Collecte de sperme et analyse assistée par ordinateur des spermatozoïdes dans le modèle téléostéen japonais Medaka (Oryzias latipes)

Cette technique permet d’échantillonner la laitance d’un petit poisson modèle, le Madaka japonais, et d’étudier sa qualité de manière cohérente. Plus précisément, la collecte de sperme par massage abdominal permet des prélèvements répétés sur les mêmes poissons car cette approche n’est pas invasive. En outre, cette technique peut être appliquée pour la cryoconservation du sperme Madaka.

La qualité du sperme est un indicateur essentiel du succès de la fécondation, et donc un paramètre important à analyser dans les études de physiologie écologique et productive globale. Pour commencer, préparez une éponge de maintien molle, en la coupant pour l’adapter avec suffisance dans une boîte de Pétri. Coupez une ligne droite au milieu de l’éponge, c’est-à-dire assez longue pour tenir le poisson sur sa face ventrale vers le haut.

Après avoir anesthésié le poisson, séchez l’abdomen du poisson en l’essuyant doucement avec une serviette en papier. Placez le poisson dans l’auge de l’éponge de rétention humide avec le côté ventral vers le haut, de sorte que ses branchies soient exposées à la solution anesthésique dans l’éponge. Si la zone autour du cloaque est humide, séchez doucement le dessous de l’abdomen avec une lingette jetable.

Sous un microscope à dissection, placez la micro-pipette avec un tube d’aspiration attaché contre le cloaque du poisson. Maintenant, massez l’abdomen du poisson en pressant doucement avec une pince lisse à extrémité émoussée dans un mouvement rostral à caudal. Pour la récupération du poisson, libérez-le de l’éponge dans l’eau de récupération préalablement préparée avant de retourner le poisson dans le système de l’aquarium.

Transférer la laitance recueillie dans un tube contenant une solution d’activation préchauffée et une solution de pipette de haut en bas plusieurs fois à l’aide de l’ensemble du tube d’aspirateur. Homogénéiser doucement le sperme dilué en agitant les tubes avant l’analyse. Après euthanasie, le poisson le sèche comme démontré précédemment et place-le sous un microscope à dissection avec son côté latéral gauche tourné vers le haut.

À l’aide de petits ciseaux à dissection, couper un volet dorsale du cloaque, puis à travers les côtes jusqu’aux branchies pour exposer les organes internes. Localisez les testicules et coupez l’accessoire aux deux extrémités avec une pince fine. Retirez les testicules et transférez-les dans un tube préparé contenant une solution d’activation préchauffée.

Utilisez la pince pour écraser les testicules plusieurs fois contre le côté du tube afin de libérer le sperme, ce qui peut être visualisé par l’aspect légèrement trouble de la solution. Pour commencer l’analyse, ouvrez le logiciel d’analyse du sperme et sélectionnez le module de motilité. Définissez les configurations dans le logiciel pour tous les paramètres.

Placez une lame de chambre de comptage jetable préchauffée de 20 micromètres sous le microscope sur une platine chauffée, réglée à 27 degrés Celsius. Introduire l’échantillon dans la chambre de la lame jusqu’à ce qu’il se remplisse, mais sans trop remplir. Essuyez soigneusement les échantillons excédentaires de l’entrée de la chambre pour éviter le mouvement de dérive des cellules dans la solution.

Sélectionnez analyser pour regarder l’échantillon au microscope. Assurez-vous que le microscope est focalisé et sélectionnez analyser à nouveau pour enregistrer le sperme sur le terrain. Déplacez la lame vers une nouvelle zone de l’échantillon dans le cadre et répétez la procédure pour trois à cinq champs de vision différents, en évitant les bulles d’air, les masses cellulaires ou les artefacts.

Pour afficher les résultats, sélectionnez les résultats et double-cliquez sur un champ pour visualiser le champ individuel ou pour vérifier manuellement les spermatozoïdes mal étiquetés ou non suivis. Si nécessaire, faites un clic droit sur les spermatozoïdes individuels pour renommer la motilité. Dans la présente étude, l’analyse assistée par ordinateur des spermatozoïdes a été utilisée pour enregistrer divers paramètres de vitesse et de mouvement.

Les valeurs calculées incluent l’indice de rectitude, l’indice de linéarité et l’oscillation. L’osmolarité des solutions d’activation a eu un impact sur la motilité des spermatozoïdes issus de la dissection des testicules. Les spermatozoïdes étaient immotiles dans l’eau de l’aquarium, mais mobiles dans HBSS avec une osmolarité élevée et faible.

Cependant, la motilité est significativement réduite à 36 milli d’osmol par kilogramme, par rapport aux solutions d’osmolalité plus élevées. La motilité a également été affectée par la méthode de collecte de sperme, dans laquelle les spermatozoïdes sont significativement plus mobiles dans la méthode de dissection testiculaire par rapport au massage abdominal. En outre, un pourcentage plus élevé de cellules étaient progressives et plus de cellules se déplaçaient soit moyennement ou rapidement.

Le pourcentage de motilité et de progressivité est significativement plus élevé dans le sperme stocké à quatre degrés Celsius ou sur la glace, comparativement à 27 degrés Celsius stocké. Les conditions environnementales et de logement ont également eu un léger impact sur la motilité des spermatozoïdes. Aucune différence significative dans la motilité des spermatozoïdes n’a été observée dans les spermatozoïdes recueillis après et avant le frai.

Les mâles logés sans femelles pendant un mois présentaient une motilité élevée, mais la différence était insignifiante. Pour la collecte de sperme par massage abdominal, une formation est nécessaire pour apprendre la pression et le mouvement appropriés des forceps et pour éviter la contamination des matières fécales. Cette technique sera très utile pour étudier, par exemple, les effets de divers polluants sur la fertilité masculine dans les études écotoxicologiques, où Medaka est un modèle couramment utilisé.