Détection de cible basée sur des aptamères facilitée par une réaction d’amplification exponentielle isotherme G-quadruplex en 3 étapes
6 octobre 2022
Le présent protocole démontre l’utilisation d’un test d’amplification exponentielle rapide en 3 étapes, basé sur des aptamères, pour détecter des cibles. La préparation des échantillons, l’amplification du signal et le développement de la couleur sont couverts pour mettre en œuvre ce système afin de reconnaître la présence de théophylline par rapport à celle de la caféine.
Cette méthode offre un moyen d’amplifier le signal des événements de liaison sous une forme détectable visuellement pour une utilisation à faible ressource ou pouvant être quantifiée à l’aide d’une instrumentation basée sur l’absorbance. Il s’agit d’un protocole relativement rapide et unique pour déterminer la présence de la cible de l’aptamère dans un échantillon d’intérêt. Les résultats peuvent être comparés à une courbe d’étalonnage standard si une quantification est souhaitée.
Les individus doivent être très précis lors du transfert et du mélange des solutions, car un mélange insuffisant entraînera des résultats négatifs. Assurez-vous également que les réactifs et les solutions sont conservés au frais jusqu’à leur utilisation afin de minimiser le signal de fond. Commencez par activer les produits de clivage du ribozyme en ajoutant cinq unités de polynucléotide kinase T4 dans un tube de PCR.
Ensuite, ajoutez un microlitre de tampon ribozyme 5X pré-préparé à chaque tube d’échantillon. Pour démontrer visuellement la spécificité, ajoutez 1,5 microlitre de théophylline millimolaire ou deux millimolaires de caféine à chaque tube d’essai comme échantillons d’essai et mélangez soigneusement chaque échantillon en pipetant cinq à 10 fois. Ensuite, ajoutez deux microlitres de 600 nanomolaires d’ARN contenant un domaine aptamique spécifique à la cible à chaque tube d’échantillon, puis un pipetage pour mélanger rapidement les composants.
Maintenant, placez le tube sur un bloc froid pour minimiser le signal de fond. Après avoir préparé tous les tubes de réaction, incuber chaque échantillon à température ambiante pendant exactement trois minutes. À la fin de l’incubation, remettre immédiatement les tubes d’échantillon dans la glace.
Ajouter 3,5 microlitres de mélange enzymatique de polymérase nicase à chaque tube d’échantillon et bien mélanger. Ensuite, ajouter 31,5 microlitres de mélange réactionnel EXPAR contenant des nucléotides matrices et un tampon réactionnel à chaque tube d’échantillon et mélanger par pipetage. Une fois tous les échantillons préparés, incuber l’échantillon préparé à 55 degrés Celsius pendant cinq minutes à l’aide d’une minuterie.
Remettre immédiatement les tubes d’échantillon dans la glace après l’incubation. Ajouter deux microlitres de solution d’hémine à chaque tube d’échantillon pour le développement de la couleur et bien mélanger. Ensuite, ajoutez 58 microlitres de la solution TMB disponible dans le commerce à chaque tube d’échantillon, mélangez bien et incuber pour le développement de la couleur.
Lire les échantillons qualitativement à l’œil nu ou quantifier les résultats à l’aide d’un lecteur de plaque absorbante, comme décrit dans le manuscrit. La construction optimisée pourrait reconnaître aussi peu que 500 nanomolaires théophylline en 30 minutes. Les préparations d’échantillons exposées à la cible produisent une couleur bleue, tandis que les échantillons ne contenant aucune cible restent incolores.
Une courbe standard a été préparée à partir du signal mesuré à A450 après 30 minutes de développement des couleurs. Il est important de garder les échantillons sur la glace lorsque vous n’effectuez pas d’incubations, car même l’ARN optimisé présentera toujours un faible niveau d’activité de fond.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Ce protocole démontre un dosage d'amplification exponentielle rapide, en 3 étapes, basé sur les aptamères pour détecter des cibles comme la théophylline. Il couvre la préparation de l'échantillon, l'amplification du signal et le développement de la couleur.
Composants clés de l'étude
Domaine de la science
- Biochimie
- Chimie analytique
- Biotechnologie
Contexte
- Les aptamères sont de courtes molécules d'ARN ou d'ADN à simple brin qui peuvent se lier à des cibles spécifiques.
- L'amplification du signal est cruciale pour détecter les cibles à faible abondance.
- Les méthodes de détection visuelle peuvent être bénéfiques pour les environnements à ressources limitées.
- La manipulation précise des réactifs est essentielle pour obtenir des résultats précis.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode rapide pour détecter la théophylline par rapport à la caféine.
- Fournir un protocole en un seul pot pour l'amplification du signal.
- Permettre la quantification des résultats à l'aide d'une courbe d'étalonnage.
Méthodes utilisées
- Activation des produits de clivage des ribozymes avec la polynucléotide kinase T4.
- Détection visuelle des événements de liaison.
- Quantification à l'aide d'instrumentation basée sur l'absorbance.
- Mélange soigneux et refroidissement des réactifs pour minimiser le signal de fond.
Principaux résultats
- La méthode permet la détection de la théophylline dans les échantillons.
- Les résultats peuvent être interprétés visuellement ou quantifiés.
- La précision dans la manipulation des solutions est essentielle pour des résultats réussis.
- Les signaux de fond peuvent être minimisés avec une gestion appropriée des réactifs.
Conclusions
- L'essai basé sur les aptamères est une méthode rapide et efficace pour la détection des cibles.
- Il peut être adapté pour diverses applications dans des environnements à ressources limitées.
- Les études futures pourraient explorer d'autres cibles et l'optimisation du protocole.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Aptamer-based detection systems with isothermal exponential amplification offer rapid, sensitive, and visually interpretable outputs for target validation in early discovery workflows. This three-stage G-quadruplex amplification protocol enables both qualitative and quantitative readouts, supporting robust decision-making at the assay development and screening inflection points. The approach enhances predictive confidence for target engagement and specificity, directly impacting portfolio triage and downstream assay readiness.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of molecular recognition events using aptamer specificity.
- Supports functional validation of target binding through visually detectable outputs.
- Facilitates rapid assessment of target engagement for mechanistic de-risking.
- Improves confidence in target selectivity by distinguishing closely related analytes.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, one-pot protocol for reproducible assay setup.
- Delivers quantitative outputs via absorbance measurement for reliable compound evaluation.
- Enables rapid screening of samples with minimal instrumentation requirements.
- Supports calibration curve-based quantification for assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Offers potential for adaptation to disease-relevant biomarkers when supported by aptamer design.
- Maintains continuity from discovery to preclinical validation through scalable detection formats.
- Reduces risk of false positives by minimizing background signal with optimized protocols.
Pipeline & Workflow Integration
This aptamer-EXPAR system fits within the early discovery to lead identification continuum, providing a bridge from molecular recognition to quantitative assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by confirming target presence and specificity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for high-throughput or resource-limited settings.
- Analytics: Enables absorbance-based measurement and standard curve generation for comparative analysis.
- Translational Research: Can be adapted for biomarker detection if aptamer specificity is established.
- Enterprise Reuse: Protocol modularity allows adaptation to new targets by substituting aptamer domains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows with a rapid, standardized, and scalable protocol.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and capital-efficient assay development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, quantitative detection data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aptamer design and nucleic acid handling.
- Needs access to basic molecular biology instrumentation and absorbance plate readers for quantification.
- Demands precise reagent handling and temperature control to minimize background signal.
- Protocol can be adapted to different targets by modifying the aptameric domain.
- Careful optimization is necessary to ensure specificity and minimize false positives.
