Name: Amplification du signal tyramide pour la coloration immunofluorescente de la phosphorylation dépendante de ZBP1 de RIPK3 et MLKL après infection à HSV-1 dans des cellules humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Apprenez l'amplification du signal tyramide pour détecter RIPK3 et MLKL phosphorylés lors de la nécroptose induite par ZBP1 après infection à HSV-1 dans des cellules HT-29 humaines. Cette méthode améliore la sensibilité de la coloration immunofluorescente.

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Nous tenons à remercier le VIB Bioimaging Core pour la formation, le soutien et l’accès au parc d’instruments. J.N. est soutenu par une bourse de doctorat de la Fondation pour la recherche de Flandre (FWO). La recherche dans le groupe J.M. a été soutenue par une bourse Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), une subvention de recherche junior (G031022N) de la Fondation de recherche Flanders (FWO), une bourse de preuve de concept pour jeunes chercheurs du CRIG et par l’Université de Gand. La recherche dans le groupe P.V. a été soutenue par EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), les consortiums CRIG et GIGG et VIB.

1. Préparation du tyramide biotinylé
<ol><li>Préparer du tyramide biotinylé à partir de biotine-tyramide. Pour faire une solution mère de 10 mM, dissoudre 3,6 mg de biotine-tyramide dans 1 mL de DMSO. Conserver le produit dissous dans des aliquotes à −20 °C pour en préserver la qualité.</li>
</ol>2. Maintenir les cellules HT-29 en culture
NOTE: Les HT-29 exprimant ZBP1 ont été générés par transduction avec un lentivecteur27 codant pour ZBP1 humain.
<ol><li>Conservez les cellules HT-29 exprimant ZBP1 dans le milieu 5A de McCoy supplémenté en L-glutamine, en pyruvate de sodium et en sérum bovin fœtal à 10 % (désormais appelé milieu complet) et maintenez-les dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone. Idéalement, utilisez des cellules d’un faible nombre de passages (moins de 10). Laissez les cellules récupérer pendant au moins 5 jours après le cycle de dégel avant le début de l’expérience.</li>
	<li>Pour détacher les cellules du ballon de culture, retirer le milieu et laver les cellules avec 5 mL de PBS (préchauffé à 37 °C). Ensuite, ajouter la quantité appropriée de trypsine/EDTA (0,05 % de trypsine et 0,032 % d’EDTA, respectivement, préchauffées à 37 °C) aux cellules (2 mL pour une fiole T75, 3 mL pour une fiole T175).</li>
	<li>Incuber les cellules avec de la trypsine/EDTA jusqu’à 10 min dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, tapotez la fiole et vérifiez visuellement si les cellules se sont détachées du ballon à l’aide d’un microscope avec un grossissement d’objectif 4x-20x.</li>
	<li>Si les cellules ne sont pas complètement détachées, incuber encore 5 minutes à 37 °C. Lorsque les cellules sont détachées, arrêter la réaction enzymatique en ajoutant 6 mL de milieu complet dans le flacon.</li>
	<li>Rassemblez la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL. Compter les cellules à l’aide d’une coloration bleu trypan pour évaluer la viabilité; Une dilution de 1:5 est recommandée. Ne poursuivez l’expérience que si la viabilité des cellules dépasse 90%.</li>
</ol>3. Début de l’expérience, ensemencement et stimulation des cellules
<ol><li>Ensemencer 90 000 cellules HT-29 exprimant ZBP1 en milieu complet dans une plaque de puits de 1 cm² de surface qui permet une microscopie haut de gamme. Utiliser un volume final de 200 μL par puits.</li>
	<li>Incuber les cellules pendant une nuit à 37 °C avec du dioxyde de carbone à 5%. Tenez compte du fait que certains puits supplémentaires doivent être ensemencés pour les contrôles de coloration, ce qui est expliqué plus en détail à l’étape 5.6.</li>
	<li>Lorsque les cellules atteignent 70% à 80% de confluence, ajoutez un stimulus induisant la nécroptose aux cellules. Ici, les cellules ont été infectées par HSV-1 ICP6mutRHIM (multiplicité de l’infection [MOI] de 5, définie comme des unités formant des plaques (pfu) divisée par le nombre de cellules; le pfu a été quantifié à l’aide d’un test de plaque sur des cellules Vero) pendant 6 h, 8 h ou 10 h.</li>
	<li>Comme témoin positif de l’induction de la nécroptose, stimuler les cellules pendant 4 h avec un cocktail induisant la nécroptose contenant 30 ng / mL de TNF, 20 μM de l’inhibiteur de pan-caspase zVAD-fmk et 5 μM du mimétique SMAC BV6.</li>
	<li>Comme témoin négatif pour la coloration p-RIPK3 (S227), inclure GSK'840 (1 μM) pour inhiber l’activité de la kinase RIPK3 et empêcher l’autophosphorylation de S227. Idéalement, ajoutez l’inhibiteur dans une condition non traitée et après la stimulation de la nécroptose. L’inhibiteur peut être ajouté simultanément avec une infection virale.</li>
	<li>Préparer les stimulations à feu moyen, préchauffé à 37 °C. Utilisez un volume final de 200 μL par puits pour toutes les stimulations.</li>
</ol>4. Fixation des cellules
<ol><li>Retirez le milieu et lavez les cellules avec 200 μL de 1x PBS. Ensuite, ajoutez 150 μL de PFA à 4% (déjà équilibré à température ambiante) aux cellules et incuber à température ambiante pendant 30 min. REMARQUE: Si vous utilisez des cellules qui se détachent facilement, la fixation des cellules peut être optimisée comme suit. Retirer 100 μL de milieu du puits, de sorte qu’un volume de 100 μL reste sur la plaque. Ajouter 100 μL de PFA à 4% aux cellules. Incuber les cellules pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, retirer le milieu/fixateur des puits et le remplacer par 150 μL de PFA à 4 %. Incuber les cellules pendant encore 20 minutes à température ambiante pour assurer une fixation complète des cellules.</li>
	<li>Après la fixation, retirez le PFA à 4% et lavez les cellules 3x avec 200 μL de 1x PBS. Les échantillons peuvent être conservés dans un excès (>200 μL) de 1x PBS à 4 °C pendant une nuit jusqu’à un traitement ultérieur.</li>
</ol>5. Perméabilisation et coloration primaire
<ol><li>Retirez le PBS et ajoutez 100 μL de tampon de perméabilisation (0,5% Triton X-100 dans PBS). Incuber à température ambiante pendant 30 min.</li>
	<li>Retirer le tampon de perméabilisation et, par la suite, laver les puits avec 100 μL de tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS). Incuber la chambre d’imagerie avec tampon de lavage pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire inclinable (20-30 mouvements de bascule par min).</li>
	<li>Pour éviter la liaison non spécifique des anticorps primaires, ajouter 100 μL de milieu bloquant et incuber à température ambiante pendant 2 h. Alternativement, cette étape de blocage peut être remplacée par un blocage avec 3% de BSA, 0,1% de Triton-X-100 dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Laver les puits 3x avec 100 μL de tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS). Incuber les étapes de lavage pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.</li>
	<li>Après avoir retiré le tampon de lavage, ajouter les anticorps primaires dans la chambre d’imagerie et incuber pendant une nuit à 4 °C. Utilisez un volume final de 100 μL pour couvrir le puits. Pendant la nuit d’incubation à 4 °C, ne placez pas la chambre d’imagerie sur un agitateur de laboratoire basculant. NOTE: L’anti-p-MLKL (S358; dilution: 1:200) et l’anti-p-RIPK3 (S227; dilution: 1:200) partagent le lapin comme espèce hôte et ne doivent donc pas être combinés dans un seul puits. Pour surveiller l’infection virale, combinez un anticorps primaire contre une protéine virale de votre choix avec p-MLKL (S358) ou p-RIPK3 (S227). Ici, les cellules ont été infectées par une infection à HSV-1 suivie d’une coloration ICP0 (dilution: 1:50, espèce hôte: souris).</li>
	<li>Prenez en considération les contrôles de coloration nécessaires à ce stade. Toujours inclure une condition d’absence d’anticorps primaire pour visualiser le contexte potentiel de l’étape d’amplification TSA pour définir le seuil de masquage (voir étape 9). REMARQUE: Dans le cas d’un protocole de co-coloration (par exemple, combinant p-MLKL [S358] ou p-RIPK3 [S227] avec un anticorps contre une protéine virale), utilisez également des colorations simples. L’utilisation de colorations simples est importante pour corriger le signal de purge potentiel dans d’autres canaux d’imagerie.</li>
</ol>6. Amplification du signal tyramide (TSA)
<ol><li>Retirer le mélange d’anticorps primaires et laver les puits 3x avec 100 μL de tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS). Incuber les étapes de lavage pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.</li>
	<li>Retirez le tampon de lavage et ajoutez 100 μL d’anticorps secondaire marqué HRP reconnaissant l’espèce d’anticorps primaire qui doit être amplifiée. Pour amplifier le signal p-RIPK3 (S227) ou p-MLKL (S358), ajouter 100 μL d’anti-lapin-HRP et incuber pendant 30 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant. REMARQUE: Seuls p-MLKL (S358) ou p-RIPK3 (S227) seront amplifiés. La coloration d’une protéine virale sera visualisée à l’aide d’une méthode de coloration indirecte standard.</li>
	<li>Ensuite, lavez les puits 3x avec 100 μL de tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS). Incuber les étapes de lavage pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.</li>
	<li>Dans les étapes suivantes, ajoutez le tyramide biotinylé à la plaque microscopique. En utilisant le groupe HRP couplé aux anticorps secondaires, la réaction enzymatique déclenchera la formation de radicaux tyramide à proximité immédiate de la cible primaire (ici, p-MLKL [S358] ou p-RIPK3 [S227]).</li>
	<li>Pour activer l’activité enzymatique de HRP, ajoutez un substrat oxydant avec le tyramide biotinylé. Pour ce faire, compléter le tampon TSA (acide borique 0,1 M [pH 8,5]) avec 0,03 MH2O2; plus précisément, prendre 5 mL de tampon TSA et ajouter 5 μL de H 2 O2 à 30 %.</li>
	<li>Maintenant, diluez la biotine-tyramide dans un tampon TSA supplémenté enH2O2 allant de 1:1 000 à 1:20 000. NOTE: Le facteur de dilution de la biotine-tyramide doit être optimisé par lot.</li>
	<li>Retirer le tampon de lavage des puits et ajouter de la biotine-tyramide diluée dans les puits jusqu’à un volume final de 100 μL. Incuber à température ambiante pendant 10 min sur un agitateur de laboratoire basculant.</li>
	<li>Ensuite, lavez les puits 3x avec 100 μL de tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS). Incuber les étapes de lavage pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.</li>
</ol>7. Fluorophores
REMARQUE: Puisque le signal de l’anticorps primaire est converti en un groupe biotine, p-MLKL (S358) et p-RIPK3 (S227) sont visualisés à l’aide de streptavidine couplée à un fluorophore (fluorophore 568, dilution: 1:500). De plus, les noyaux sont colorés avec du DAPI (5 μg/mL). Si une protéine virale est incluse dans le protocole de coloration, incluez un anticorps secondaire marqué par fluorescence approprié contre l’espèce hôte de votre anticorps primaire. Dans les résultats représentatifs, un anti-ICP0 de souris a été utilisé. En tant qu’anticorps secondaire de chèvre, l’anti-souris couplé au fluorophore 633 (dilution: 1:1 000) a été inclus.
<ol><li>Faire le mélange de coloration dans un tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS) contenant les anticorps et les taches mentionnés ci-dessus. Retirer le tampon de lavage, ajouter 100 μL de mélange de coloration et incuber à température ambiante pendant 1 h sur un agitateur de laboratoire basculant. Gardez la chambre d’imagerie à l’abri de la lumière à partir de cette étape.</li>
	<li>Ensuite, lavez les puits 2x avec un tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS). Incuber les étapes de lavage pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.</li>
	<li>Enfin, rincez les puits 2x avec 1x PBS. Conservez les échantillons dans un excès (> 200 μL) de 1x PBS jusqu’à l’imagerie. Vous pouvez également immerger les échantillons dans un support de montage pour préserver la coloration. La chambre d’imagerie est maintenant prête à être visualisée au microscope confocal.</li>
</ol>8. Imagerie au microscope confocal
<ol><li>Allumez le microscope confocal et les lasers au moins 10 minutes avant l’imagerie.</li>
	<li>Utilisez un objectif d’immersion pour la sensibilité. De préférence, utilisez un grossissement d’objectif de 40x ou 63x. Avant l’imagerie, nettoyez les objectifs d’immersion avec un nettoyant pour lentilles à l’aide de boules de coton appropriées. Les objectifs sales (par exemple, à cause de la poussière) peuvent entraîner des images de qualité inférieure.</li>
	<li>Placez une quantité excessive d’huile au fond de la chambre d’imagerie. De plus, ajoutez une goutte d’huile sur l’objectif de choix.</li>
	<li>Placez la chambre d’imagerie sur le microscope. Recherchez le champ de mise au point à l’aide de la coloration DAPI ou de l’imagerie en fond clair. Si nécessaire, déplacez-vous autour de la chambre d’imagerie pour assurer une bonne propagation de l’huile d’immersion.</li>
	<li>Configurez les pistes d’imagerie nécessaires au microscope. Selon le microscope, les étapes suivantes peuvent varier (tableau 1). REMARQUE: Lors de la configuration des pistes d’imagerie, programmez les pistes de sorte que la coloration nucléaire soit mesurée en dernier. Le laser 405 nm peut contribuer au photoblanchiment et, par conséquent, à la perte de signal spécifique dans tous les canaux.</li>
	<li>Pour analyser une cellule complète pour détecter la présence de p-RIPK3 (S227) ou p-MLKL (S358), mesurez les piles z qui couvrent la hauteur de la cellule. Ici, les piles z étaient constituées de 40 tranches tous les 0,16 μm, ce qui donnait une plage de 6,22 μm.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Piste</td>
			<td>Laser</td>
			<td>Séparateur de faisceau</td>
			<td>Filtre</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358)</td>
			<td rowspan="2">561</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 570-620 + LP645</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633 + SBS SP615</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Gène viral : ICP0</td>
			<td rowspan="2">633</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 420-480 + LP605</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633 + SBS LP570</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Noyau: DAPI</td>
			<td rowspan="2">405</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 420-480 + BP 495-550</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Pistes d’imagerie pour la visualisation cellulaire.
9. Analyse et quantification des données
<ol><li>Téléchargez les images microscopiques dans le logiciel. Utilisez la mise au point étendue pour visualiser toutes les informations de la pile z dans une image 2D.</li>
	<li>Ensuite, programmez le protocole d’analyse afin d’extraire les informations suivantes : le nombre de cellules par image, la somme des voxels montrant la coloration p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+. Un voxel représente un volume tridimensionnel, défini comme l’équivalent tridimensionnel d’un pixel.</li>
	<li>Pour quantifier le nombre de cellules par image, segmentez le noyau. Pour réduire le bruit dans les résultats de segmentation, ajoutez une limite de taille à la segmentation (>100 μm³). Le nombre de noyaux segmentés représente le nombre de cellules dans l’image.</li>
	<li>Pour quantifier la quantité de voxels p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+, programmez une segmentation par seuil. Réglez le seuil de sorte qu’aucun signal ne soit capté dans les images sans anticorps primaire (NP).</li>
	<li>Adaptez davantage le seuil en utilisant les images de la condition simulée non traitée. Pour assurer une détection sensible de l’augmentation du signal due à la stimulation de la nécroptose, limitez la captation des voxels p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+ dans des conditions simulées en définissant un seuil plus élevé. Vérifiez toujours le protocole d’analyse programmée dans plusieurs images de la condition simulée et de l’infection virale induisant la nécroptose.</li>
	<li>Exécutez l’analyse sur tous les jeux d’images. Exportez la quantification voxel et la segmentation du noyau dans un fichier .txt pour un traitement ultérieur dans un tableur.</li>
	<li>Créez un tableau croisé dynamique des données indiquant le nom de l’image, la quantification du noyau et la somme des voxels détectés.</li>
	<li>Ensuite, divisez la somme des voxels positifs par le nombre de cellules dans l’image. Il en résulte une valeur relative de voxels positifs par cellule. Pour visualiser l’augmentation du pli, divisez la valeur relative de p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+ voxels par cellule par la médiane de la condition non traitée (simulée).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole de coloration immunofluorescente décrit l’utilisation de l’amplification du signal tyramide (TSA) pour augmenter la sensibilité aux événements de signalisation de la voie de signalisation nécroptotique humaine qui sont difficiles à détecter, y compris la phosphorylation de RIPK3 et MLKL26. L’inclusion d’une étape TSA améliore considérablement le seuil de détection de p-RIPK3 (S227) et p-MLKL (S358) et augmente la sensibilité de la contrainte p-MLKL (S358). La TSA a révélé un signal p-...

La protéine kinase 3 sérine/thréonine interagissant avec les récepteurs (RIPK3) et le domaine mixte de la kinase de lignée (MLKL) sont des régulateurs centraux de la mort cellulaire nécroptotique 1,2. La nécroptose est une forme lytique et inflammatoire de mort cellulaire régulée impliquée dans l’immunité antivirale et l’autoinflammation. La nécroptose des cellules infectées par le virus arrête immédiatement la réplication du virus. La lyse cellulaire après induction de la nécroptose libère également des schémas moléculaires associés aux dommages, qui stimulent l’immunité antivirale 3,4. La nécroptose est initiée par l’activation de RIPK3 à la suite d’interactions médiées par le motif d’interaction homotypique (RHIM) RIP avec l’une des trois molécules activatrices en amont : RIPK1 (lors de l’engagement du récepteur TNF 1 [TNFR1]), l’interféron-β induisant un adaptateur contenant le domaine TIR (TRIF; lors de l’engagement des récepteurs de type Toll 3 et 4), ou le capteur d’acide nucléique antiviral Protéine de liaison à l’ADN-Z 1 (ZBP1)1,2 . La signalisation de la nécroptose se déroule par une série d’événements de phosphorylation commençant par l’autophosphorylation de RIPK3. L’autophosphorylation de RIPK3 humain à la sérine (S)227 à l’intérieur de son domaine kinase est une condition préalable à la nécroptose en permettant l’interaction avec MLKL et est couramment utilisée comme marqueur biochimique de l’activation humaine de RIPK3 et de la mort cellulaire nécroptotique 1,5. Une fois activé, RIPK3 phosphoryle la boucle d’activation de MLKL à la thréonine (T)357 et S3581. Cela provoque une modification de la conformation MLKL, entraînant une exposition du domaine du faisceau à quatre hélices N-terminal. MLKL s’oligomérise ensuite et se dirige vers la membrane cellulaire où il forme un pore par l’insertion des quatre faisceaux hélicoïdaux exposés dans la bicouche lipidique, conduisant finalement à la mort cellulaire 2,6.
ZBP1 est un capteur d’acide nucléique antiviral qui reconnaît les acides nucléiques gauchers de forme Z, y compris l’ARN double brin dans la conformation Z (ARN-Z). La liaison de l’ARN-Z se produit via deux domaines Zα positionnés à l’extrémité N de ZBP1. On pense que l’ARN-Z s’accumulant lors de l’infection par l’ARN et le virus de l’ADN engage directement ZBP1 7,8. ZBP1 activé recrute RIPK3 par le biais de ses RHIM centraux et induit une mort cellulaire régulée, y compris la nécroptose 9,10. Les virus ont adopté de nombreux mécanismes d’échappement pour contrer la nécroptose de la cellule hôte induite par ZBP11. Par exemple, la sous-unité 1 de la ribonucléotide réductase du virus de l’herpès simplex 1 (HSV-1), connue sous le nom de ICP6 et codée par UL39, héberge RHIM à son extrémité N qui interfère avec l’activation de RIPK3 médiée par ZBP1 dans les cellules humaines12,13,14,15. ZBP1 non seulement restreint la réplication virale, mais des études sur la souris ont montré que l’activation de ZBP1 provoque des maladies inflammatoires et stimule l’immunité contre le cancer 16,17,18,19,20,21. Les protocoles qui détectent les événements de signalisation se produisant pendant la nécroptose induite par ZBP1 dans les cellules humaines sont donc utiles pour évaluer le rôle de ZBP1 dans ces processus.
L’amplification du signal tyramide (TSA), également appelée dépôt de rapporteur catalysé (CARD), a été développée pour améliorer la limite de détection et le rapport signal sur bruit dans les immunoessais à base d’anticorps. Au cours de la TSA, n’importe quel anticorps primaire peut être utilisé pour détecter l’antigène d’intérêt. La peroxydase de raifort (HRP), couplée à un anticorps secondaire, catalyse l’accumulation locale de radicaux tyramide biotinylés en présence de peroxyde d’hydrogène. Ces radicaux biotine-tyramide activés réagissent ensuite avec les résidus de tyrosine proximale pour former des liaisons covalentes. Les substrats potentiels tyramide-biotine comprennent l’antigène lui-même, les anticorps primaires et secondaires et les protéines voisines. Ainsi, alors que la TSA améliore considérablement la sensibilité du test, une partie de sa résolution spatiale est perdue. Dans une dernière étape, les molécules de biotine sont détectées à l’aide de streptavidine marquée par fluorescence. La réaction HRP dépose de nombreuses molécules de tyramide-biotine sur ou à proximité de l’antigène d’intérêt. Cela augmente considérablement le nombre de sites de liaison streptavidine-fluorochrome, amplifiant ainsi considérablement la sensibilité du test (Figure 1). Alternativement, le tyramide peut être directement couplé à un fluorochrome, éliminant ainsi le besoin de fluorophores couplés à la streptavidine. L’immunohistochimie des protéines et l’hybridation in situ ADN/ARN ont été parmi les premières méthodes par lesquelles la TSA a été utilisée pour améliorer l’intensité du signal22,23. Plus récemment, la TSA a été combinée avec la cytométrie de flux intracellulaire24 et la spectrométriede masse 25.
Ici, nous présentons un protocole pour détecter la sérine 227 humaine phosphorylée RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) et la MLKL humaine phosphorylée (p-MLKL [S358]) lors de l’activation de ZBP1 par infection à HSV-1 par microscopie d’immunofluorescence. Nous utilisons une lignée cellulaire d’adénocarcinome colorectal humain HT-29 sensible à la nécroptose qui a été transduite pour exprimer de manière stable ZBP1 humain. Ces cellules ont été infectées par une souche HSV-1 exprimant une protéine mutante ICP6 (HSV-1ICP6 mutRHIM) dans laquelle quatre acides aminés centraux du RHIM viral (VQCG) ont été remplacés par des alanines (AAAA), rendant ainsi l’ICP6 incapable de bloquer la nécroptose médiée par ZBP113,14,15. Pour surmonter le problème du faible rapport signal/bruit des anticorps actuellement disponibles dans le commerce dirigés contre p-RIPK3 et p-MLKL dans l’immunomarquage26, nous effectuons une étape d’amplification du signal tyramide (TSA) (Figure 1), qui se traduit par une détection robuste de p-RIPK3 humain (S227) et améliore la sensibilité de détection du p-MLKL humain (S358) d’un ordre de grandeur.

<table><tbody><tr><td>Anticorps > <forts</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-lapin HRP</td><td>Agilent Technologies Belgique</td><td>K4002</td><td>Envision+ System-HRP Labellisé Polymère anti-lapin</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris DyLight 633</td><td>Thermofisher</td><td>35513</td><td>Anticorps sécundary</td></tr><tr><td>HSV-1 ICP0</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53070</td><td>Anticorps</td></tr> <tr><td>anti-ICP0(HSV-1) de sourisSérum de souris IAV-PR8</td><td>Production en interne</td><td>xx</td><td>Anticorps polyclonal anti-IAV-PR8</td></tr><tr><td>de souris pMLKL</td><td>Abcam</td><td>ab187091</td><td>Anticorps anti-MLKL-phospho S358 de lapin</td></tr><tr><td>pRIPK3</td><td>Abcam</td><td>ab209384</td><td>Anticorps anti-RIPK3-phospho S227 de lapin</td></tr><tr><td><fort>Fluorophores</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher</td><td>D21490</td><td>Visualiser le noyau des cellules</td></tr><tr><td>Streptavidine couplée à Alexa Fluor 568</td><td>Thermofisher</td><td>S11226</td><td>Pour visualiser les molécules de biotine</td></tr><tr><td><fortes>Composations</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 % H2O2</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>Substrat oxydant, nécessaire à l’activité HRP</td></tr><tr><td>4 % PFA</td><td>SANBIO</td><td>AR1068</td><td>Pour fixer/réticuler les cellules</td></tr><tr><td>Biotinyl-tyramide</td><td>R& D Systems</td><td>6241</td><td>Pour amplifier le signal, substrat HRP</td></tr><tr><td>BV-6</td><td>Selleckchem</td><td>S7597</td><td>BV6 Inhibiteur de l’IAP</td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Pour la culture cellulaire : pour détacher les cellules</td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>8,0 g/L de NaCl</td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>0,4 g/L de sel disodique d’EDTA</td></tr><tr><td>EDTA 0,04 %</td> <td>Formulation</td><td></td> maison <td>1,1 g/L de Na2HPO4</td></tr><tr><td> &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>0,2 g/L de NaH2PO4</td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>0,2 g/L de KCl</td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>0,2 g/L de glucose</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>TICO</td><td>FBS EU XXX</td><td>Pour la culture cellulaire, maintien de la culture cellulaire ; numéro de lot : 90439</td></tr><tr><td>GSK'840</td><td>Aobious</td><td>AOB0917</td><td>RIPK3 inhibiteur de kinase</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>Pour la culture cellulaire, maintien de la culture cellulaire</td></tr><tr><td>MAXblock</td><td>Active Motif</td><td>15252</td><td>Solution bloquante</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>10444402</tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>Pour la culture cellulaire, le maintien de la culture cellulaire</td></tr><tr><td>TNF-&alpha ;</td><td>Production en</td> <td>interne-Molécule</td> <td>de signalisation, capable de déclencher la mort cellulaire en combinaison avec BV6 et zVAD</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>Pour perméabiliser les cellules</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Merck</td><td>11732</td><td>Pour le comptage cellulaire, utilisé comme marqueur vivant/mort à 0,1 %</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4424</td><td>Pour la culture cellulaire : pour détacher les cellules</td></tr><tr><td>zVAD</td><td>Bachem</td><td>BACE4026865.0005</td><td>Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&micro ;-Slide 8 puits haut fond de verre</td><td>iBidi</td><td>80807</td><td>Pour cultiver les cellules</td></tr><tr><td>Coton Boules de présage-taille moyenne</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>71001-10</td><td>Pour nettoyer les objectifs</td></tr><tr><td>Immersol 518 F/30 &deg ; C</td><td>ZEISS</td><td>444970-9000-000</td><td>Pour visualiser l’échantillon à fort grossissement</td></tr><tr><td>Nettoyeur d’objectif</td><td>ZEISS</td><td>000000-0105-200</td><td>Pour nettoyer les objectifs</td></tr><tr><td>LSM880 Microscope</td><td></td><td></td> confocal Fast Airyscan <td>Pour visualiser l’échantillon</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Office xx</td><td></td><td>Pour traiter les données</td></tr><tr><td>Prism 9</td><td>Graphpad</td><td>xx</td><td>Pour analyser les données- tests statistiques et génération de graphiques</td></tr><tr><td>Volocité 6.3</td><td>Volocité</td><td>xx</td><td>Pour effectuer des quantifications</td></tr><tr><td>Zen noir</td><td>ZEISS</td><td>xx</td><td>Pour acquérir et traiter des images</td></tr><tr><td>Zen bleu</td><td>ZEISS</td><td>xx</td><td>Pour visualiser des images</td></tr><tr><td><forts>Virus</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>la souche F du HSV-1 (mutRHIM)</td><td>produite par le Dr Jiahuai Han</td><td>dans la réplication interne</td><td>du HSV-1 comme déclencheur de nécroptose ; Le domaine central RHIM d’UL39/ICP6 est muté (VQCG>AAAA)</td></tr><tr><td>HSV-1 (WT) souche F</td><td>produite par le Dr Jiahuai Han</td><td>dans la réplication en maison</td><td>HSV-1 (WT) en tant que contrôle négatif pour l’induction de la nécroptose (inhibition de l’ICP6)</td></tr><tr><td>IAV PR8</td><td>dans le stock domestique</td><td>en réplication interne</td><td>IAV comme déclencheur de nécroptose</td></tr></tbody></table>

amplification du signal tyramide pour la coloration immunofluorescente de la phosphorylation dépendante de zbp1 de ripk3 et mlkl après infection à hsv-1 dans des cellules humaines

Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

La kinase RIPK3 (RIPK3) qui interagit avec le récepteur de la kinase et son substrat mixte de type domaine kinase (MLKL) sont des régulateurs essentiels de la nécroptose, une forme inflammatoire de mort cellulaire ayant d’importantes fonctions antivirales. L’autophosphorylation de RIPK3 induit la phosphorylation et l’activation de la protéine bourreau formant les pores de la nécroptose MLKL. Le trafic et l’oligomérisation du MLKL phosphorylé au niveau de la membrane cellulaire entraînent une lyse cellulaire, caractéristique de la mort cellulaire nécroptotique. Le capteur d’acide nucléique ZBP1 est activé en se liant à l’ARN double brin (ARN-Z) gaucher de forme Z après infection par des virus à ARN et à ADN. L’activation de ZBP1 limite l’infection virale en induisant la mort cellulaire régulée, y compris la nécroptose, des cellules hôtes infectées. La microscopie par immunofluorescence permet de visualiser différentes étapes de signalisation en aval de la nécroptose médiée par ZBP1 sur une base cellulaire. Cependant, la sensibilité de la microscopie à fluorescence standard, utilisant actuellement des anticorps phospho-spécifiques disponibles dans le commerce contre RIPK3 et MLKL humains, empêche l’imagerie reproductible de ces marqueurs. Ici, nous décrivons une procédure de coloration optimisée pour la sérine (S) phosphorylée RIPK3 (S227) et MLKL (S358) dans les cellules humaines HT-29 infectées par le virus de l’herpès simplex 1 (HSV-1). L’inclusion d’une étape d’amplification du signal tyramide (TSA) dans le protocole de coloration immunofluorescente permet la détection spécifique de S227 phosphorylé RIPK3. De plus, la TSA augmente considérablement la sensibilité de la détection de MLKL phosphorylé S358. Ensemble, cette méthode permet de visualiser ces deux événements de signalisation critiques lors de l’induction de la nécroptose induite par ZBP1.

La détection par immunofluorescence de la phosphorylation MLKL et en particulier de la phosphorylation RIPK3 dans les cellules humaines est techniquement difficile26. Nous présentons ici un protocole de coloration amélioré pour p-RIPK3 (S227) et p-MLKL (S358) humains lors de l’activation de ZBP1. Le protocole comprend une étape TSA pour améliorer la limite de détection et la sensibilité des signaux fluorescents. Pour valider la méthode, une comparaison côte à côte de l’immunofluorescence médiée pa...

L’amplification du signal tyramide lors de la coloration par immunofluorescence permet la détection sensible de RIPK3 et MLKL phosphorylés lors de la nécroptose induite par ZBP1 après une infection à HSV-1.

Amplification du signal tyramide pour la coloration immunofluorescente de la phosphorylation dépendante de ZBP1 de RIPK3 et MLKL après infection à HSV-1 dans des cellules humaines

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

La visualisation robuste de RIPK3 et MLKL phosphorylés, deux événements de signalisation clés lors de l’induction de la nécroptose, a été techniquement difficile. Le protocole d’amplification tyramide présenté permet une détection sensible de ces deux molécules. L’étape d’amplification du signal abaisse le seuil de détection, permettant une détection robuste et reproductible des RIPK3 et MLKL phosphorylés.Commencez à ensemencer les 90 000 cellules HT-29 exprimant ZBP1 dans le milieu 5A de McCoy pleine puissance dans une plaque de puits d’une surface carrée d’un centimètre, permettant une microscopie haut de gamme. Utilisez un volume final de 200 microlitres par puits. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.Une fois que les cellules atteignent 70 à 80% de confluence, infectez les cellules dans 200 microlitres préchauffés, milieu 5A de McCoy contenant le virus de l’herpès simplex un, codant un mutant de bord ICP6 à une multiplicité d’infection de cinq. Incuber les cellules avec le virus pendant neuf heures pour induire la nécroptose. Comme contrôle positif de l’induction de la nécroptose, stimulez les cellules pendant quatre heures avec 200 microlitres de cocktail préchauffé induisant la nécroptose.Comme témoin négatif, ajoutez 22 microlitres de 10 micromolaires GSK840 préchauffés à 37 degrés Celsius pour inhiber l’activité de la kinase RIPK3. Inclure cet inhibiteur dans une condition non traitée et après la stimulation par nécroptose pour empêcher l’autophosphorylation de la sérine 227. Pour fixer les cellules, retirez le milieu et lavez les cellules avec 200 microlitres de PBS.Retirez ensuite le PBS et ajoutez 150 microlitres de paraformaldéhyde à 4% équilibré à température ambiante. Incuber les cellules à température ambiante pendant 30 minutes. Après la fixation, retirez le paraformaldéhyde à 4% et lavez les cellules trois fois avec 200 microlitres de PBS.Les échantillons peuvent être conservés en excès de PBS à quatre degrés Celsius pendant la nuit jusqu’à un traitement ultérieur. Retirer le PBS de la plaque et incuber les cellules avec 100 microlitres de tampon de perméation à température ambiante pendant 30 minutes sur un agitateur de laboratoire basculant. Après l’incubation, retirez le tampon de perméabilisation et lavez les cellules avec 100 microlitres de tampon de lavage.Incuber la chambre d’imagerie avec un tampon de lavage pendant cinq minutes à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant. Pour éviter la liaison non spécifique des anticorps primaires, incuber la plaque avec 100 microlitres de milieu bloquant à température ambiante pendant deux heures sur un agitateur de laboratoire basculant. Ensuite, lavez les puits trois fois avec 100 microlitres de tampon de lavage avec cinq minutes d’incubation à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.Après avoir retiré le tampon de lavage, ajoutez 100 microlitres d’anticorps primaires dans la chambre d’imagerie. Assurez-vous d’inclure une condition d’absence d’anticorps primaire pour visualiser le fond potentiel de l’amplification du signal tyramide et pour définir le seuil de masquage. Incuber la chambre pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Retirez le mélange d’anticorps primaires et lavez les puits trois fois avec 100 microlitres de tampon de lavage avec cinq minutes d’incubation à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant. Après avoir retiré le tampon de lavage, incuber les cellules avec 100 microlitres d’anticorps secondaire marqué HRP, en reconnaissant l’espèce de l’anticorps primaire à amplifier pendant 30 minutes sur un agitateur de laboratoire inclinable. Pendant l’incubation des anticorps, préparer le mélange de tyramide biotinylé.Pour déclencher l’activité enzymatique du HRP, ajouter un substrat oxydant au tampon TSA fraîchement avant utilisation. Diluer ensuite le tyramide biotinylé dans le tampon TSA préparé en utilisant la dilution optimisée. Après l’incubation avec un anticorps secondaire marqué HRP, laver les puits trois fois avec un tampon de lavage avec cinq minutes d’incubation sur un agitateur de laboratoire basculant.Après avoir retiré le tampon de lavage du puits, ajouter de la biotine-tyramide diluée au puits jusqu’à un volume final de 100 microlitres. Incuber la réaction à température ambiante pendant 10 minutes sur un agitateur de laboratoire basculant, suivi de trois lavages tampons de lavage. Préparer le mélange de coloration contenant l’anticorps secondaire, la streptavidine couplée et la coloration nucléaire et le tampon de lavage.Retirez le tampon de lavage et incuber la plaque avec 100 microlitres de mélange de coloration à température ambiante pendant une heure sur un agitateur de laboratoire basculant. Gardez les chambres d’imagerie à l’abri de la lumière à partir de cette étape. Après la coloration, laver deux fois consécutivement avec un tampon de lavage et rincer les puits deux fois avec du PBS.Conservez les échantillons en excès de PBS à quatre degrés Celsius pour préserver la coloration jusqu’à l’imagerie. La chambre d’imagerie est maintenant prête à être visualisée au microscope confocal. L’inclusion de l’amplification du signal tyramide a permis la détection robuste de RIPK3 phosphorylé à la sérine 227 dans le cytosol du virus de l’herpès simplex un codant pour une mutant de bord ICP6 cellules infectées.Une puissance laser de 2% était suffisante pour la détection sensible. Dans l’immunofluorescence indirecte standard, une puissance laser plus élevée est restée insuffisante pour la détection du phospho-RIPK3. Dans la quantification des images tridimensionnelles de la pile Z, les cellules infectées ont montré une augmentation d’environ 20 fois des voxels positifs pour RIPK3 phosphorylé par rapport aux cellules simulées traitées.L’augmentation de la coloration phospho-RIPK3 des cellules infectées par le virus de l’herpès simplex de type sauvage par rapport aux cellules simulées a indiqué que le domaine de bord de l’ICP6 est incapable de bloquer complètement la phosphorylation de RIPK3 à la sérine 227. GSK840 se lie au domaine kinase de RIPK3 et empêche la phosphorylation de RIPK3 à la sérine 227 lors de l’activation de ZBP1, confirmant la spécificité de la méthode de détection phospho-RIPK3 médiée par l’amplification du signal tyramide. Les cellules simulées traitées ont montré une coloration cytosolique faible en légère ponctuation de la phosphorylation MLKL à la sérine 358, tandis qu’une forte coloration a été détectée dans le cytosol, le noyau et la membrane plasmique des cellules infectées.L’immunofluorescence indirecte standard nécessitait une puissance laser de 40% pour la détection spécifique d’un signal phospho-MLKL dans les cellules infectées. En revanche, l’amplification du signal tyramide a augmenté la sensibilité de détection du phospho-MLKL, abaissant ainsi la puissance laser nécessaire à 6%La quantification de l’image Z-stack 3D a montré une augmentation d’environ 90 fois du nombre de voxels positifs pour phospho-MLKL en utilisant l’amplification du signal tyramide, par rapport à une multiplication par sept avec la méthode standard, indiquant une amélioration du seuil de détection et de la sensibilité pour phospho-MLKL. Semblable au virus de l’herpès simplex un, l’infection par le virus de la grippe A a déclenché une nécroptose dépendante de ZBP1.L’amplification du signal tyramide a permis la détection robuste de phospho-RIPK3 et phospho-MLKL, indiquant une nécroptose. Pour interpréter la coloration confocale, plusieurs contrôles de coloration doivent être inclus. Cela implique une condition non primaire, des taches uniques, ainsi qu’un contrôle positif.En adaptant ce protocole, plusieurs cibles peuvent être amplifiées à l’aide de TSA séquentielle. Cela permettrait la détection de RIPK3 et MLKL phosphorylés dans la même cellule. La détection sensible des biomarqueurs de la nécroptose peut être utile pour la recherche ZBP1 en cours sur l’auto-inflammation ou l’infection virale dans laquelle les voies de mort cellulaire dépendantes de ZBP1 exécutées doivent encore être confirmées comme nécroptose, apoptose ou pyroptose.

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Amplification du signal tyramide pour la coloration immunofluorescente de la phosphorylation dépendante de ZBP1 de RIPK3 et MLKL après infection à HSV-1 dans des cellules humaines (Vidéo) | JoVE Journal

Amplification du signal tyramide pour la coloration immunofluorescente de la phosphorylation dépendante de ZBP1 de RIPK3 et MLKL après infection à HSV-1 dans des cellules humaines

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