Essai de liaison à une protéine de surface cellulaire basé sur la cytométrie en flux pour évaluer la sélectivité et la spécificité d’un aptamère anticancéreux

Ce protocole aidera les chercheurs qui débutent à travailler avec les aptamères à être en mesure de les utiliser dans leurs projets et aussi à comprendre les petites étapes individuelles qui sont nécessaires pour compléter le protocole. Les aptamères sont très polyvalents, et ce protocole démontre à quel point ils sont faciles et simples dans un test d’immunophénotypage. Les aptamères peuvent être utilisés pour des applications diagnostiques et thérapeutiques.

Ce protocole est la première étape entreprise pour confirmer leur spécificité et leur sensibilité. Bien que ce test particulier démontre la coloration d’un récepteur de surface cellulaire, les aptamères peuvent très facilement être utilisés pour la cytométrie en flux multi-paramétrique, fournissant un niveau élevé de connaissances phénotypiques. Les aspects importants du travail avec les aptamères sont de s’assurer qu’ils sont correctement pliés avant utilisation, et aussi que le tampon et les conditions de force ionique sont les mêmes que lorsqu’ils ont été sélectionnés.

Après avoir recueilli et jeté le média dans le flacon, ajoutez trois millilitres de PBS et étalez-le sur les cellules. Après avoir ajouté un millilitre de 0,25% de trypsine-EDTA à chaque fiole, incuber pendant cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius et visualiser le détachement des cellules au microscope. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu complet aux cellules et pipette les cellules de haut en bas pour obtenir une suspension unicellulaire.

Pipeter les cellules dans un tube approprié et centrifuger à 200 g pendant cinq minutes. Après avoir éliminé le surnageant, remettre les cellules en suspension dans un millilitre de milieu frais et compter les cellules en utilisant la coloration au bleu de trypan en diluant un certain volume de suspension cellulaire avec du bleu de trypan. Répartir environ 15 microlitres du mélange entre un hémocytomètre et un verre de couverture pour compter les cellules.

Recueillir le nombre requis de cellules, en vous assurant d’avoir cent mille cellules par échantillon de test. Incuber ensuite les cellules à 37 degrés Celsius pendant deux heures pour permettre la stabilisation de la protéine d’intérêt sur la membrane cellulaire suite au décollement enzymatique. Après les deux heures d’incubation, centrifuger les cellules à 500 G pendant cinq minutes.

Après avoir jeté le surnageant, remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de tampon bloquant. Incuber les cellules à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes avec un mélange intermittent. Au cours de cette incubation de 30 minutes, effectuez le pliage des aptamères en préparant deux fois les concentrations d’aptamères décrites dans le manuscrit.

Ensuite, mélangez et incuber les aptamères avec la thermocycleuse en fonction des conditions de pliage requises tout en veillant à protéger les aptamères de la lumière. Après l’incubation de 30 minutes, centrifuger les cellules comme démontré précédemment et retirer le surnageant. Ajoutez ensuite un millilitre de tampon de lavage et centrifugez à nouveau les cellules.

Après avoir retiré le surnageant, remettre les cellules en suspension dans un volume approprié du tampon de liaison. Ensuite, pipeter 50 microlitres des cellules remises en suspension dans chaque puits d’une plaque noire glacée de 96 puits. Ensuite, pipeter 50 microlitres des aptamères sur un volume de cellules de 50 microlitres, mélanger et incuber dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après la centrifugeuse et le retrait du surnageant, remettre délicatement la pastille en suspension dans un tampon de lavage et centrifuger à nouveau à 500 G pendant cinq minutes. Remettez ensuite en suspension dans 100 microlitres de tampon de lavage pour l’analyse cytométrique en flux tout en répétant l’étape de lavage deux fois. Tout d’abord, allumez le cytomètre en flux, puis l’ordinateur.

Ensuite, ouvrez le logiciel d’analyse de cytométrie en flux, connectez-vous au programme et, sous l’onglet cytomètre, exécutez le démarrage du fluide. Pour créer une nouvelle expérience, sous l’onglet Expérience, cliquez sur Nouveau dossier et nommez l’expérience de barre oblique de dossier de manière appropriée. Cliquez sur le nouveau dossier pour le mettre en surbrillance.

Ensuite, sous l’onglet Expérience, cliquez à nouveau sur Nouvelle expérience et nommez-la de manière appropriée. Pour ajouter le premier échantillon de barre oblique, sous l’onglet expérience, cliquez sur Nouveau spécimen et nommez-le de manière appropriée. Pour ajouter un échantillon de tube, mettez l’échantillon en surbrillance et sous l’onglet expérience, cliquez sur nouveau tube.

Ajoutez ensuite le nombre approprié de tubes et le nom. Pour préparer les graphiques requis, sous un onglet de feuille de calcul, ouvrez une nouvelle feuille de calcul. Une fois que la nouvelle fenêtre de feuille de calcul apparaît, préparez un graphique à points de dispersion latérale par rapport à la dispersion vers l’avant pour sélectionner la population d’intérêt.

Préparez un graphique par transfert de points de la hauteur de diffusion vers l’avant par rapport à la zone de diffusion vers l’avant pour sélectionner la population de cellules individuelles. Ensuite, préparez un histogramme du nombre d’événements contre le fluorophore d’intérêt. Assurez-vous que le tableau de bord d’acquisition pour contrôler l’acquisition de l’échantillon, l’inspecteur et le cytomètre pour ajuster les paramètres de tension ainsi que la feuille de calcul avec tous les graphiques sont ouverts avant de commencer la cytométrie en flux.

Tout d’abord, exécutez les cellules non traitées. Assurez-vous que la flèche pointant vers le tube est verte. Si cette flèche n’est pas verte, cliquez sur la flèche pour la rendre verte.

À l’aide d’une pipette, transférer chaque échantillon de la plaque noire de 96 puits dans un tube de cytométrie en flux. Dans le tableau de bord d’acquisition, choisissez un nombre approprié d’événements à enregistrer, définissez le débit sur faible, puis cliquez sur Acquérir des données. Ajustez la tension pour les paramètres FSC et SCC, en vous assurant que la population de cellules est centralisée dans le diagramme à points et qu’aucune cellule ne touche l’un ou l’autre axe du graphique pour éviter de perdre les cellules d’intérêt.

Définir la première porte en identifiant et en sélectionnant la population d’intérêt dans un diagramme de densité dispersée vers l’avant et sur les côtés, tout en excluant les débris, qui constituent la population ayant le signal de diffusion vers l’avant le plus faible. Définissez la deuxième porte en excluant les populations de doublets cellulaires, car les cellules doublet affectent considérablement les résultats et les conclusions. Augmentez la vitesse d’acquisition à moyenne ou élevée pour analyser les échantillons plus rapidement, mais ne dépassez pas plus de 200 à 300 événements par seconde.

Cliquez ensuite sur Enregistrer les données. Après avoir réglé la tension, déclenché et enregistré les données, retirez l’échantillon et cliquez sur Next Tube (Tube suivant). Insérez l’échantillon suivant et répétez les données d’enregistrement pour tous les échantillons témoins et d’essai.

Une fois toutes les données collectées, lavez le cytomètre en flux en faisant fonctionner trois tubes d’eau de Javel à 50%, de FACSRinse et d’eau ultrapure, chacun pendant cinq minutes à un débit élevé. Ensuite, dans le menu déroulant du cytomètre, cliquez sur fluidique s’arrêter. Exportez le résultat sous forme de fichiers fsc vers une clé USB pour le transférer.

Analysez-les à l’aide du logiciel d’analyse en appuyant sur le bouton Nouveau pour créer un nouveau document et une nouvelle fenêtre pour gérer l’analyse, puis faites glisser les fichiers d’exemple dans la nouvelle fenêtre. Double-cliquez pour ouvrir l’échantillon non taché. Pour ouvrir la porte à la population unicellulaire, choisissez la population P1 et double-cliquez sur la population P1 pour créer un graphique FSCH versus FSCA.

Double-cliquez sur les cellules individuelles fermées pour créer un histogramme des événements par rapport au fluorochrome utilisé. Dans la fenêtre d’origine, sélectionnez P1 et les cellules simples et faites-les glisser vers tous les échantillons afin que tous les échantillons contiennent désormais le même point de contrôle. Ensuite, cliquez sur le bouton de l’éditeur de mise en page pour ouvrir la fenêtre des mises en page et faites glisser deux échantillons l’un sur l’autre pour créer un histogramme de superposition.

Dans les cellules MDA-MB-231 EpCAM positives, la superposition des histogrammes représentant les cellules traitées avec TEPP et TENN montre que les cellules traitées TEPP sont déplacées vers la droite, par rapport aux cellules traitées TENN, démontrant que la liaison de l’aptamère TEPP se produit à la protéine d’intérêt. Dans le contrôle négatif, les cellules HEK 293T superposées aux histogrammes de TEPP et de TENN ne reflètent aucun décalage indiquant que dans les cellules exprimant EpCAM, TEPP est l’aptamère EpCAM attaché à son récepteur. De plus, aucune liaison n’a été observée dans les cellules EpCAM négatives, ce qui confirme la sélectivité et la spécificité de l’aptamère développé.

Assurez-vous que les aptamères sont protégés de la lumière, que les aptamères et les cellules sont mélangés sur la plaque et que les tensions correctes sont réglées sur le cytomètre en flux. Cela dépend fortement des applications futures des aptamères. Par exemple, nous nous concentrons sur l’administration de médicaments.

La prochaine étape pour nous serait donc d’évaluer si les aptamères sont internalisés à l’aide de la microscopie fluorescente. Ce protocole a démontré à quel point il est facile pour les aptamères de remplacer les anticorps monoclonaux et polyclonaux dans les tests d’immunophénotypage.