Name: Quantification et analyse basées sur la cytométrie en flux des cellules B myocardiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T14:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: Apprenez une méthode de cytométrie en flux pour quantifier les lymphocytes B myocardiques avec un rendement de récupération amélioré. Ce protocole réduit la variabilité des comptages et s'adapte à d'autres organes comme le poumon ou le foie.

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Cette étude a été financée par les subventions NHLBI 5K08HLO145108-03 et 1R01HL160716-01 accordées à Luigi Adamo.
Le cytomètre en flux Aurora utilisé pour développer cette étude a été financé par la subvention NIH S10OD026859. Nous reconnaissons le soutien du JHU Ross Flow Cytometry Core.

Toutes les expériences décrites dans ce manuscrit ont été réalisées avec l’approbation de l’IACUC à la faculté de médecine de l’Université Johns Hopkins.
1. Préparatifs
<ol><li>Préparer le tampon FACS, tel que décrit dans le tableau 1.</li>
	<li>Assurez-vous qu’il y a suffisamment de CO2 pour euthanasier les animaux.</li>
	<li>Préparez l’espace de dissection (placez le paillasse et placez le ruban adhésif et les outils de dissection à proximité).</li>
	<li>Étiqueter les tubes de 15 mL, mettre 3 mL de HBSS avec du calcium et du magnésium dans chaque tube (voir le tableau des matières) et les placer sur de la glace (un tube par cœur et un tube supplémentaire pour le groupe de référence/témoins de cytométrie en flux). Remplissez également les petites boîtes de Petri (35 mm) avec HBSS.</li>
	<li>Allumez l’agitateur à température contrôlée, réglez-le à 37 °C et prérefroidissez la centrifugeuse à une température de 4 °C.</li>
	<li>Préparez la pompe à seringue et réglez le débit à 3 mL/min. Remplissez une seringue de 20 ml avec HBSS, amorcez la ligne du tube avec un tampon et enlevez les bulles.</li>
</ol>2. Coloration intravasculaire des lymphocytes B (in vivo)
<ol><li>Pesez une souris mâle de 12 semaines de la souche C57BL/6J. Charger une seringue à insuline 3/10 cc avec 100 μL de dilution de l’anticorps B220 (1:10, dans PBS). Couvrir la seringue avec du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière.</li>
	<li>Anesthésiez une souris.<ol><li>Appliquer une injection intrapéritonéale de 2% de 2,2,2-tribromoéthanol avec une dose de 400 mg / kg et attendre 10-20 min. REMARQUE: Surveillez la respiration et les mouvements de la souris. Une fois que la souris cesse de bouger, stimulez la douleur en pinçant l’orteil; L’absence de réflexe de retrait indique une anesthésie adéquate.</li>
		<li>Si une anesthésie adéquate n’est pas obtenue au cours des 20 minutes, une dose supplémentaire d’anesthésique à 100 mg / kg peut être administrée, et une évaluation de la cinétique de la souris, du réflexe de sevrage et de la respiration doit être effectuée toutes les 5 minutes.</li>
	</ol></li>
	<li>Placez la souris sur le banc de laboratoire sur un banc incliné d’un côté, tirez doucement vers le bas la peau du dos et appuyez légèrement le corps contre le banc pour faire saillir l’œil.</li>
	<li>Injecter l’anticorps B220 dilué de l’étape 2.1 par injection rétroorbitale.<ol><li>Introduisez la seringue dans l’œil à 45° du plan sagittal de la tête de la souris. Injectez lentement la solution. Si une résistance est ressentie, retirez la seringue et entrez à nouveau. Attendez 2 min. REMARQUE: Un temps d’incubation prolongé compromettrait la capacité de discriminer les cellules B intravasculaires et extravasculaires, car cela donnerait le temps à l’anticorps injecté de diffuser à l’extérieur du système vasculaire.</li>
	</ol></li>
	<li>Euthanasier la souris conformément aux règlements de l’IACUC.<ol><li>Ouvrez le débit de CO2 dans la chambre d’euthanasie à un débit de 0,5 L/min, ou le débit recommandé en fonction de la taille de votre chambre.</li>
		<li>Placez la souris dans la chambre pendant le temps recommandé, en vous assurant qu’elle ne respire plus. Retirez-le et effectuez une luxation cervicale comme méthode secondaire d’euthanasie.</li>
		<li>Une fois que la souris est euthanasiée, procédez rapidement au prélèvement d’organes et à la perfusion.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Collecte du cœur
<ol><li>Ouverture de la poitrine.<ol><li>Tenez la peau de la souris avec une pince dans la région épigastrique. Faites une ouverture de 2 mm dans la peau à l’aide de ciseaux et utilisez la pince pour décoller la peau afin de révéler la couche de fascia, une couche translucide brillante, de la poitrine et de l’abdomen. Couper à l’épigastre à travers le fascia et le péritoine pour ouvrir la paroi abdominale et révéler le processus xiphoïde. Serrez le processus xiphoïde à l’aide d’une pince hémostatique.</li>
		<li>Avec les ciseaux, faites une coupe verticale à travers la paroi thoracique au niveau de la ligne mi-claviculaire de chaque côté et soulevez la paroi thoracique antérieure pour révéler le contenu du médiastin, en utilisant des pinces hémostatiques comme poids pour maintenir l’ouverture.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusion et extraction cardiaques.<ol><li>À l’aide d’une pince, enlevez tout tissu adipeux ou thymique entourant le cœur.</li>
		<li>Tenez fermement l’aorte par derrière à l’aide d’une pince. Introduire l’aiguille de la seringue (25 G) dans l’apex du cœur. Perfuse avec 3 mL de HBSS à un débit de 3 mL/min. REMARQUE: Surveillez la perfusion. Le foie devrait se remplir et le sang dans les vaisseaux coronaires devrait être entièrement enlevé. L’utilisation d’une pompe à seringue calibrée à 1 mL / minute est recommandée pour maintenir un débit constant.</li>
		<li>Coupez l’aorte à l’aide de ciseaux et sortez le cœur. Lavez le cœur dans la boîte de Petri avec HBSS pour éliminer tout sang restant. À l’aide de ciseaux et de pinces, retirez la graisse, le tissu conjonctif et le thymus, et séchez le cœur. Pesez le cœur isolé et notez le poids en milligrammes. Hacher le cœur à température ambiante en petits morceaux (1-2 mm) avec une lame. REMARQUE: Les cœurs de souris adultes peuvent peser entre 0,090 et 0,210 mg.</li>
		<li>Mesurer la masse de tissu cardiaque et placer 60 mg du cœur émincé à digérer dans un tube de 15 mL avec 3 mL de HBSS. Conserver le tissu cardiaque restant et le placer dans un tube étiqueté « Tissu témoin de référence »; Cela sera utilisé pour le contrôle de compensation du signal mort-vivant et de l’autofluorescence.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Digestion cardiaque et coloration cellulaire
<ol><li>Ajouter des enzymes à chaque tube contenant du tissu haché (voir le tableau 1). Ajouter 0,5 μL / mg de DNase 1 (300 unités pour 60 mg de tissu cardiaque), 0,5 μL / mg de collagénase II (625 unités pour 60 mg de tissu cardiaque) et 0,2 μL / mg de hyaluronidase (50 unités pour 60 mg de tissu cardiaque) dans le tube.</li>
	<li>Placer la réaction de digestion dans l’agitateur pendant 30 min à 300 tr/min. Ajustez le rack du vibreur à environ 25° d’inclinaison.</li>
	<li>Ajouter 7 mL de HBSS à chacun des tubes de réaction de 15 mL et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 °C avec accélération et rupture réglées sur modérée ou lente. Décanter le surnageant et remettre en suspension chaque pastille dans 5 mL de tampon de lyse ACK pour éliminer les globules rouges. Incuber dans le tampon de lyse ACK pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de PBS dans chaque tube, mélanger, puis filtrer dans un tube de 50 mL avec une crépine de 40 μm. Assurez-vous que tous les débris sont à l’intérieur de la chambre filtrante. Écrasez tous les débris sur le filtre avec un piston de seringue jusqu’à ce qu’il soit complètement suspendu dans la chambre filtrante.</li>
	<li>Ajouter le PBS à travers le filtre jusqu’à ce que le volume atteigne 25 mL par cœur; Cela permettra aux cellules suspendues de passer à travers le filtre. Ajouter 25 mL supplémentaires de PBS au tube de tissu témoin de référence et diviser le volume en différents tubes (25 mL chacun). Étiquetez l’un des tubes « Unstained » et l’autre comme « Live-dead ». Centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 °C. NOTE: À ce stade, préparer la dilution pour la coloration morte vivante (dilution: 1:500 dans 1x PBS).</li>
	<li>Décanter le surnageant, remettre en suspension la pastille dans le tube non coloré dans 100 μL de PBS et chacune des autres pastilles dans 100 μL de la dilution de la tache morte vivante. Incuber sur la glace pendant 30 minutes dans l’obscurité, en recouvrant le seau à glace de papier d’aluminium.</li>
	<li>Ajouter 500 μL de tampon FACS à chaque échantillon et le transférer dans un tube FACS marqué à travers un filtre de 40 μm. Centrifuger les tubes FACS à 250 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans 500 μL de tampon FACS.</li>
	<li>Ajouter 50 μL de solution bloquante de Fc (voir tableau 1) dans chaque tube, à l’exception des tubes non colorés et morts-vivants. Mélanger et incuber pendant 5 min.</li>
	<li>Ajouter 50 μL de solution de mélange d’anticorps (voir le tableau 1) dans chaque tube, à l’exception des tubes non colorés et morts-vivants, et incuber pendant 30 minutes dans l’obscurité, en recouvrant le seau à glace de papier d’aluminium.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de tampon FACS dans chaque tube et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 300-500 μL de tampon FACS.</li>
</ol>5. Cytométrie de flux
<ol><li>Configurez les paramètres de contrôle des instruments. REMARQUE: Dans ce protocole, l’échantillon est analysé avec un cytomètre en flux Cytek Aurora à 4 lasers. Un autre cytomètre de flux approprié pourrait être utilisé pour détecter les marqueurs d’intérêt.<ol><li>Ouvrez le logiciel de contrôle de l’instrument (voir le tableau des matériaux). En haut de la fenêtre, sélectionnez l’onglet Acquisition et cliquez sur Nouveau +. Une fenêtre appelée Créer une nouvelle expérience s’affiche.</li>
		<li>Dans la section Bibliothèque, dans le champ Type à filtrer, tapez PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 et Zombie Aqua, cliquez sur Ajouter après avoir tapé chacun. Les noms fluorophores doivent être vus à droite. Cliquez ensuite sur Suivant pour passer à l’onglet Groupe .</li>
		<li>Dans l’onglet Groupe , cliquez sur le symbole avec un tube pour ajouter le cœur de l’analyse.</li>
		<li>Cliquez sur le groupe + Référence et une fenêtre s’affichera. Dans la colonne de balise fluorescente, sélectionnez Zombie Aqua, puis dans la colonne type de contrôle, sélectionnez Cellules, puis cliquez sur Enregistrer.</li>
		<li>Cliquez sur l’onglet Marqueurs > suivant ; Un tableau s’affichera avec les noms des fluorophores. Tapez le marqueur de cellule correspondant dans la première ligne de chaque colonne fluorophore et tapez Entrée: CD45 pour PerCP-Cy5.5; CD19 pour BV421; CD11b pour Alexa Fluor 700; B220 pour l’EP; et mort-vivant pour Zombie Aqua.</li>
		<li>Cliquez deux fois sur Suivant pour accéder à l’onglet Acquisition . Dans Events to Record du groupe d’expériences, tapez 10 000 000 et dans le même champ pour la ligne du groupe de référence, tapez 200 000. Cliquez sur Enregistrer et ouvrir. Les autres paramètres doivent rester définis par défaut, Temps d’arrêt à 10 000 et Arrêt du volume à 3 000.</li>
		<li>En bas à gauche, cliquez sur Contrôle de l’instrument. Réglez la tension sur FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. Ensuite, sélectionnez le contrôle d’acquisition. Pour l’option Débit (Débit), sélectionnez High (Élevé) dans le menu déroulant.</li>
	</ol></li>
	<li>Acquérir des échantillons de référence à l’aide d’un cytomètre et les démélanger dans un logiciel.<ol><li>Vortex le tube cardiaque non coloré et placez-le solidement sur l’orifice d’injection de l’échantillon (SIP). Assurez-vous que la flèche verte de l’indicateur pointe vers le bon échantillon, puis cliquez sur Démarrer dans le panneau Contrôle d’acquisition du logiciel du cytomètre et attendez que les événements soient enregistrés. Faites de même pour le tissu cardiaque coloré vivant.</li>
		<li>Sélectionnez le menu Unmix et définissez les commandes suivantes :<ol><li>Cochez les cases PE, PerCP-Cy5.5, BV421 et Alexa Fluor 700 dans la colonne de la bibliothèque. Assurez-vous que Zombie Aqua n’est pas coché dans la même colonne. En bas, cochez l’option Autofluorescence en tant que balise fluorescente.</li>
			<li>Cliquez sur Suivant pour passer à l’onglet Identifier les populations positives/négatives . Dans cet onglet, un graphique de FSC-A vs SSC-B-A sera affiché. Cliquez et faites glisser les points du polygone pour sélectionner une zone comprise entre 1,0 M et 4,0 M sur l’axe FSC-A et entre 0,2 M et 3,0 M sur l’axe SSC-B-A.</li>
			<li>Dans le tracé suivant à droite, V5-A sera affiché sur l’axe X. Déplacez les portes pour sélectionner la moitié du pic à l’extrême droite comme positif et une région sur le côté gauche du graphique comme négatif. Dans le graphique intitulé Groupe de référence - Non coloré, sélectionnez une population dans une fourchette similaire. Pour cela, le non coloré n’a pas de positif-négatif doit être défini.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Acquérir des échantillons expérimentaux.<ol><li>Pour chaque tube contenant un échantillon pour une souris individuelle, vortex le tube et placez-le solidement sur le SIP. Assurez-vous que la flèche verte de l’indicateur pointe vers le bon échantillon, puis cliquez sur Démarrer dans le panneau Contrôle d’acquisition du logiciel du cytomètre et attendez que les événements soient enregistrés.</li>
	</ol></li>
	<li>Stratégie de contrôle.<ol><li>Sélectionnez l’onglet Feuille de calcul non mélangée par défaut . Créez un tracé FSC-A par rapport à SSC-A à l’aide de l’outil Tracé par points situé en haut. Sélectionnez des événements supérieurs à 0,4 M sur l’axe FSC-A et supérieurs à 0,8 M sur l’axe SSC-A à l’aide de l’outil de sélection Polygone. Double-cliquez dans cette sélection et un nouveau tracé s’affichera.</li>
		<li>Dans le tracé nouvellement créé, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’étiquette de l’axe X et sélectionnez AF-A ; cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’étiquette de l’axe Y et sélectionnez Coloration vivante. Cliquez sur l’outil de sélection du rectangle en haut et sélectionnez tous les événements inférieurs à 105 sur l’axe mort-vivant qui correspondent au signal vivant-mort inférieur. Double-cliquez dans cette sélection et un nouveau tracé s’affichera.</li>
		<li>Dans le nouveau tracé, cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner PerCP-Cy5.5-A pour l’axe X et SSC-A pour l’axe Y. À l’aide de l’outil de sélection de rectangle, sélectionnez les événements supérieurs à 104 sur l’axe PerCP-Cy5.5-A qui correspondent aux cellules CD45 positives. Double-cliquez sur la sélection et un nouveau tracé s’affichera.</li>
		<li>Sur le nouveau tracé, cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner FSC-A pour l’axe X et FSC-H pour l’axe Y. À l’aide de l’outil de sélection Polygone, sélectionnez les événements qui suivent une tendance sur laquelle la valeur FSC-A et la valeur SSC-A sont identiques ; avec cela, les doublets cellulaires seront retirés et la population de la sélection sera appelée population CD45+. Double-cliquez sur la sélection pour afficher une nouvelle parcelle avec la population CD45+.</li>
		<li>À partir du diagramme de la population CD45+, cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner BV421 sur l’axe X par rapport à SSC-A sur l’axe Y. À l’aide de l’outil de sélection Polygone, sélectionnez la population à droite sur l’axe BV421 . Il s’agit de la population de cellules B. Double-cliquez deux fois dans cette population pour créer deux nouveaux graphiques avec la population de cellules B.<ol><li>Cliquez avec le bouton droit de la souris pour configurer le premier tracé de cellules B avec PE-A sur l’axe X et BV421-A sur l’axe Y. La population de droite correspond aux cellules B intravasculaires, et la population de gauche représente les cellules B interstitielles. Utilisez l’outil de sélection Polygone pour effectuer une sélection des deux.</li>
			<li>Cliquez avec le bouton droit de la souris pour configurer le deuxième tracé de cellules B avec Alexa Fluor 700-A sur l’axe X et SSC-A sur l’axe Y. La population de gauche correspond aux cellules CD11b- et les événements de droite (le cas échéant) correspondent aux cellules CD11b+.</li>
			<li>Cliquez avec le bouton droit sur chaque sélection, puis cliquez sur Propriétés de la porte. Cliquez sur Nombre et % Parent pour afficher les tailles et les pourcentages. Consigner le nombre d’événements et les pourcentages pour une analyse plus approfondie des données.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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Luigi Adamo est co-fondateur de i-Cordis, LLC, une société axée sur le développement de molécules immunomodulatrices pour le traitement de l’insuffisance cardiaque, avec un intérêt particulier pour les dérivés du médicament modulateur des cellules B pirfenidone. Les autres auteurs n’ont aucun conflit à déclarer.

Un nombre croissant de preuves indique que les cellules B jouent un rôle important dans le contexte de la physiologie myocardique et du remodelage/adaptation myocardique aux blessures 7,8,9,10,11,12,13,36. La cytométrie en flux est un excellent outil pour é...

Les lymphocytes B sont des cellules immunitaires hautement spécialisées qui jouent un rôle important dans les réponses immunitaires adaptatives et innées1. Il existe deux populations principales de cellules B : une plus petite population de cellules B1 qui sont principalement produites au cours de la vie embryonnaire, et une population prépondérante de cellules B2 qui sont produites à l’âge adulte dans la moelle osseuse1. Après avoir mûri dans la moelle osseuse, les cellules B migrent vers les organes lymphoïdes primaires et secondaires. De là, ils recirculent continuellement entre les organes lymphoïdes voyageant à travers les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques2. Les cellules B expriment des anticorps spécifiques à leur surface, qui fonctionnent comme des récepteurs. Lorsque les cellules B rencontrent un antigène qui se lie à leur récepteur, un signal d’activation peut être déclenché. Les lymphocytes B activés migrent vers le tissu où l’antigène a été trouvé ou retournent dans la moelle osseuse où ils peuvent devenir des plasmocytes producteurs d’anticorps 3,4.
Récemment, il a été reconnu que le cœur abrite une population importante de cellules B. Des études chez les rongeurs ont montré que les lymphocytes B colonisent le cœur au début du développement embryonnaire5, et que les lymphocytes B associés au myocarde sont pour la plupart intravasculaires, des cellules B2 naïves adhérant à l’endothélium6,7, avec un faible pourcentagede cellules B17. Il existe encore de nombreuses zones d’incertitude, mais les données disponibles indiquent que les cellules B jouent un rôle important à la fois dans le cœur naïf et dans le contexte de l’adaptation myocardique aux blessures.
Des études sur le cœur murin naïf ont montré qu’au départ, les cellules B myocardiques sont principalement situées dans l’espace intravasculaire, adhèrent à l’endothélium (>95% des cellules B cardiaques murines se sont avérées être situées dans l’espace intravasculaire). On a constaté que ces cellules B avaient des schémas d’expression génique différents de ceux des cellules B circulantes isolées du sang périphérique. L’analyse des cœurs naïfs d’animaux déficients en lymphocytes B et de témoins syngéniques a révélé que les animaux dépourvus de lymphocytes B avaient des cœurs plus petits et une fraction d’éjection6 plus élevée. Toutes ces preuves suggèrent que les cellules B pourraient moduler la croissance myocardique et / ou la fonction myocardique, et que non seulement les cellules B interstitielles mais aussi intravasculaires pourraient être responsables de ces observations. Les cellules B ont également été trouvées pour moduler le phénotype des macrophages résidents du myocarde8.
Plusieurs études ont montré que les lymphocytes B jouent un rôle important dans le contexte de l’adaptation myocardique aux lésions 8,9,10,11,12,13. Les lymphocytes B s’accumulent transitoirement dans le cœur blessé, probablement par un mécanisme dépendant de CXCL13-CXCR511,13. À partir de là, les cellules B favorisent le remodelage cardiaque indésirable par plusieurs mécanismes, dont le recrutement demonocytes médiés par les cytokines 9,12. En outre, les cellules B peuvent produire des anticorps contre les protéines cardiaques qui peuvent favoriser l’extension des lésions cardiaques et du remodelage cardiaque indésirable par plusieurs mécanismes 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . Les cellules B peuvent également exercer des effets protecteurs sur le cœur blessé par la sécrétion d’IL-1010.
Alors que le nombre de groupes étudiant le rôle des cellules B dans le cœur naïf et blessé augmente, il devient de plus en plus important de définir des protocoles partagés pour quantifier et évaluer correctement les cellules B myocardiques et ainsi éviter les incohérences qui ont déjà commencé à apparaître dans la littérature. Jusqu’à présent, les cellules B ont en fait été signalées comme étant l’une des cellules immunitaires les plus répandues dans le cœur des rongeurs7 et présentes à une prévalence nettement inférieure à celle des cellules myéloïdes26,27, ou assez rares 28. De même, plusieurs groupes ont décrit que le nombre de lymphocytes B myocardiques augmente après une lésion myocardique ischémique aiguë 7,9,13, mais un groupe n’a signalé aucun changement dans le nombre de lymphocytes B du myocarde29 lésé. Les études sur les cellules immunitaires cardiaques donnent rarement des détails sur les conditions de perfusion et il n’y a pas de consensus sur les conditions de digestion. Étant donné que dans le cœur de rongeur, une grande proportion de cellules B sont intravasculaires et que l’extraction des cellules immunitaires du myocarde dépend fortement de la méthode de digestion utilisée, les différences rapportées dans la littérature pourraient être le résultat de différences dans la perfusion d’organes et la digestion tissulaire.
Présenté ici est une méthode détaillée pour la quantification basée sur la cytométrie de flux des cellules B myocardiques murines qui maximise le rendement de la récupération des cellules B en optimisant les conditions de perfusion et de digestion et permet la discrimination des cellules B myocardiques intravasculaires vs extravasculaires6. Ce protocole est une adaptation et une optimisation d’autres protocoles similaires qui distinguent les cellules immunitaires intravasculaires et interstitielles 28,30,31.
Dans ce protocole, nous normalisons la perfusion myocardique pour éliminer les cellules B flottant dans l’espace intravasculaire sans éliminer les cellules B biologiquement pertinentes adhérant à l’endothélium microvasculaire. De plus, en nous appuyant sur des protocoles antérieurs qui ont décrit l’utilisation de l’injection intraveineuse d’anticorps pour distinguer les cellules immunitaires intravasculaires des cellules immunitaires interstitielles32, et en tirant parti du fait que les cellules B expriment le marqueur de surface B22033, nous démontrons comment distinguer les cellules B myocardiques intravasculaires des cellules B extravasculaires par injection intravasculaire d’un anticorps spécifique B220 immédiatement avant le sacrifice animal et la perfusion cardiaque. Ce protocole est pertinent pour la recherche de tout scientifique intéressé à inclure l’analyse des cellules B myocardiques dans le cœur naïf et blessé. La mise en œuvre généralisée de ce protocole réduira les incohérences entre les groupes de recherche, permettra l’analyse des changements dans les pools de lymphocytes B myocardiques intravasculaires et extravasculaires, et renforcera ainsi l’avancement des découvertes dans le domaine de l’immunologie cardiaque.
En résumé, le protocole représente un flux de travail optimisé pour quantifier et analyser les cellules B myocardiques via la cytométrie en flux, tout en distinguant les cellules situées dans l’espace extravasculaire et l’espace intravasculaire.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 700 anti-souris/humain CD11b Anticorps</td><td>101222</td><td>BioLegend</td><td>100 &micro ; g 200 & micro ; L</td></tr><tr><td>(CellTreat 29481) Passoire à cellules, 40 & micro ; m, Blue</td><td>QBIAP303</td><td>Southern Labware</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL Tube de microcentrifugation naturel</td><td>1605-0000</td><td>SealRite, USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>0,9 % Chlorure de sodium injectable, USP</td><td>114-055-101</td><td>Qualité Biologique</td><td>0,90</td></tr> % <tr><td>1,5 mL Tube de microcentrifugation naturel</td><td>1615-5500</td><td>SealRite, USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro ; L Pointes Filtres TipOne Graduées</td><td>11213810</td><td>USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro ; L Pointes filtrantes graduées TipOne</td><td>11267810</td><td>USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger de 15 ml, capuchon d’étanchéité à bouchon, polypropylène, vanne d’arrêt à 1 voie sans RNase-/DNase</td><td>430052</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>, polycarbonate</td><td>SVPT951</td><td>ECT Manufacturing</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-tribromoéthanol</td><td>T48402</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro ; L Pointes filtrantes graduées TipOne</td><td>11208810</td><td>Vanne</td> d’arrêt à 3 voies USA Scientific<td></td></tr><tr><td>, polycarbonate</td><td>SVPT953</td><td>ECT Tube</td><td></td></tr> à <tr><td>fond rond en polystyrène de 5 ml, 12 x 75 mm style</td><td>352054</td> Falcon, un tube à centrifuger de 50 ml <td>de marque</td><td></td>Corning</tr><tr><td>, capuchon à joint bouchon, polypropylène, sans RNase-/DNase</td><td>430290</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>ACK ( Tampon de lyse d’ammonium-chlorure-potassium)</td><td>118-156-101</td><td>Osmolalité biologique de qualité</td><td>: 290 + ou -5 % mOsm/kg H20</td></tr><tr><td>Adaptateur 4x50ml, pour seau rectangulaire de 250 mL dans le rotor A-4-63</td><td>5810759005</td> Adaptateur <td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>pour tubes à centrifuger de 15 mL, 9 tubes par adaptateur, fond conique pour utilisation avec le rotor modèle A-4-62</td><td>22638289</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur pour 15 tubes à fond rond 2,6 &ndash ; 7 ml, pour seau rectangulaire de 250 ml dans le rotor A-4-62</td><td>22638246</td> Feuille d’aluminium <td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Rouleau de 12 po x 75' .0007</td><td>Chambre d’induction UPC 109153</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia - Souris</td><td>RWD-AICMV-100</td><td>Conduct Science</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer Slip Tip Seringue avec aiguille attachée 25 G x 5/8 po, stérile, à usage unique, 1 mL</td><td>309626</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>Seringues à insuline ultra-fines Brandzig 29G 1cc 1/2" 100-Pack</td><td>CMD 2613</td><td>Brandzig</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-souris CD19</td><td>Anticorps 115537</td><td>BioLegend</td><td>50 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>CAPS pour tubes d’écoulement avec maille de crépine 35 & micro ; m, Double position pour tubes de 12 x 75 mm, stérile</td><td>T9009</td><td>Southern Labware</td><td></td></tr><tr><td>Dioxyde de carbone USP E CGA 940&nbsp ;</td><td>CD USPE</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Essentials Bécher Low-Form, Verre, 500 mL</td><td>UX-34502-46</td><td>Cole-Parmer</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 2</td><td>LS004176</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Connecteur laiton chromé 1/4 » femelle NPT x 1/4 » barbelé</td><td>Y992611-AG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Cytek Aurora Cytomètre</td><td></td> en Flux <td>Cytek Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Diss 1080 Mamelon 1/4 BARB CP</td><td>M-08-12</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>DNase I - 40,000 U</td><td>D4527</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Easypet&nbsp ; 3 - Contrôleur de pipette électronique</td><td>4430000018</td> balance électronique <td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>, AX223/E</td><td>30100606</td><td>Ohaus Corp.</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Eppendorf 5810R</td><td>5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes variables Eppendorf Research plus 1 canal</td><td>Eppendorf</td><td></td>FlowJo 10.8.1 BD Becton, Dickinson and Company GLACIERbrand, triple densité Ice Pan (IPAN-3100)Z740287 Heathrow Scientific HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]14025076 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>gibco</td><td>1x</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>H3506</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Kelly Hemostats, droit</td><td>13018-14</td><td>Fine Science Tools</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Luer Slip stérile, à usage unique, 20 mL</td><td>302831</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940</td><td>M1-940-PG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>McKesson Underpads, modéré</td><td>4033- CS150</td><td>McKesson</td><td></td></tr><tr><td>Navigator Balance portable polyvalente</td><td>NV2201</td><td>Ohaus Corp.</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]</td><td>10010023</td><td>gibco</td><td>1x</td></tr><tr><td>PE anti-souris/humain CD45R/B220 Anticorps</td><td>103208</td><td>BioLegend</td><td>200 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD45 de souris PerCP/Cyanine5.5</td><td>103132</td><td>BioLegend</td><td>100 &micro ; g 500 uL</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri, empilable 35 mm x 10 mm Polystyrène stérile</td><td>FB0875711YZ</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Pkgd : Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02</td><td>M08-1</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Puissant 6 watts LED double illuminateur à col de cygne</td><td>LED-6W</td><td>Aiguille AmScope</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide 25 g x 5/8 (0,5 mm x 16 mm)</td><td>305122</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-souris purifiée CD16/CD32 (souris BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)</td><td>553141</td><td>BD Becton, Dickinson and Company Biosciences</td><td>0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>R 4.1.1</td><td></td><td>The R Foundation</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>9501250000</td><td>Accutec Blades Inc</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur analytique en deux étapes 0-25 psi Administration CGA320 3500 psi</td><td>Y12244A320-AG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Rotor A-4-62, avec 4 godets rectangulaires de 250 mL</td><td>Rotor A-4-62</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique, bouchée, 10 mL, stérile, apyrogène/exempte d’endotoxines, non cytotoxique, 1 pièce(s)/blister</td><td>86.1254.001</td><td>Sarstedt AG & Co KG</td><td></td></tr><tr><td>Ruban d’étiquette Sigma</td><td>L8394</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>SpectroFlo 3.0.0</td><td></td><td>Cytek Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Spex VapLock Luer Fitting, PP, droit, mâle Luer Lock x 1/8 » Tuyau cannelé ; 1/EA</td><td>MTLL230-6005</td><td>Spex</td><td></td></tr><tr><td>Std Tube de laboratoire, taille S2, Excelon, 1/8 » ID x 3/16 » OD x 1/32 » Wall x 50' Long</td><td>CG-730-003</td><td>Excelon Laboratory</td><td></td></tr><tr><td>Seringue PP/PE sans aiguille, 3 mL</td><td>Z683566</td><td>Pompe à seringue Millipore Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>55-1199 (95-240)</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Minuterie d’alarme à 3 canaux TM10500</td><td>9371W13</td><td>Thomas</td><td></td></tr><tr><td>Scientific Tube Rack, 12&nbsp ; positions, 6 pour 5,0 mL et 15&nbsp ; tubes mL et 6 pour 25&nbsp ; mL et 50&nbsp ; Tubes mL, polypropylène, positions numérotées, autoclavable</td><td>30119835</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Tube Rack, 12&nbsp ; positions, pour 5.0&nbsp ; mL et 15&nbsp ; Tubes mL, polypropylène, positions numérotées, autoclavable</td><td>30119827</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>TYGON R-3603 Tube de laboratoire, D.I. & fois ; D.E. 1/4 po & fois ; 3/8 po</td><td>T8913 (Millipore Sigma)</td><td>Tygon, Saint-Gobain</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>SI-0236</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Pince à dissection VWR avec goupille de guidage à pointes incurvées</td><td>89259-946</td><td>Avantor, par VWR</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection VWR, pointe acérée, 4&frac12 ; "</td><td>82027-578</td><td>Avantor, par VWR</td><td></td></tr><tr><td>VWR Incubating Orbital Shaker, modèle 3500I</td><td>12620-946</td><td>Avantor, par VWR</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua Fixable Viability</td><td>Kit 423102</td><td>BioLegend</td><td></td></tr></tbody></table>

quantification et analyse basées sur la cytométrie en flux des cellules b myocardiques

Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

Un nombre croissant de preuves montre que les lymphocytes B jouent un rôle important dans le contexte de la physiologie myocardique et de l’adaptation myocardique aux blessures. Cependant, la littérature rapporte des données contrastées sur la prévalence des cellules B myocardiques. Il a été rapporté que les cellules B étaient à la fois parmi les cellules immunitaires les plus répandues dans le cœur des rongeurs ou qu’elles étaient présentes, mais à une prévalence nettement inférieure à celle des cellules myéloïdes, ou qu’elles étaient assez rares. De même, plusieurs groupes ont décrit que le nombre de cellules B myocardiques augmente après une lésion myocardique ischémique aiguë, mais un groupe n’a signalé aucun changement dans le nombre de cellules B du myocarde lésé. La mise en œuvre d’une méthode partagée et reproductible pour évaluer la prévalence des lymphocytes B myocardiques est essentielle pour harmoniser les observations des différents groupes de recherche et ainsi favoriser l’avancement de l’étude des interactions myocardiques des lymphocytes B. D’après notre expérience, les observations apparemment contrastées rapportées dans la littérature proviennent probablement du fait que les cellules B myocardiques murines sont principalement intravasculaires et connectées à l’endothélium microvasculaire. Par conséquent, le nombre de cellules B récupérées dans un cœur murin est extrêmement sensible aux conditions de perfusion utilisées pour nettoyer l’organe et à la méthode de digestion utilisée. Nous rapportons ici un protocole optimisé qui tient compte de ces deux variables critiques d’une manière spécifique. Ce protocole permet une analyse reproductible basée sur la cytométrie en flux du nombre de cellules B myocardiques murines et permet aux chercheurs de distinguer les cellules B myocardiques extravasculaires des cellules B intravasculaires.

Une fois l’acquisition terminée et tous les événements collectés, les données doivent être analysées conformément à la pratique standard de cytométrie en flux. L’objet de l’analyse variera en fonction de l’objectif individuel de chaque expérience. Dans ce cas, la quantification des cellules B intravasculaires et extravasculaires a été poursuivie, et elle a été exprimée en nombre de cellules par mg de tissu.
Lors de l’utilisation d’un cytomètre spectral, il est recommandé de commencer l’analyse...

Nous rapportons ici un protocole pour la quantification et la différenciation des lymphocytes B myocardiques en fonction de leur emplacement dans l’espace intravasculaire ou endothélial en utilisant la cytométrie de flux.

Quantification et analyse basées sur la cytométrie en flux des cellules B myocardiques

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

La littérature rapporte des données contrastées sur la prévalence des cellules B myocardiques. Cela provient probablement de la variabilité des techniques de perfusion et de digestion. Notre protocole permet une analyse reproductible basée sur la cytométrie en flux sur les cellules B myocardiques.Cette technique maximise le rendement de récupération des cellules B et réduit la variabilité du nombre de cytométrie en flux parmi les cellules B et d’autres populations à partir d’échantillons cardiaques. Cette méthode optimisée de digestion et d’isolement peut être facilement modifiée pour mettre en œuvre un panel d’anticorps étendu pour étudier différents types de cellules immunitaires dans le cœur. Le protocole peut également être appliqué à d’autres organes, tels que le poumon ou le foie, pour étudier les cellules B associées à ces organes.Pour commencer, pesez une souris mâle de 12 semaines. Chargez une seringue à insuline de 310 cc avec 100 microlitres de la solution d’anticorps B220. Injecter l’anticorps B220 dilué par injection rétro-orbitale et procéder rapidement au prélèvement d’organes et à la perfusion.Après l’euthanasie, tenez la peau de la souris avec une pince dans la région épigastrique. Faites une ouverture de deux millimètres dans la peau à l’aide de ciseaux et utilisez la pince pour décoller la peau afin de révéler la couche de fascia. Couper à l’épigastre à travers le fascia et le péritoine.Serrez le processus xiphoïde à l’aide d’une pince hémostatique. Faites une coupe verticale à travers la paroi thoracique au niveau de la ligne mi-claviculaire de chaque côté et soulevez la paroi thoracique antérieure pour révéler le contenu du médiastin. Tenez fermement l’aorte par derrière à l’aide d’une pince.Introduisez l’aiguille de la seringue dans l’apex du cœur. Perfusé avec trois millilitres de HBSS à raison de trois millilitres par minute. Coupez l’aorte et retirez le cœur.Laver le cœur dans la boîte de Petri avec HBSS. Pesez le cœur isolé et notez le poids en milligrammes. Hacher le cœur à température ambiante en petits morceaux avec une lame.Les pièces de cœur doivent avoir une taille d’environ 1,5 millimètre. Mesurez la masse de tissu cardiaque à l’aide d’une balance et placez 60 milligrammes du cœur émincé à digérer dans un tube de 15 millilitres sur de la glace avec trois millilitres de HBSS. Répétez ce processus pour une souris qui n’a pas reçu l’injection d’anticorps B220 et placez-la dans le tube avec trois millilitres de tissu témoin de référence marqué HBSS.Ajouter des enzymes à chaque tube contenant des tissus hachés. Ajouter 0,5 microlitre par milligramme de DNase I, un 0,5 microlitre par milligramme de collagénase II et 0,2 microlitre par milligramme de hyaluronidase. Placez la réaction de digestion dans l’agitateur pendant 30 minutes à 300 rotations par minute.Les tubes sont placés dans le shaker à un petit angle, environ 25 degrés d’inclinaison. Ajouter sept millilitres de HBSS à chacun des tubes de réaction de 15 millilitres et centrifuger à 250 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir décanté le surnageant, remettre en suspension chaque pastille dans cinq millilitres de tampon de lyse ACK.Incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir ajouté 10 millilitres de PBS à chaque tube, mélanger et filtrer dans un tube de 50 millilitres avec une crépine de 40 micromètres. Écrasez tous les débris sur le filtre avec un piston de seringue pour vous assurer que tout le matériau passe à travers le filtre.Après avoir ajouté du PBS à travers le filtre jusqu’à ce que le volume atteigne 25 millilitres par cœur, ajoutez 25 millilitres supplémentaires de PBS au tube de contrôle de référence et divisez le volume en deux tubes différents. Étiquetez l’un des tubes non taché et l’autre vivant/mort. Après centrifugation à 250 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, décanter le surnageant et remettre en suspension le tube non coloré dans 100 microlitres de PBS et chacun des autres granulés dans 100 microlitres de la solution de coloration vivante/morte.Incuber sur la glace pendant 30 minutes dans l’obscurité. Après avoir ajouté 500 microlitres de tampon FACS à chaque échantillon, transférez-le dans un tube FACS à travers un filtre de 40 micromètres. Après avoir refusé les tubes FACS à 250 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeté le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon FACS.Ajouter 50 microlitres de solution de blocage FC à chaque tube, à l’exception des tubes non colorés et vivants/morts. Mélanger et incuber pendant cinq minutes. Après avoir ajouté 50 microlitres de solution de mélange d’anticorps à chaque tube, à l’exception des tubes non colorés et vivants / morts, incuber pendant 30 minutes dans l’obscurité, en recouvrant le seau à glace de papier d’aluminium.Comme pour la tache vivante/morte, laver à nouveau avec 500 microlitres de tampon FACS et remettre en suspension dans 300 à 500 microlitres de tampon FACS. Ouvrez le logiciel de contrôle de l’instrument. En haut de la fenêtre, sélectionnez l’onglet Acquisition et cliquez sur Nouveau.Dans la section bibliothèque, dans le champ Type à filtrer, tapez PE, PerCP-Cy5.5, violet brillant 421, Alexa Fluor 700 et Zombie Aqua, sélectionnez le fluoro-4 et cliquez sur Ajouter après avoir tapé chacun. Ensuite, cliquez sur Suivant pour passer à l’onglet Groupes. Maintenant, cliquez sur le symbole avec un tube pour ajouter le cœur pour l’analyse.Cliquez sur le groupe de référence et une fenêtre s’affichera. Dans la colonne des étiquettes fluorescentes, sélectionnez Zombie Aqua comme étiquette fluorescente, en supprimant toutes les autres en cliquant sur l’icône rouge corbeille à côté de chacune. Ensuite, dans l’icône Type de contrôle, sélectionnez Cellules.Ensuite, cliquez sur Enregistrer. Cliquez sur Suivant. Cliquez ensuite sur l’onglet Marqueurs.Un tableau s’affiche. Tapez le marqueur de cellule correspondant dans la première ligne de chaque colonne fluoro-4 et appuyez sur Entrée. Cliquez deux fois sur Suivant pour accéder à l’onglet Acquisition.Dans Events To Record des échantillons expérimentaux, tapez 10 millions, et dans le même champ pour la ligne du groupe de référence, tapez 200 000. Cliquez sur Enregistrer et ouvrir. En bas à gauche, cliquez sur Contrôle des instruments.Réglez la tension sur FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. Sélectionnez le contrôle d’acquisition. Pour l’option de débit, sélectionnez Élevé dans le menu déroulant.Vortex le tube cardiaque non taché et placez-le solidement sur l’orifice d’injection de l’échantillon. Assurez-vous que la flèche verte de l’indicateur pointe vers le bon échantillon. Ensuite, cliquez sur Enregistrer et attendez que les événements soient enregistrés.Faites de même pour le tissu cardiaque coloré vivant / mort. Sélectionnez le menu Unmix et définissez les commandes. Cochez la case Autofluorescence en tant qu’étiquette fluorescente.Ensuite, cliquez sur Suivant pour passer à l’onglet Identifier les populations positives/négatives. Dans cet onglet, un graphique de la zone de diffusion vers l’avant par rapport à la zone de diffusion latérale sera affiché. Cliquez et faites glisser les points du polygone pour sélectionner une zone comprise entre 1 et 4 millions sur l’axe de la zone de diffusion vers l’avant et entre 0,2 et 3 millions sur l’axe de la zone de diffusion latérale.Dans le tracé suivant à droite, V5-A sera affiché sur l’axe X. Déplacez les portes pour sélectionner la moitié du pic à l’extrême droite comme positif et une région sur le côté gauche du graphique comme négatif. Dans le graphique intitulé Groupe de référence - Non coloré, sélectionnez une population dans une plage similaire.Pour les non-tachés, aucun positif/négatif ne doit être sélectionné. Cliquez sur le bouton Live Unmixing. Maintenant, acquérir les échantillons expérimentaux, vortex le tube et le placer solidement sur le SIP.Assurez-vous que la flèche verte de l’indicateur pointe vers le bon échantillon. Cliquez ensuite sur Enregistrer dans le panneau Contrôle d’acquisition du logiciel du cytomètre et attendez que les événements soient enregistrés. Sélectionnez l’onglet Feuille de calcul non mélangée par défaut.Créez un tracé FCS-A par rapport à SSC-A à l’aide de l’outil de tracé de points situé en haut. Sélectionnez les événements supérieurs à 0,4 million sur l’axe FSC-A et supérieurs à 0,8 million sur l’axe SSC-A à l’aide de l’outil de sélection de polygones. Créez un nouveau tracé en double-cliquant sur la sélection, et dans ce nouveau tracé, faites un clic droit sur l’étiquette de l’axe Y et sélectionnez la tache vivante/morte.Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’étiquette de l’axe X et sélectionnez Autofluorescence A.Sélectionnez tous les événements inférieurs à 10 à la cinquième sur l’axe vivant/mort. Ce sont les cellules vivantes. Double-cliquez dans cette sélection.Dans le nouveau tracé, sélectionnez PerCP-Cy5.5A pour l’axe X et SSC-A pour l’axe Y. Sélectionnez les populations du côté droit du PerCP-Cy5.5A. Ce sont les cellules immunitaires.Double-cliquez sur la sélection. Sur le nouveau tracé, sélectionnez FSC-A pour l’axe X et la hauteur de diffusion vers l’avant pour l’axe Y. Sélectionnez les événements qui suivent une tendance dans laquelle la valeur FSC-A et la valeur SSC-A sont identiques.Cela sélectionne les cellules individuelles et élimine les doublets. Double-cliquez sur cette sélection pour afficher un nouveau graphique dans la population unicellulaire CD45-positive. À partir du diagramme de population unicellulaire CD45 positif, sélectionnez violet brillant 421 sur l’axe des X par rapport à SSC-A sur l’axe des Y.Sélectionnez la population à droite sur l’axe violet brillant 421. Il s’agit de la population de cellules B. Double-cliquez deux fois dans cette population pour créer deux nouveaux graphiques avec la population de cellules B.Mettez en place le premier tracé de cellules B avec PEA sur l’axe X et violet brillant 421A sur l’axe Y. La population de droite correspond aux cellules B intervasculaires et la population de gauche représente les cellules B interstitielles. Sélectionnez les deux.Configurez le deuxième tracé de cellules B avec Alexa Fluor 700A sur l’axe X et SSC-A sur l’axe Y. La population de gauche correspond aux cellules CD11b négatives, et les événements de droite correspondent aux cellules CD11b positives. Cliquez avec le bouton droit sur chaque section, puis cliquez sur Propriétés de la porte.Cliquez sur Nombre et Parent pour afficher le nombre d’événements et les pourcentages des populations parentes. Consigner le nombre d’événements et les pourcentages pour une analyse plus approfondie des données. Après le retrait des doublets dans un cœur naïf non blessé, on s’attend à ce qu’environ 20% des cellules CD45-positives soient des cellules B CD19-positives.Parmi ces cellules, en moyenne, 5,5% sont situées dans l’espace interstitiel. 94,5% sont dans l’espace intravasculaire. Sur l’ensemble de la population de cellules B trouvée dans le cœur, seulement environ 1,6% correspond aux cellules B1 basées sur le marqueur de surface CD11b et les 98,4% restants correspondent aux cellules B2.Lors de l’analyse des cellules B myocardiques par cytométrie de flux, il est crucial de perfuser et de hacher le cœur correctement en suivant le protocole. Une bonne filtration du cœur digéré est également essentielle pour maximiser la récupération des cellules immunitaires.

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