Système bicouche lipidique supporté par nanobar pour l’étude in vitro de protéines de détection de courbure membranaire

Ce système bicouche lipidique soutenu par nanobar peut être utilisé pour étudier le rôle de la courbure de la membrane dans la régulation de la dynamique et de la distribution des protéines et des lipides pendant les activités cellulaires. Cette technique offre à la fois une sous-racine élevée et une mauvaise dans la génération de courbure de la membrane en formant une bicouche lipidique continue sur des erreurs nanobar patentes avec une courbure de membrane prédéfinie par nanofabrication à haute résolution. Pour commencer, placez la nanopuce dans un bécher de 10 millilitres avec le côté du motif vers le haut.

Ajoutez soigneusement un millilitre d’acide sulfurique à 98% dans le bécher et assurez-vous que l’acide recouvre complètement l’avant et l’arrière de la puce. Faites tourner lentement le bécher et ajoutez 200 microlitres de peroxyde d’hydrogène à 30% goutte à goutte jusqu’à ce que tout le bécher devienne chaud. Assurez-vous que l’acide sulfurique et le peroxyde d’hydrogène sont bien mélangés pour former une solution de Piranha pour l’élimination des molécules organiques de la nanopuce.

Placez le bécher dans un récipient en verre secondaire et conservez la nanopuce immergée dans la solution Piranha pendant la nuit pour nettoyer soigneusement les impuretés. Sortez le bécher et pipettez soigneusement la solution de Piranha dans un récipient à déchets acides. Chargez cinq millilitres d’eau désionisée dans le bécher pour diluer l’acide résiduel et l’éliminer dans les déchets acides.

Répétez cette étape cinq fois. Prenez la puce avec une pince à épiler et lavez avec un jet continu d’eau désionisée pour éliminer complètement l’acide résiduel. Sécher la puce avec 99,9% d’azote gazeux pour la formation de SLB.

Soniquer le mélange lipidique pendant 30 minutes. Congeler le mélange lipidique dans de l’azote liquide pendant 20 secondes, puis décongeler à 42 degrés Celsius pendant deux minutes au bain-marie. Répétez les cycles de congélation/décongélation 30 fois.

Après cela, le mélange lipidique ressemble à un liquide clair. Passez le mélange lipidique à travers la mini extrudeuse et extrudez 20 fois d’avant en arrière. Récupérez les VUS de la seringue de l’autre côté pour réduire la contamination par des particules plus grosses ou des corps étrangers, et transférez-les dans un tube centrifuge de 1,5 millilitre.

Retirez soigneusement la nanopuce nettoyée de l’eau désionisée avec une pince à épiler et séchez-la avec 99,9% d’azote gazeux. Effectuez un nettoyage de surface de la nanopuce avec un traitement plasma à l’air pendant une heure. Assemblez la nanopuce dans une chambre PDMS.

Commencez par placer la puce sur une surface propre avec le motif vers le haut. Couvrez délicatement le PDMS central avec la puce et assurez-vous que l’ensemble du motif est exposé à la zone centrale de la grande ouverture ovale dans le PDMS central. Couvrez le PDMS supérieur avec le PDMS du milieu et gardez ses deux petits trous dans la région du grand trou ovale du PDMS du milieu.

Ensuite, la chambre PDMS est assemblée. Chargez les SUV dans le canal PDMS à partir de l’un des deux petits trous dans le PDMS supérieur avec une pipette et incuber pendant 15 minutes à température ambiante pour former le SLB. Pipeter doucement le tampon PBS dans le canal PDMS d’un côté du petit trou et retirer les déchets avec un coton-tige de l’autre trou pour laver les VUS non liés.

Acquérir ensuite le SLB formé sur la nano puce. Configurez la microscopie confocale à balayage laser à l’aide d’un objectif d’huile 100 x. Ouvrez le logiciel Zen pour sélectionner la puissance laser d’excitation qui peut exciter la fluorescence du lipide et de la protéine.

Choisissez Mode d’acquisition. Cliquez ensuite sur Smart Setup (Configuration intelligente), puis sur Texas Red (Texas Red). Ajustez la mise au point avec le bouton de mise au point pour localiser les nano barres sur la puce jusqu’à ce que les bords de la nano barre soient nets sous le canal lipidique.

Définissez les paramètres de balayage pour obtenir une image de contrôle du canal lipidique avant d’ajouter des protéines. Effectuer le test FRAP en blanchissant avec une bicouche lipidique marquée par fluorescence sur une seule zone nanobar aléatoire. Cochez les cases Régions d’expérience et Blanchiment.

Dessinez une zone circulaire de cinq micromètres de diamètre qui peut inclure l’ensemble de la nanobarre au centre, et ajouter aux régions expérimentales. Entrez les paramètres d’imagerie TimeLapse. Choisissez Séries chronologiques.

Cliquez ensuite sur Durée. Sélectionnez 100 cycles et intervalle égal à deux secondes. Paramètres de blanchiment d’entrée.

Activez les cases à cocher laser qui exécutent FRAP et modifiez l’alimentation à 100%Cliquez sur Démarrer l’expérience pour l’expérience FRAP. Chargez la solution protéique dans le canal PDMS et incuber pendant cinq minutes à température ambiante pour permettre la liaison de la protéine sur le SLB. Recentrez les nanobarres et réglez les paramètres de balayage pour prendre des images des canaux lipidiques et protéiques pour la détection de la courbure des protéines.

Sélectionnez les régions expérimentales et effectuez le test FRAP sur les canaux lipidiques et protéiques, et effectuez l’imagerie TimeLapse pour caractériser la mobilité de la protéine de détection de courbure. Les deux montrent une accumulation accrue à l’extrémité des nanobarres individuelles revêtues de SLB avec une largeur de 300 nanomètres. Ici, le SLB contient 10% de PS pour améliorer électrostatiquement la liaison aux protéines.

Les deux protéines ont un rapport extrémité / centre plus élevé que les lipides, qui est d’environ un. En comparant l’IDR FBP17 et le F-Bar, le rapport extrémité/centre supérieur de l’IDR FBP17 indique une détection de courbure plus forte que la F-Bar. Les trois protéines ont montré une accumulation préférentielle aux sites membranaires incurvés de l’extrémité nanobar lorsque la courbure a diminué en dessous de 400 nanomètres de diamètre.

Parmi ces trois domaines protéiques, IDR FBP17 donne la nano bar et la densité les plus élevées, indiquant sa plus forte capacité de détection de courbure, tandis que F-Bar montre la valeur la plus faible. La courbe de liaison aux protéines peut être tracée en augmentant progressivement la concentration en protéines, ce qui montre que IDR FBP17 a une forte capacité de détection de courbure coopérative. Par rapport à la récupération rapide des signaux lipidiques sur les nanobars, la barre F ne peut pas récupérer en deux minutes, ce qui suggère une diminution significative de la mobilité de la membrane et de la dynamique d’association aux sites membranaires incurvés.

Étonnamment, différents du comportement de F-Bar, les signaux IDR FBP17 ont montré une récupération évidente dans le même laps de temps, indiquant la nature dynamique de l’IDR FBP17 accumulé au niveau des membranes courbes. Cependant, après avoir éliminé l’IDR FBP17 non lié dans la solution, la même récupération dans le canal IDR FBP17 n’a pas pu être observée comme auparavant. La qualité SLB est très importante lors de l’étude de l’interaction entre la membrane incurvée et la protéine.

Le test FRAP est donc nécessaire dans notre expérience pour valider la mobilité de la membrane. Ce système aidera les chercheurs à étudier divers paramètres affectant l’interaction des protéines avec la membrane courbe, tels que les domaines de détection de la courbure et la composition lipidique, ainsi qu’à mener des études dynamiques sur la membrane incurvée telles que les comportements de séparation des visages.