
	<li>Ajouter 100 μL d’I-OVA NE marqué FITC (pureté : 98,3 %, produit par la société, 4 mg/mL) ou I-OVA (4 mg/mL) à 900 μL de suspension cellulaire et placer à 37 °C pendant 90 min. REMARQUE : Préparez l’I-OVA NE étiqueté FITC comme décrit à l’étape 4.1. Ajouter 1 mL de milieu de croissance complet aux groupes témoins.</li>
	<li>Laver trois fois avec 0,1 M de PBS (1 mL/puits) pendant 30 min à 37 °C après le traitement.</li>
	<li>Fixez ces échantillons avec 4% de paraformaldéhyde pendant 20 minutes dans l’obscurité. Après fixation, retirer le paraformaldéhyde et laver 3 fois avec 0,1 M PBS (1 mL/puits) pendant 30 min à 37 °C.</li>
	<li>Préincuber les échantillons avec du DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole) à une concentration finale de 10 μg/mL pendant 10 min dans l’obscurité, puis laver 5 fois avec 0,1 M PBS (1 mL/puits) pendant 30 min à 37 °C après le traitement.</li>
	<li>Obtenez l’absorption cellulaire par CLSM avec les paramètres suivants : Taille de l’image : 512 px x 512 px, Vitesse de numérisation : 8 ; Pas de ligne: 1; Moyenne : 2.</li>
</ol>5. Dissémination in vivo
<ol><li>Anesthésier les souris nues avec 4% de gaz isoflurane et maintenir l’anesthésie à 2% d’isoflurane. Immuniser les souris nues par voie intranasale avec 10 μL d’I-OVA marqué PE à 4 mg/mL ou d’I-OVA marqué PE à 4 mg/mL dans chaque narine.</li>
	<li>À 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3, 6 h, 9 h, 12 h et 24 h, capturer toutes les souris sous anesthésie par le système IVIS.</li>
	<li>Effectuez un balayage de l’arrière-plan immédiatement avant l’administration intranasale pour fournir une valeur seuil (Min = 1,06 x 106) pour ajuster les images recueillies à tous les points temporels.</li>
	<li>Cliquez sur le logiciel Living Image pour lancer la séquence et cliquez sur Initialiser pour initialiser le système IVIS</li>
	<li>Lorsqu’il est initialisé, le voyant d’état de température dans le panneau de contrôle d’acquisition IVIS est rouge. Lorsque le voyant d’état de température passe au vert, l’imagerie peut être effectuée.</li>
	<li>Cliquez sur Assistant Création d’image , puis choisissez Fluorescence dans la boîte de dialogue qui s’affiche.</li>
	<li>Ajustez les paramètres suivants : Temps d’exposition : auto sec, Binning : 8, F/Stop : 2, Champ de vision : D.</li>
	<li>Sélectionnez le filtre d’excitation 620 nm et le filtre d’émission 670 nm. Cliquez sur Acquérir la séquence pour acquérir l’image.</li>
	<li>Traitez les images en direct de toutes les souris et les données de radiance avec le logiciel Living Image.<ol><li>Après avoir acquis l’image, cliquez sur Outils de retour sur investissement dans la palette d’outils, sélectionnez Cercle et créez un cercle de retour sur investissement.</li>
		<li>Cliquez sur Mesurer les ROI pour obtenir une valeur quantitative pour la zone de ROI.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Efficacité antitumorale in vivo
<ol><li>Rafraîchir et cultiver les cellules E.G7-OVA du lymphome de souris à partir de EL4 avec un milieu de croissance complet en suivant les étapes 2.1.1-2.1.4. NOTE: Pour préparer le milieu de croissance complet de la cellule E.G7-OVA, mélanger le milieu RPMI 1640 avec 2 mM de L-glutamine ajusté pour contenir 1,5 g / L de bicarbonate de sodium, 4,5 g / L de glucose, 10 mM HEPES et 1,0 mM de pyruvate de sodium et complété par 0,05 mM de 2-mercaptoéthanol et 0,4 mg / mL G418, 90%, et du sérum bovin fœtal, 10%.</li>
	<li>Sous-culture des cellules dans un rapport de 1:2 lorsque les cellules atteignent une densité comprise entre 1 x 106 cellules/mL et 1 x 107 cellules/mL.</li>
	<li>Évaluer l’effet protecteur préventif sur les souris tel que décrit aux étapes 6.3.1-6.3.4..<ol><li>Divisez au hasard les souris C57BL/6 âgées de 6 semaines en cinq groupes (n = 8 dans chaque groupe). Anesthésier les souris nues avec 4% de gaz isoflurane et maintenir l’anesthésie avec 2% d’isoflurane. Rasez partiellement les poils du dos et la pommade au sulfate de néomycine sur les yeux des souris pour éviter la sécheresse.</li>
		<li>Immuniser par voie intranasale les souris avec 10 μL de 1 mg/ml d’i-ova, de BNE+I-OVA ou d’I-OVA NE dans chaque narine, de BNE (dilué quatre fois avec du PBS) ou un témoin PBS 3 fois avec un intervalle de 7 jours entre chaque immunisation.</li>
		<li>Inoculer hypodermiquement toutes les souris dans le dos droit avec 5 x 105 cellules E. G7-OVA le 7ème jour après la vaccination finale.</li>
		<li>À 0, 6, 9, 12, 15 et 18 jours après l’immunisation finale, surveiller les volumes tumoraux en mesurant deux axes de la tumeur à l’aide d’étriers numériques et enregistrer la survie des souris à 30 jours (après l’immunisation finale).</li>
	</ol></li>
	<li>Évaluer l’effet protecteur thérapeutique sur les souris après inoculation de cellules E.G7-OVA comme décrit aux étapes 6.4.1-6.4.3. Pour le regroupement et la manipulation des souris, voir l’étape 6.3.1.<ol><li>Au jour 0, injecter les souris C57BL/6 par voie sous-cutanée dans le dos droit avec des cellules E.G7-OVA (5 x 105 cellules/souris).</li>
		<li>À 0, 7 et 14 jours après l’injection, immuniser toutes les souris immunisées par voie intranasale avec 10 μL d’I-OVA, de BNE + I-OVA, d’I-OVA NE (tous à des concentrations de 1 mg/mL), de BNE ou de PBS trois fois dans chaque narine.</li>
		<li>À 0, 6, 9, 12, 15 et 18 jours après l’injection, surveillez le volume tumoral et enregistrez la survie à 30 jours des souris. REMARQUE: Si le volume de la tumeur dépasse 3 000 mm3, les souris doivent être euthanasiées pour des raisons humaines, et ces souris seront considérées comme mortes dans la courbe de survie. Le volume tumoral est calculé par une formule ellipsoïdale modifiée comme indiqué dans l’équation suivante: Volume = π/6 x L xP 2 où L représente la longueur de la tumeur et W représente la largeur de la tumeur (unité de longueur: mm, unité de volume: mm3).</li>
	</ol></li>
</ol>7. Analyse statistique
<ol><li>Analysez les différences de données entre les différents groupes à l’aide d’un logiciel statistique approprié avec ANOVA unidirectionnelle, comparaisons multiples de Tukey ou test t de Student. Utilisez la méthode de Kaplan-Meier pour estimer les résultats de survie et comparer les groupes avec les statistiques de log-rank. Exprimez tous les résultats sous forme de moyenne ± écart-type. La signification des valeurs P < 0,05, P < 0,01 et P < 0,001 est représentée à l’aide de *, **, et ***, respectivement, sur les graphiques.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents connus ou de relations personnelles qui auraient pu sembler influencer le travail rapporté dans cet article.

Les nanovaccins fonctionnalisés avec des membranes immunocytaires présentent de grands avantages dans la thérapie ciblée sur la maladie, et les effets secondaires sont minimisés par des propriétés telles que le tropisme tumoral unique, l’identification de cibles spécifiques, une circulation prolongée, des interactions intercellulaires améliorées et une faible toxicité systémique. Ils peuvent également être facilement intégrés à d’autres modules de traitement pour traiter les cancers en coopération16,20<...

En tant que l’une des innovations les plus critiques en matière de santé publique, les vaccins jouent un rôle clé dans la lutte contre le fardeau mondial des maladies humaines1. Par exemple, à l’heure actuelle, plus de 120 vaccins candidats contre les maladies COVID-19 sont testés, dont certains ont été approuvés dans de nombreux pays2. Des rapports récents indiquent que les vaccins anticancéreux ont effectivement amélioré les progrès des traitements cliniques contre le cancer parce qu’ils dirigent le système immunitaire des patients cancéreux à reconnaître les antigènes comme étrangers au corps3. De plus, plusieurs épitopes de lymphocytes T situés à l’intérieur ou à l’extérieur des cellules tumorales peuvent être utilisés pour concevoir des vaccins peptidiques, qui ont montré des avantages dans le traitement des cancers métastatiques en raison de l’absence de toxicité significative associée à la radiothérapie et à la chimiothérapie 4,5. Depuis le milieu des années 1990, les essais précliniques et cliniques pour le traitement des tumeurs ont été menés principalement à l’aide de vaccins peptidiques antigéniques, mais peu de vaccins présentent un effet thérapeutique adéquat sur les patients cancéreux6. En outre, les vaccins anticancéreux avec des épitopes peptidiques ont une faible immunogénicité et une efficacité d’administration insuffisante, ce qui peut être dû à la dégradation rapide des peptides extracellulaires qui diffusent rapidement à partir du site d’administration, ce qui conduit à une absorption insuffisante de l’antigène par les cellules immunitaires7. Par conséquent, il est nécessaire de surmonter ces obstacles avec la technologie d’administration des vaccins.
OVA 257-264, l’épitope257-264 liant le CMH de classe I exprimé en protéine de fusion, est un épitopemodèle 8 fréquemment utilisé. En outre, OVA257-264 est crucial pour la réponse immunitaire adaptative contre les tumeurs, qui dépend de la réponse cytotoxique des lymphocytes T (CTL). Il est médié par des cellules T CD8+ spécifiques de l’antigène dans la tumeur, qui sont induites par le peptide OVA257-264 . Elle se caractérise par une insuffisance de granzyme B, qui est libérée par les lymphocytes T cytotoxiques, conduisant à l’apoptose des cellules cibles8. Cependant, l’administration libre du peptide OVA257-264 peut induire peu d’activité CTL parce que l’absorption de ces antigènes se produit dans des cellules non spécifiques plutôt que dans des cellules présentatrices d’antigènes (APC). L’insuffisance d’une stimulation immunitaire appropriée entraîne une activité CTL5. Par conséquent, l’induction d’une activité CTL efficace exige des progrès considérables.
En raison de la barrière fournie par les cellules épithéliales et de la sécrétion continue de mucus, les antigènes vaccinaux sont rapidement éliminés de la muqueuse nasale 9,10. La mise au point d’un vecteur vaccinal efficace capable de traverser le tissu muqueux est cruciale car les cellules présentatrices de l’antigène sont situées sous l’épithélium9 de la muqueuse. L’injection intranasale de vaccins induit théoriquement une immunité muqueuse pour lutter contre l’infection des muqueuses11. En outre, l’administration nasale est une méthode d’administration efficace et sûre pour les vaccins en raison de sa commodité, de l’évitement de l’administration intestinale et de l’amélioration de l’observance du patient7. Par conséquent, l’administration nasale est un bon moyen d’administration pour le nouveau nanovaccin à épitopes peptidiques.
Plusieurs biomatériaux synthétiques ont été conçus pour combiner les épitopes des interactions cellule-tissu et cellule-cellule. Certaines protéines bioactives, comme l’Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), ont été introduites dans le cadre de la structure de l’hydrogel pour conférer une bioactivité12. Ce peptide contribue probablement à l’attachement, à la migration et à la croissancedes cellules 13 et se lie aux intégrines α 3β1 et α6β1 pour interagir avec différents types de cellules cancéreuses. IKVAV est un peptide d’adhésion cellulaire dérivé de la protéine de membrane basale de laminine αchaîne 1 qui était à l’origine utilisé pour modéliser le microenvironnement neuronal et provoquer la différenciation neuronale14. Par conséquent, il est important de trouver un véhicule d’administration efficace pour ce nouveau vaccin pour lutter contre la maladie.
Des systèmes d’émulsion récemment signalés, tels que W805EC et MF59, ont également été composés pour l’administration dans les cavités nasales d’un vaccin antigrippal inactivé ou d’antigène de surface recombinant de l’hépatite B et illustrés pour déclencher à la fois l’immunité muqueuse et systémique15. Les nanoémulsions (NE) présentent les avantages d’une administration facile et d’une coformation pratique avec des adjuvants efficaces par rapport aux systèmes d’administration de particulesmuqueuses 16. Il a été rapporté que les vaccins à nanoémulsion modifient le phénotype allergique d’une manière durable, différente de la désensibilisation traditionnelle, ce qui entraîne des effets suppressifs à long terme17. D’autres ont rapporté que les nanoémulsions combinées à des antigènes immunodominants spécifiques du Mtb pourraient induire de puissantes réponses des cellules muqueuses et conférer une protection significative18. Par conséquent, un nouveau nanovaccin intranasal auto-assemblé avec le peptide synthétique IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, le peptide constitué d’IKVAV lié à OVA257-264) a été conçu. Il est important d’évaluer systématiquement ce nouveau nanovaccin.
L’objectif de ce protocole est d’évaluer systématiquement les caractéristiques physico-chimiques, la toxicité et la stabilité du nanovaccin, de détecter si l’absorption d’antigènes et les effets protecteurs et thérapeutiques sont renforcés à l’aide de moyens techniques, et de préciser les principaux contenus expérimentaux. Dans cette étude, nous avons établi une série de protocoles pour étudier les caractéristiques physico-chimiques et la stabilité, déterminer l’ampleur de la toxicité de l’I-OVA NE en cellules BEAS-2B par CCK-8 et observer la capacité de présentation de l’antigène des cellules BEAS-2B au vaccin à l’aide de la microscopie confocale, évaluer les profils de libération de ce nouveau nanovaccin in vivo et in vitro, et détecter l’effet protecteur et thérapeutique de ce vaccin en utilisant un modèle murin porteur de tumeur E.G7-OVA.

<table><tbody><tr><td>Plaques à 96 puits</td><td>Corning Incorporated, États-Unis</td><td>CLS3922</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques Bio-Rad 6.0</td><td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, États-Unis</td><td>. Kits Bio-Rad 6.0</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8</td><td>Dojindo, Japon</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5810 R</td><td>Eppendorf, Allemagne&nbsp ;</td><td></td><td></td>5811000398</tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Hyclone (Life Technology, États-Unis)</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>I-OVA</td><td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>HF 90/240 Incubateur</td><td>Heal Force, Suisse</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>HPLC&nbsp ;</td><td>Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.</td><td>E2695</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Nikon, Japon</td><td>DSZ5000X</td><td></td></tr><tr><td>IPC-208</td><td>Université Chong Qing, Chine</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Système IVIS&nbsp ;</td><td>Caliper Life Science Limited Company</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>JEM-1230 TEM</td><td>JEOL Limited Company of Japan</td><td>1230 TEM</td><td></td></tr><tr><td>Malvern NANO ZS</td><td>Malvern Instruments Ltd., Royaume-Uni</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MPLA</td><td>&nbsp ; Invivogen Lit. Co.</td><td>tlrl-mpla</td><td></td></tr><tr><td>Onguent au sulfate de néomycine</td><td>Shanghai CP General Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td></td><td></td>H31022262</tr><tr><td>OVA257&ndash ; 264</td><td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>RPMI 1640 moyen</td><td>Hyclone (Life Technology, États-Unis)</td><td>SH30809.01</td><td></td></tr><tr><td>Conjugaison peptidique synthétique (I-OVA) d’IKVAV-PA</td><td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>Zeiss LSM800 microscope confocal à fluorescence à balayage laser</td><td>Zeiss, Allemagne</td><td>Zeiss LSM800</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation, caractéristiques, toxicité et évaluation de l’efficacité du vaccin nasal auto-assemblé contre les tumeurs en nanoémulsion in vitro et in vivo

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Les peptides d’épitopes ont attiré l’attention dans le domaine des vaccins contre les tumeurs en raison de leur sécurité, de leur haute spécificité et de leur production pratique; en particulier, certains épitopes restreints par le CMH I peuvent induire une activité cytotoxique efficace des lymphocytes T pour éliminer les cellules tumorales. De plus, l’administration nasale est une technique d’administration efficace et sûre pour les vaccins contre les tumeurs en raison de sa commodité et de l’amélioration de l’observance du patient. Cependant, les peptides épitopiques ne conviennent pas à l’administration nasale en raison de leur faible immunogénicité et de leur manque d’efficacité d’administration. Les nanoémulsions (NE) sont des systèmes thermodynamiquement stables qui peuvent être chargés d’antigènes et livrés directement à la surface de la muqueuse nasale. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) est le pentapeptide de base de la laminine, un peptide liant l’intégrine exprimé par les cellules épithéliales respiratoires humaines. Dans cette étude, un vaccin tumoral intranasal auto-assemblé à peptide NE contenant le peptide synthétique IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) a été préparé par une méthode d’émulsification à basse énergie. La combinaison d’IKVAV et d’OVA257-264 peut améliorer l’absorption de l’antigène par les cellules épithéliales de la muqueuse nasale. Ici, nous établissons un protocole pour étudier les caractéristiques physico-chimiques par microscopie électronique à transmission (MET), microscopie à force atomique (AFM) et diffusion dynamique de la lumière (DLS); stabilité en présence de protéine mucine; toxicité en examinant la viabilité cellulaire des cellules BEAS-2B et des tissus nasaux et pulmonaires des souris C57BL/6; absorption cellulaire par microscopie confocale à balayage laser (CLSM); profils de libération par imagerie de petits animaux in vivo; et l’effet protecteur et thérapeutique du vaccin en utilisant un modèle porteur de tumeur E.G7. Nous prévoyons que le protocole fournira des indices techniques et théoriques pour le développement futur de nouveaux vaccins muqueux peptidiques à épitopes de lymphocytes T.

Conformément au protocole, nous avons terminé la préparation et l’évaluation expérimentale in vitro et in vivo de l’administration du nanovaccin nasal contre la tumeur. La MET, l’AFM et le DLS sont des moyens efficaces pour évaluer les caractéristiques de base du potentiel zêta de surface et la taille des particules du nanovaccin (Figure 1). Les cellules épithéliales BEAS-2B sont un modèle de dépistage utile pour les essais de toxicité in vitro des vaccins nasaux (...

Ici, nous présentons des méthodes détaillées pour la préparation et l’évaluation du vaccin tumoral nanoémulsion nasale auto-assemblé in vitro et in vivo.

Préparation, caractéristiques, toxicité et évaluation de l’efficacité du vaccin nasal auto-assemblé contre les tumeurs en nanoémulsion in vitro et in vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; ...

Un nouveau vaccin à nanoémulsion présente de grands avantages dans la thérapie tactique de la maladie. Ces effets sont minimisés par des propriétés telles que le chopisme tumoral unique, l’identification de tactiques spécifiques et la faible toxicité systémique. Nous prévoyons que le protocole fournira des indices techniques et théoriques pour le développement futur de nouveaux vaccins muqueux peptidiques à base d’ectype de lymphocytes T.Commencez par mélanger un milligramme de monophosphorol lipide A avec 100 microlitres de DMSO. Vortex pendant cinq minutes et laissez-le se dissoudre pendant quatre heures à température ambiante. Ajouter quantitativement TWEEN 80 et I-OVA.Mélanger les composants et ajouter le squalène. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de MPLA au mélange préparé. Pour préparer le vaccin nano-émulsion, ajouter la solution mélangée aux gouttelettes d’eau à environ 70% du volume total et remuer doucement pour obtenir un mélange transparent et facile à écouler.Pour les tests in vitro, commencez par faire revivre les cellules épithéliales BEAS2B. Allumez le bain-marie et réglez la température à 37 degrés Celsius. Décongeler rapidement les flacons cellulaires congelés au bain-marie, tempéré à 37 degrés Celsius.Après décongélation, pipeter rapidement les cellules dans un tube centrifuge stérile de 15 millilitres et ajouter deux millilitres du milieu de croissance complet. Centrifuger le tube à 129 G pendant cinq minutes. Retirer le supinatant et remettre les cellules en suspension dans deux millilitres du milieu de croissance complet.Après avoir centrifugé à nouveau les cellules, retirez le supinatant et ajoutez six millilitres de milieu de croissance complet pour remettre les cellules en suspension. Ensuite, transférer les cellules dans un flacon de culture T25 et incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone. Une fois que la densité cellulaire atteint 80% à 90%, jetez le milieu de culture et lavez les cellules deux fois avec deux millilitres de PBS.Ajouter un millilitre de 0,25% de tripsine pour digérer les cellules pendant une à deux minutes. Lorsque l’arrondi des cellules est observé, ajoutez immédiatement quatre millilitres du milieu de croissance complet pour neutraliser la trypsine. Mélanger et aspirer les échantillons dans un tube centrifuge stérile de 15 millilitres.Centrifuger les échantillons à 129 G pendant cinq minutes. Retirer le supinatant et remettre les cellules en suspension dans un millilitre de milieu complet RPMI 1640. Utilisez 20 microlitres de la suspension cellulaire pour le comptage des cellules et diluez les cellules à une fois 10 à la cinquième cellule par millilitre.Ensuite, plaquez les cellules BEAS2B à une densité d’une fois 10 à la quatrième cellule par puits dans 96 plaques de puits dans 100 microlitres de milieu complet RPMI 1640, et pré-incuber les plaques pendant 24 heures comme démontré précédemment. À la fin de l’incubation, jeter le supinatant et ajouter 100 microlitres de RPMI 1640 à chaque puits de la plaque de 96 puits. Ajouter 100 microlitres chacun de nano-émulsion I-OVA, I-OVA mélangé avec BNE et I-OVA pré-dilué avec un milieu de croissance complet à diverses concentrations finales avec BNE comme témoin et incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius.Une fois l’incubation terminée, retirez le milieu et transférez la plaque dans un endroit sombre. Ajouter 90 microlitres de milieu de croissance complet et 10 microlitres de solution CCK8 à chaque puits de la plaque. Incuber la plaque pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Mesurez l’absorbance de chaque puits à 450 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques marqué par une enzyme. Utilisez des pointes de pipette de 10 microlitres pour effectuer l’immunisation nasale des souris avec I-OVA, I-OVA plus BNE et I-OVA NE pendant trois jours. Utiliser le BNE et le PBA comme témoins expérimentaux.Ensuite, coupez des échantillons de tissus nasaux d’environ trois millimètres d’épaisseur avec des ciseaux et placez-les dans du paraformaldéhyde à 4%. Retirez les tissus pulmonaires et fixez les tissus nasaux et pulmonaires entiers dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 24 heures. La MET et l’AFM sont utilisées pour évaluer les caractéristiques de base du potentiel zêta de surface et la taille des particules du nanovaccin.La taille des particules, les indices de polydispersité, les potentiels zêta et la mobilité d’électrophorèse de l’I-OVA NE dans les analyses de stabilité de la musine sont présentés. La viabilité relative des cellules BEAS2B est supérieure à 80% dans des cultures exposées à différentes concentrations peptidiques d’I-OVA, BNE+I-OVA et I-OVA pendant 24 heures. Le groupe I-OVA EN n’avait pas de toxicité muqueuse évidente, de lésions tissulaires, de saignements ou d’infiltration de cellules inflammatoires.Les cellules épithéliales BEAS2B ont capturé plus d’I-OVA NE marqué FITC que celle de sa solution aqueuse. L’effet à libération prolongée de l’I-OVA NE in vitro a été analysé à l’aide du système IV-IS. Le vaccin I-OVA NE a eu un effet de libération soutenue par rapport à la solution aqueuse d’I-OVA.Dans le groupe I-OVA NE, le pourcentage de temps de survie est plus élevé par rapport aux autres groupes, et le volume tumoral était significativement plus petit, ce qui suggère qu’il a un meilleur effet de protection préventive que les autres groupes. Dans le modèle thérapeutique, le temps de survie médian était significativement différent entre les différents groupes. Le volume tumoral du groupe I-OVA NE était significativement plus petit que celui du groupe I-OVA.Remuer le mélange uniformément est important dans cette procédure. Sinon, cela réduira l’efficacité des nanovaccins.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo démontre la production de vaccins antitumoraux à base de nanoémulsion. Les dépôts de réservoirs de pétrole stables transportant des peptides synthétiques et des adjuvants sont produits par nanoémulsion à faible énergie, offrant un potentiel significatif pour l’immunothérapie tumorale.

PRÉPARATION D’UN VACCIN ADJUVANT À BASE DE NANOÉMULSION

Nous décrivons des techniques basées sur l’imagerie de l’animal entier et la cytométrie en flux pour surveiller l’expansion des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène en réponse à l’immunisation par des nanoparticules dans un modèle murin de vaccination.

Imagerie animal entier et cytométrie de flux techniques pour T CD8 + Analyse des réponses spécifiques de l&#39;antigène de cellule après nanoparticules vaccination

La mauvaise compréhension des performances in vivo des nanomédicaments entrave leur traduction clinique. Les procédures d’évaluation du comportement in vivo des nanomédicaments anticancéreux aux niveaux systémique, tissulaire, unicellulaire et subcellulaire chez des souris immunocompétentes porteuses de tumeurs sont décrites ici. Cette approche pourrait aider les chercheurs à identifier des nanomédicaments anticancéreux prometteurs pour l’application clinique.

Une procédure exhaustive pour évaluer la<em&gt; In Vivo</em&gt; Performance du Cancer nanomédicaments

Les procédures expérimentales pour l’extraction ultérieure des tissus lymphatiques pour tester l’activation des cellules dendritiques lymphoïdes sont décrites après traitement d’un nanomatériau immunostimulante.

Immunostimulantes Agent Evaluation : Lymphoïde tissu Extraction et Injection Route-dépendante des cellules dendritiques Activation

Ce protocole décrit un flux de travail détaillé pour la génération et ex vivo de caractérisation des virus oncolytiques pour l’expression des immunomodulateurs, en utilisant le codage bispécifiques lymphocytes T recruteurs comme un exemple de virus de la rougeole. Application et l’adaptation à d’autres plates-formes de vecteur et les transgènes vont accélérer le développement de nouveaux immunovirotherapeutics pour la traduction clinique.

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Evaluation de l’activité antitumorale in vivo des nanoparticules de polyanhydride IL-1α

Ce manuscrit décrit comment évaluer l’immunogénicité in vivo des vésicules extracellulaires dérivées de cellules tumorales (VE) à l’aide de la cytométrie en flux. Les VE dérivés de tumeurs subissant une mort cellulaire immunogène induite par le traitement semblent particulièrement pertinents dans l’immunosurveillance tumorale. Ce protocole illustre l’évaluation des VE des tumeurs immunostimulantes induites par l’oxaliplatine, mais peut être adapté à divers contextes.

In vivo Dépistage de l’immunogénicité des vésicules extracellulaires dérivées de tumeurs par cytométrie en flux de lymphocytes T spléniques

Ici, un protocole simple est présenté pour produire des nanoparticules d’ARNm à base de polymères poly(bêta aminoesster), faciles à adapter en changeant l’ARNm encapsulé. Le flux de travail de synthèse des polymères, des nanoparticules et de leur caractérisation essentielle in vitro est également décrit. Une preuve de concept concernant la vaccination est également ajoutée.

Synthèse et caractérisation de nanoparticules poly(bêta-aminoesters) chargées d’ARNm à des fins de vaccination

Le protocole présente des méthodes détaillées pour évaluer si l’adjuvant de nanoémulsion ophiopogonine D favorise des réponses immunitaires cellulaires efficaces.

In vitro Évaluation de l’activité cellulaire de l’adjuvant du vaccin à nanoémulsion ophiopogonine D

Le présent protocole prépare et évalue les propriétés physiques, la réponse immunitaire et l’effet protecteur in vivo d’un nouveau vaccin adjuvant à base de nanoémulsion.

Évaluation de la réponse immunitaire d’un vaccin adjuvant à base de nanoémulsion contre l’infection à Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM)

Dans ce protocole, nous avons développé un acide rétinoïque (AR) encapsulé dans une nanoémulsion cationique à utiliser comme adjuvant pour favoriser les réponses systémiques et muqueuses spécifiques de l’antigène. En ajoutant l’AR approuvé par la FDA à la nanoémulsion, la sIgA spécifique de l’antigène a été promue dans le vagin et l’intestin grêle après l’injection intramusculaire de la nanoémulsion.

Acide rétinoïque encapsulé dans une nanoémulsion cationique en tant qu’adjuvant pour favoriser les réponses systémiques et muqueuses spécifiques de l’OVA

Découvrez la préparation d'un vaccin nasal nanoémulsion auto-assemblé pour l'immunothérapie antitumorale. Cette méthode évalue l'efficacité in vitro et in vivo avec une faible toxicité systémique.

Préparation, caractéristiques, toxicité et évaluation de l’efficacité du vaccin nasal auto-assemblé contre les tumeurs en nanoémulsion in vitro et in vivo (Vidéo) | JoVE Journal

Préparation, caractéristiques, toxicité et évaluation de l’efficacité du vaccin nasal auto-assemblé contre les tumeurs en nanoémulsion in vitro et in vivo

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