Quantification et analyse basées sur la cytométrie en flux des cellules B myocardiques

La littérature rapporte des données contrastées sur la prévalence des cellules B myocardiques. Cela provient probablement de la variabilité des techniques de perfusion et de digestion. Notre protocole permet une analyse reproductible basée sur la cytométrie en flux sur les cellules B myocardiques.

Cette technique maximise le rendement de récupération des cellules B et réduit la variabilité du nombre de cytométrie en flux parmi les cellules B et d’autres populations à partir d’échantillons cardiaques. Cette méthode optimisée de digestion et d’isolement peut être facilement modifiée pour mettre en œuvre un panel d’anticorps étendu pour étudier différents types de cellules immunitaires dans le cœur. Le protocole peut également être appliqué à d’autres organes, tels que le poumon ou le foie, pour étudier les cellules B associées à ces organes.

Pour commencer, pesez une souris mâle de 12 semaines. Chargez une seringue à insuline de 310 cc avec 100 microlitres de la solution d’anticorps B220. Injecter l’anticorps B220 dilué par injection rétro-orbitale et procéder rapidement au prélèvement d’organes et à la perfusion.

Après l’euthanasie, tenez la peau de la souris avec une pince dans la région épigastrique. Faites une ouverture de deux millimètres dans la peau à l’aide de ciseaux et utilisez la pince pour décoller la peau afin de révéler la couche de fascia. Couper à l’épigastre à travers le fascia et le péritoine.

Serrez le processus xiphoïde à l’aide d’une pince hémostatique. Faites une coupe verticale à travers la paroi thoracique au niveau de la ligne mi-claviculaire de chaque côté et soulevez la paroi thoracique antérieure pour révéler le contenu du médiastin. Tenez fermement l’aorte par derrière à l’aide d’une pince.

Introduisez l’aiguille de la seringue dans l’apex du cœur. Perfusé avec trois millilitres de HBSS à raison de trois millilitres par minute. Coupez l’aorte et retirez le cœur.

Laver le cœur dans la boîte de Petri avec HBSS. Pesez le cœur isolé et notez le poids en milligrammes. Hacher le cœur à température ambiante en petits morceaux avec une lame.

Les pièces de cœur doivent avoir une taille d’environ 1,5 millimètre. Mesurez la masse de tissu cardiaque à l’aide d’une balance et placez 60 milligrammes du cœur émincé à digérer dans un tube de 15 millilitres sur de la glace avec trois millilitres de HBSS. Répétez ce processus pour une souris qui n’a pas reçu l’injection d’anticorps B220 et placez-la dans le tube avec trois millilitres de tissu témoin de référence marqué HBSS.

Ajouter des enzymes à chaque tube contenant des tissus hachés. Ajouter 0,5 microlitre par milligramme de DNase I, un 0,5 microlitre par milligramme de collagénase II et 0,2 microlitre par milligramme de hyaluronidase. Placez la réaction de digestion dans l’agitateur pendant 30 minutes à 300 rotations par minute.

Les tubes sont placés dans le shaker à un petit angle, environ 25 degrés d’inclinaison. Ajouter sept millilitres de HBSS à chacun des tubes de réaction de 15 millilitres et centrifuger à 250 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir décanté le surnageant, remettre en suspension chaque pastille dans cinq millilitres de tampon de lyse ACK.

Incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir ajouté 10 millilitres de PBS à chaque tube, mélanger et filtrer dans un tube de 50 millilitres avec une crépine de 40 micromètres. Écrasez tous les débris sur le filtre avec un piston de seringue pour vous assurer que tout le matériau passe à travers le filtre.

Après avoir ajouté du PBS à travers le filtre jusqu’à ce que le volume atteigne 25 millilitres par cœur, ajoutez 25 millilitres supplémentaires de PBS au tube de contrôle de référence et divisez le volume en deux tubes différents. Étiquetez l’un des tubes non taché et l’autre vivant/mort. Après centrifugation à 250 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, décanter le surnageant et remettre en suspension le tube non coloré dans 100 microlitres de PBS et chacun des autres granulés dans 100 microlitres de la solution de coloration vivante/morte.

Incuber sur la glace pendant 30 minutes dans l’obscurité. Après avoir ajouté 500 microlitres de tampon FACS à chaque échantillon, transférez-le dans un tube FACS à travers un filtre de 40 micromètres. Après avoir refusé les tubes FACS à 250 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeté le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon FACS.

Ajouter 50 microlitres de solution de blocage FC à chaque tube, à l’exception des tubes non colorés et vivants/morts. Mélanger et incuber pendant cinq minutes. Après avoir ajouté 50 microlitres de solution de mélange d’anticorps à chaque tube, à l’exception des tubes non colorés et vivants / morts, incuber pendant 30 minutes dans l’obscurité, en recouvrant le seau à glace de papier d’aluminium.

Comme pour la tache vivante/morte, laver à nouveau avec 500 microlitres de tampon FACS et remettre en suspension dans 300 à 500 microlitres de tampon FACS. Ouvrez le logiciel de contrôle de l’instrument. En haut de la fenêtre, sélectionnez l’onglet Acquisition et cliquez sur Nouveau.

Dans la section bibliothèque, dans le champ Type à filtrer, tapez PE, PerCP-Cy5.5, violet brillant 421, Alexa Fluor 700 et Zombie Aqua, sélectionnez le fluoro-4 et cliquez sur Ajouter après avoir tapé chacun. Ensuite, cliquez sur Suivant pour passer à l’onglet Groupes. Maintenant, cliquez sur le symbole avec un tube pour ajouter le cœur pour l’analyse.

Cliquez sur le groupe de référence et une fenêtre s’affichera. Dans la colonne des étiquettes fluorescentes, sélectionnez Zombie Aqua comme étiquette fluorescente, en supprimant toutes les autres en cliquant sur l’icône rouge corbeille à côté de chacune. Ensuite, dans l’icône Type de contrôle, sélectionnez Cellules.

Ensuite, cliquez sur Enregistrer. Cliquez sur Suivant. Cliquez ensuite sur l’onglet Marqueurs.

Un tableau s’affiche. Tapez le marqueur de cellule correspondant dans la première ligne de chaque colonne fluoro-4 et appuyez sur Entrée. Cliquez deux fois sur Suivant pour accéder à l’onglet Acquisition.

Dans Events To Record des échantillons expérimentaux, tapez 10 millions, et dans le même champ pour la ligne du groupe de référence, tapez 200 000. Cliquez sur Enregistrer et ouvrir. En bas à gauche, cliquez sur Contrôle des instruments.

Réglez la tension sur FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. Sélectionnez le contrôle d’acquisition. Pour l’option de débit, sélectionnez Élevé dans le menu déroulant.

Vortex le tube cardiaque non taché et placez-le solidement sur l’orifice d’injection de l’échantillon. Assurez-vous que la flèche verte de l’indicateur pointe vers le bon échantillon. Ensuite, cliquez sur Enregistrer et attendez que les événements soient enregistrés.

Faites de même pour le tissu cardiaque coloré vivant / mort. Sélectionnez le menu Unmix et définissez les commandes. Cochez la case Autofluorescence en tant qu’étiquette fluorescente.

Ensuite, cliquez sur Suivant pour passer à l’onglet Identifier les populations positives/négatives. Dans cet onglet, un graphique de la zone de diffusion vers l’avant par rapport à la zone de diffusion latérale sera affiché. Cliquez et faites glisser les points du polygone pour sélectionner une zone comprise entre 1 et 4 millions sur l’axe de la zone de diffusion vers l’avant et entre 0,2 et 3 millions sur l’axe de la zone de diffusion latérale.

Dans le tracé suivant à droite, V5-A sera affiché sur l’axe X. Déplacez les portes pour sélectionner la moitié du pic à l’extrême droite comme positif et une région sur le côté gauche du graphique comme négatif. Dans le graphique intitulé Groupe de référence - Non coloré, sélectionnez une population dans une plage similaire.

Pour les non-tachés, aucun positif/négatif ne doit être sélectionné. Cliquez sur le bouton Live Unmixing. Maintenant, acquérir les échantillons expérimentaux, vortex le tube et le placer solidement sur le SIP.

Assurez-vous que la flèche verte de l’indicateur pointe vers le bon échantillon. Cliquez ensuite sur Enregistrer dans le panneau Contrôle d’acquisition du logiciel du cytomètre et attendez que les événements soient enregistrés. Sélectionnez l’onglet Feuille de calcul non mélangée par défaut.

Créez un tracé FCS-A par rapport à SSC-A à l’aide de l’outil de tracé de points situé en haut. Sélectionnez les événements supérieurs à 0,4 million sur l’axe FSC-A et supérieurs à 0,8 million sur l’axe SSC-A à l’aide de l’outil de sélection de polygones. Créez un nouveau tracé en double-cliquant sur la sélection, et dans ce nouveau tracé, faites un clic droit sur l’étiquette de l’axe Y et sélectionnez la tache vivante/morte.

Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’étiquette de l’axe X et sélectionnez Autofluorescence A.Sélectionnez tous les événements inférieurs à 10 à la cinquième sur l’axe vivant/mort. Ce sont les cellules vivantes. Double-cliquez dans cette sélection.

Dans le nouveau tracé, sélectionnez PerCP-Cy5.5A pour l’axe X et SSC-A pour l’axe Y. Sélectionnez les populations du côté droit du PerCP-Cy5.5A. Ce sont les cellules immunitaires.

Double-cliquez sur la sélection. Sur le nouveau tracé, sélectionnez FSC-A pour l’axe X et la hauteur de diffusion vers l’avant pour l’axe Y. Sélectionnez les événements qui suivent une tendance dans laquelle la valeur FSC-A et la valeur SSC-A sont identiques.

Cela sélectionne les cellules individuelles et élimine les doublets. Double-cliquez sur cette sélection pour afficher un nouveau graphique dans la population unicellulaire CD45-positive. À partir du diagramme de population unicellulaire CD45 positif, sélectionnez violet brillant 421 sur l’axe des X par rapport à SSC-A sur l’axe des Y.

Sélectionnez la population à droite sur l’axe violet brillant 421. Il s’agit de la population de cellules B. Double-cliquez deux fois dans cette population pour créer deux nouveaux graphiques avec la population de cellules B.

Mettez en place le premier tracé de cellules B avec PEA sur l’axe X et violet brillant 421A sur l’axe Y. La population de droite correspond aux cellules B intervasculaires et la population de gauche représente les cellules B interstitielles. Sélectionnez les deux.

Configurez le deuxième tracé de cellules B avec Alexa Fluor 700A sur l’axe X et SSC-A sur l’axe Y. La population de gauche correspond aux cellules CD11b négatives, et les événements de droite correspondent aux cellules CD11b positives. Cliquez avec le bouton droit sur chaque section, puis cliquez sur Propriétés de la porte.

Cliquez sur Nombre et Parent pour afficher le nombre d’événements et les pourcentages des populations parentes. Consigner le nombre d’événements et les pourcentages pour une analyse plus approfondie des données. Après le retrait des doublets dans un cœur naïf non blessé, on s’attend à ce qu’environ 20% des cellules CD45-positives soient des cellules B CD19-positives.

Parmi ces cellules, en moyenne, 5,5% sont situées dans l’espace interstitiel. 94,5% sont dans l’espace intravasculaire. Sur l’ensemble de la population de cellules B trouvée dans le cœur, seulement environ 1,6% correspond aux cellules B1 basées sur le marqueur de surface CD11b et les 98,4% restants correspondent aux cellules B2.

Lors de l’analyse des cellules B myocardiques par cytométrie de flux, il est crucial de perfuser et de hacher le cœur correctement en suivant le protocole. Une bonne filtration du cœur digéré est également essentielle pour maximiser la récupération des cellules immunitaires.