Isolement fécal murin et transplantation de microbiote

Ici, nous avons décrit un protocole pour guider les autres dans l’étude des mécanismes de la dysbiose dans la maladie, de la collecte d’échantillons fécaux à l’utilisation de la méthode suisse du rouleau pour étudier les changements dans l’intestin. Pour commencer, vaporisez la poitrine et les côtés de la souris euthanasiée avec de l’éthanol à 70% et ouvrez soigneusement la peau et la cavité péritonéale pour exposer le tractus gastro-intestinal. Isolez le caecum et utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles pour le couper en deux.

Exposez brièvement le caecum et coupez 0,5 centimètre à proximité de l’iléon et 0,5 centimètre distalement à sa jonction avec le côlon. Transférer le caecum isolé sur une boîte de Petri stérile. Utilisez une spatule stérile pour transférer le contenu de la cæcale dans des tubes stériles et conservez les aliquotes dans un congélateur à 80 degrés Celsius.

Resuspendre les granulés fécaux frais ou préalablement congelés dans une solution saline stérile dans une proportion de 1 à 20 et vortex jusqu’à homogénéisation. Passez l’homogénat à travers un filtre en nylon à pores de 30 micromètres pour éliminer les grosses particules. Centrifuger à 79G pendant cinq minutes et recueillir le surnageant pour l’utiliser pour la transplantation.

Gavage oral 100 microlitres de lisier par souris receveuse exempte de germes pendant trois jours consécutifs, suivi d’un gavage tous les trois jours pendant deux semaines. Placez doucement la souris dans des dispositifs de retenue sur le porte-souris préchauffé et laissez la queue à l’extérieur. Collez soigneusement le dessus sans le pincer pour ne pas stresser la souris.

Laissez la souris reposer dans le support et placez-la sur la plate-forme du brassard de queue pendant trois à cinq minutes, recouverte d’une feuille pour s’acclimater. Recueillir au moins trois séries de mesures de la pression systolique à l’aide de la pléthysmographie de la coiffe de la queue et faire la moyenne des mesures de toutes les rondes pour obtenir une pression systolique moyenne pour chaque animal. Recueillir de manière aseptique le contenu cécal de la souris euthanasiée.

Pour récolter les intestins et autres tissus, localisez le tissu dans la souris et excis avec des ciseaux pour examiner le rôle du microbiote intestinal dans la santé cardiométabolique. Le premier jour, disséquez l’intestin de la souris du côté anal au côté de l’estomac. Et placez la totalité du tractus gastro-intestinal isolé dans une boîte de Petri contenant du PBS.

Tirez doucement l’extrémité proximale de l’extrémité de l’estomac et retirez la graisse environnante et le tissu conjonctif à la main. Isolez l’intestin grêle et faites un zigzag de type Z à chaque longueur. Ensuite, couper pour obtenir le duodénum, le jéjunum et l’iléon.

Isolez le côlon en coupant la section de l’intestin sous le caecum. Couper le duodénum, le jéjunum, l’iléon et le côlon. Utilisez une seringue et une aiguille avec un embout de balle pour rincer soigneusement et laver l’intestin à l’intérieur avec PBS sans déchirer l’intestin.

Placez l’intestin sur du papier filtre et étiquetez le papier avec le nom de la section, puis P dans le coin supérieur gauche pour le proximal ou D pour le distal dans le coin inférieur gauche. Couper l’intestin longitudinalement avec des ciseaux à bout de bille. Ouvrez l’intestin sur le papier filtre et lavez avec plus de PBS au besoin.

Introduisez l’intestin entre deux papiers filtres et agrafez les papiers filtres en quatre points ou coins près de l’intestin. Faire tremper dans une solution tampon neutre à 10 % de formol et agiter à l’aide d’une bascule à plate-forme à cinq tr/min pendant une nuit à température ambiante. Le deuxième jour, chauffer le 2% d’agarose préparé dans de l’eau distillée avec une barre d’agitation dans un bécher recouvert de papier d’aluminium.

Pour récupérer les tissus, dénudez le papier filtre supérieur et roulez l’intestin du côté proximal de sorte que le côté proximal pénètre d’abord à l’intérieur, et roulez vers l’intérieur pour que la lumière soit également à l’intérieur sur la lame. Épinglez avec une aiguille de calibre 30 ou deux au besoin. Aspirer un millilitre d’agarose à l’aide de pipettes de transfert jetables et verser l’agarose sur une section d’intestin roulé sur une surface plane tout en évitant les bulles d’air dans les tissus.

Une fois que l’agarose refroidit et se solidifie, utilisez une lame de rasoir pour couper l’agarose supplémentaire autour de la section de tissu. Enfin, placez les sections intestinales dans des cassettes de traitement des tissus ou d’intégration et faites-les tremper dans de l’éthanol à 70% à quatre degrés Celsius. L’estimation de la biodiversité des espèces dans la teneur en cæcales obtenue à partir de souris suivant des régimes normaux en sel et des régimes riches en sel est présentée ici.

Les changements dans le microbiote intestinal en réponse à la teneur élevée en sel comprenaient une diminution de la biodiversité bactérienne. La mise à l’échelle multidimensionnelle non métrique montre que les bactéries des souris normales à teneur en sel et à régime riche en sel forment des grappes distinctes. Une teneur élevée en sel est associée à une augmentation du rapport Firmicutes / Bacteroidetes.

La transplantation de microbiote fécal de souris nourries à haute teneur en sel prédispose les souris exemptes de germes à l’hypertension induite par l’angiotensine II. Le transfert du microbiote intestinal dysbiotique induit par le sel a été associé à une augmentation significative de la pression systolique chez les souris exemptes de germes par rapport aux souris ayant reçu un microbiote intestinal de sel normal. Les images représentatives montrent une coloration de l’apolipoprotéine A-I dans l’ilia obtenue à partir de souris présentant une hyperlipidémie sans ou avec protéinurie.

Ce protocole harmonise les étapes pour atteindre la FMT réussie dans des considérations expérimentales clés pour les donneurs humains et de rongeurs.