Préparation, caractéristiques, toxicité et évaluation de l’efficacité du vaccin nasal auto-assemblé contre les tumeurs en nanoémulsion in vitro et in vivo

Un nouveau vaccin à nanoémulsion présente de grands avantages dans la thérapie tactique de la maladie. Ces effets sont minimisés par des propriétés telles que le chopisme tumoral unique, l’identification de tactiques spécifiques et la faible toxicité systémique. Nous prévoyons que le protocole fournira des indices techniques et théoriques pour le développement futur de nouveaux vaccins muqueux peptidiques à base d’ectype de lymphocytes T.

Commencez par mélanger un milligramme de monophosphorol lipide A avec 100 microlitres de DMSO. Vortex pendant cinq minutes et laissez-le se dissoudre pendant quatre heures à température ambiante. Ajouter quantitativement TWEEN 80 et I-OVA.

Mélanger les composants et ajouter le squalène. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de MPLA au mélange préparé. Pour préparer le vaccin nano-émulsion, ajouter la solution mélangée aux gouttelettes d’eau à environ 70% du volume total et remuer doucement pour obtenir un mélange transparent et facile à écouler.

Pour les tests in vitro, commencez par faire revivre les cellules épithéliales BEAS2B. Allumez le bain-marie et réglez la température à 37 degrés Celsius. Décongeler rapidement les flacons cellulaires congelés au bain-marie, tempéré à 37 degrés Celsius.

Après décongélation, pipeter rapidement les cellules dans un tube centrifuge stérile de 15 millilitres et ajouter deux millilitres du milieu de croissance complet. Centrifuger le tube à 129 G pendant cinq minutes. Retirer le supinatant et remettre les cellules en suspension dans deux millilitres du milieu de croissance complet.

Après avoir centrifugé à nouveau les cellules, retirez le supinatant et ajoutez six millilitres de milieu de croissance complet pour remettre les cellules en suspension. Ensuite, transférer les cellules dans un flacon de culture T25 et incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone. Une fois que la densité cellulaire atteint 80% à 90%, jetez le milieu de culture et lavez les cellules deux fois avec deux millilitres de PBS.

Ajouter un millilitre de 0,25% de tripsine pour digérer les cellules pendant une à deux minutes. Lorsque l’arrondi des cellules est observé, ajoutez immédiatement quatre millilitres du milieu de croissance complet pour neutraliser la trypsine. Mélanger et aspirer les échantillons dans un tube centrifuge stérile de 15 millilitres.

Centrifuger les échantillons à 129 G pendant cinq minutes. Retirer le supinatant et remettre les cellules en suspension dans un millilitre de milieu complet RPMI 1640. Utilisez 20 microlitres de la suspension cellulaire pour le comptage des cellules et diluez les cellules à une fois 10 à la cinquième cellule par millilitre.

Ensuite, plaquez les cellules BEAS2B à une densité d’une fois 10 à la quatrième cellule par puits dans 96 plaques de puits dans 100 microlitres de milieu complet RPMI 1640, et pré-incuber les plaques pendant 24 heures comme démontré précédemment. À la fin de l’incubation, jeter le supinatant et ajouter 100 microlitres de RPMI 1640 à chaque puits de la plaque de 96 puits. Ajouter 100 microlitres chacun de nano-émulsion I-OVA, I-OVA mélangé avec BNE et I-OVA pré-dilué avec un milieu de croissance complet à diverses concentrations finales avec BNE comme témoin et incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius.

Une fois l’incubation terminée, retirez le milieu et transférez la plaque dans un endroit sombre. Ajouter 90 microlitres de milieu de croissance complet et 10 microlitres de solution CCK8 à chaque puits de la plaque. Incuber la plaque pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.

Mesurez l’absorbance de chaque puits à 450 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques marqué par une enzyme. Utilisez des pointes de pipette de 10 microlitres pour effectuer l’immunisation nasale des souris avec I-OVA, I-OVA plus BNE et I-OVA NE pendant trois jours. Utiliser le BNE et le PBA comme témoins expérimentaux.

Ensuite, coupez des échantillons de tissus nasaux d’environ trois millimètres d’épaisseur avec des ciseaux et placez-les dans du paraformaldéhyde à 4%. Retirez les tissus pulmonaires et fixez les tissus nasaux et pulmonaires entiers dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 24 heures. La MET et l’AFM sont utilisées pour évaluer les caractéristiques de base du potentiel zêta de surface et la taille des particules du nanovaccin.

La taille des particules, les indices de polydispersité, les potentiels zêta et la mobilité d’électrophorèse de l’I-OVA NE dans les analyses de stabilité de la musine sont présentés. La viabilité relative des cellules BEAS2B est supérieure à 80% dans des cultures exposées à différentes concentrations peptidiques d’I-OVA, BNE+I-OVA et I-OVA pendant 24 heures. Le groupe I-OVA EN n’avait pas de toxicité muqueuse évidente, de lésions tissulaires, de saignements ou d’infiltration de cellules inflammatoires.

Les cellules épithéliales BEAS2B ont capturé plus d’I-OVA NE marqué FITC que celle de sa solution aqueuse. L’effet à libération prolongée de l’I-OVA NE in vitro a été analysé à l’aide du système IV-IS. Le vaccin I-OVA NE a eu un effet de libération soutenue par rapport à la solution aqueuse d’I-OVA.

Dans le groupe I-OVA NE, le pourcentage de temps de survie est plus élevé par rapport aux autres groupes, et le volume tumoral était significativement plus petit, ce qui suggère qu’il a un meilleur effet de protection préventive que les autres groupes. Dans le modèle thérapeutique, le temps de survie médian était significativement différent entre les différents groupes. Le volume tumoral du groupe I-OVA NE était significativement plus petit que celui du groupe I-OVA.

Remuer le mélange uniformément est important dans cette procédure. Sinon, cela réduira l’efficacité des nanovaccins.