Microinjections ventriculaires cérébrales de lipopolysaccharide dans des larves de poisson-zèbre pour évaluer la neuroinflammation et la neurotoxicité

La neuroinflammation est un acteur clé dans divers troubles neurologiques. Par conséquent, il est d’un grand intérêt de rechercher et de développer des modèles alternatifs de neuroinflammation in vivo pour faciliter les études du développement pathologique. La technique décrite ici est un excellent outil pour mieux comprendre les changements pathologiques dans le cerveau via l’imagerie in vivo, et pour évaluer rapidement et efficacement les anti-neuro-inflammatoires possibles.

Préparez-vous à l’injection en tirant les capillaires en verre à l’aide d’un extracteur de micropipettes en suivant le protocole en cinq étapes pour le tirage du tube capillaire en verre. Ouvrez la pointe de l’aiguille à la taille appropriée à un angle à l’aide d’une pince. Remplissez l’aiguille avec 0,1 millilitre d’huile minérale pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles.

Retirez le bouchon à vis de l’aiguille en acier de l’appareil de micro-injection. Alignez le trou de l’aiguille en verre avec l’aiguille en acier, puis serrez le bouchon à vis. Montez l’appareil de micro-injection à aiguille chargée dans un micromanipulateur.

Ajustez la position de l’appareil de micro-injection afin que le micromanipulateur puisse déplacer l’appareil de manière flexible sous le microscope. Déchargez un volume approprié d’huile de paraffine nécessaire pour faire pénétrer l’aiguille en acier dans le tube de verre capillaire. Déposez la solution d’injection composée de PBS ou de lipopolysaccharide sur une lame de verre stérilisée à 70% d’éthanol et ajustez l’appareil de micro-injection de manière à ce que l’embout soit inséré dans la goutte liquide.

Chargez environ deux microlitres de solution injectable dans l’aiguille. Réglez le micromanipulateur de manière à ce que l’extrémité de l’aiguille de l’appareil de microinjection soit dans le même champ de vision que les larves à fort grossissement. Faire fondre une solution d’agarose à 2% dans de l’eau bidistillée à l’aide d’un micro-ondes.

Versez l’agarose fondue dans un plat en plastique. Utilisez une pipette de transfert en plastique pour transporter les larves anesthésiées au centre d’une boîte en plastique recouverte d’agarose à 2 %. Orientez les larves montées avec le côté cerveau vers le haut pour l’accès à l’aiguille.

Ajustez le grossissement du microscope de manière à ce que la structure ventriculaire cérébrale du poisson zèbre soit clairement affichée dans le champ de vision. Placez soigneusement l’aiguille au-dessus du tectum cérébral. Nettoyez la zone du cerveau avec de l’éthanol à 70% et percez lentement la peau du cerveau du poisson zèbre avec la pointe de l’aiguille à l’aide du micromanipulateur.

Appuyez sur la pédale pour éjecter un nanolitre de PBS 1X ou différentes concentrations de lipopolysaccharide. Transférer les larves dans un milieu E3 propre immédiatement après l’injection. Après 24 heures, prélever les larves pour l’imagerie microscopique, le test comportemental de la locomotive et la détermination d’autres indicateurs.

Préparer une solution d’agarose à 1,5 % à bas point de fusion dans un milieu E3 et la chauffer au micro-ondes pour former un liquide clair. Utilisez une pipette de transfert en plastique propre pour transporter les larves vers une lame de verre et éliminer autant d’eau que possible. Utilisez une pipette de transfert en plastique pour ajouter une goutte d’agarose à bas point de fusion à 1,5 % aux larves.

Utilisez une aiguille de seringue d’un millilitre pour orienter les larves. Attendez que l’agarose refroidisse et se solidifie avant de commencer l’imagerie. 24 heures après l’injection ventriculaire cérébrale de lipopolysaccharide, procéder à la détermination des marqueurs d’expression génique.

Utilisez deux seringues d’un millilitre pour séparer les parties de la tête des larves sans les régions de l’œil et du sac vitellin. Homogénéiser la partie de la tête avec 200 microlitres de réactif d’extraction d’ARN à l’aide d’un broyeur de tissus à 11 000 rotations par minute pendant cinq secondes, puis effectuer une extraction d’ARN en utilisant la méthode du chloroforme isopropanol. Sécher à l’air la pastille d’ARN pendant cinq à 10 minutes, puis ajouter 30 microlitres d’eau sans ARNase pour dissoudre la pastille d’ARN.

Synthétiser l’ADNc en utilisant la transcriptase inverse avec des amorces aléatoires comme décrit dans le manuscrit textuel. Ensuite, effectuez une PCR en temps réel sur un système qPCR à l’aide d’un kit RT-qPCR disponible dans le commerce pour déterminer l’expression des gènes cibles. 24 heures après l’injection ventriculaire cérébrale de lipopolysaccharide, transférer individuellement les larves de poisson zèbre dans les puits d’une microplaque carrée de 96 puits.

Ajouter 300 microlitres de milieu E3 à chaque puits, puis incuber les larves pendant quatre heures pour s’acclimater à la plaque d’essai. Transférer la microplaque chargée de larves dans la boîte de suivi du poisson zèbre. Allumez la source lumineuse et incuber les larves dans la boîte d’essai pendant 30 minutes pour les acclimater à l’environnement.

Surveillez et enregistrez le comportement du poisson zèbre à l’aide d’un système de suivi vidéo automatisé. Enregistrer 12 séances de cinq minutes chacune pour les larves individuelles de poisson-zèbre et définir la distance totale telle que décrite dans le manuscrit du texte. Après un traitement de 24 heures, un à cinq milligrammes par millilitre d’injection cérébrale ventriculaire de lipopolysaccharide a induit une perte significative de neurones RA dans le cerveau du poisson-zèbre larvaire TgEtvmat2:GFP par rapport aux groupes témoin et simulé.

La lignée transgénique elavl3:mCherry zebrafish a démontré des changements significatifs dans la densité intégrée de fluorescence des neurones cérébraux larvaires lorsqu’elle a été injectée avec 2,5 à cinq milligrammes par millilitre de lipopolysaccharide, tandis que l’injection de lipopolysaccharide d’un milligramme par millilitre n’a montré aucun effet. De plus, cinq milligrammes par millilitre de lipopolysaccharide ont induit un déficit de locomotion et ont diminué la distance totale de mouvement du poisson zèbre sur une période de suivi de 60 minutes. La production d’oxyde nitreux et l’expression de l’ARNm des cytokines pro-inflammatoires dans la tête des larves de poisson zèbre ont été augmentées de 2,5 à cinq milligrammes par millilitre de traitement lipopolysaccharidique par rapport à l’expression dans les groupes témoin et simulé.

L’injection d’un à cinq milligrammes par millilitre de lipopolysaccharide a démontré le recrutement de neutrophiles dans le cerveau larvaire du poisson zèbre, entraînant une augmentation significative du nombre de neutrophiles dans la région cérébrale du poisson zèbre Tgmpo:eGFP. La taille d’ouverture des aiguilles et la force d’injection pour la micro-injection ainsi que la séparation de la tête des yeux et du corps du poisson zèbre sont cruciales pour cette procédure.