Mesures de type potentiel d’action induite par laser de cardiomyocytes sur des réseaux de microélectrodes pour une prédictivité accrue de la pharmacologie de sécurité

Cette méthode permet d’enregistrer les potentiels d’action intracellulaires sur les AME traditionnels, permettant ainsi une meilleure description de la forme de l’AP et une classification plus sensible des potentiels pro-arythmiques. Par rapport aux enregistrements de potentiel de champ typiques, la forme potentielle réelle intracellulaire fournit plus d’informations sur l’autorisation précise des canaux ioniques sous-jacents. Lorsqu’elle est appliquée aux cardiomyocytes dérivés de patients cliniques grâce à la technologie des cellules souches, la méthode peut contribuer au diagnostic causal et à la personnalisation de C R P et de maladies cardiaques comme les arythmies Notre technicienne, Karin Gebhardt, fera la démonstration de la culture des cardiomyocytes.

Pour commencer à enduire les champs d’électrodes des MEA précédemment autoclavés, Dropwise avec de la fibronectine en utilisant une pipette de 10 microlitres sous la hotte à flux laminaire. Pour réduire le choc osmotique, transférer la solution de placage goutte à goutte pendant 90 secondes dans le tube de 50 millilitres contenant les cardiomyocytes décongelés. Ajouter doucement huit millilitres de fluide de placage dans le tube et mélanger soigneusement la suspension cellulaire.

À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, retirez le surnageant, en veillant à ne pas jeter la pastille et ajustez le numéro de cellule à la concentration finale. Avant l’assise de la cellule, retirez la solution de revêtement appliquée de la zone de l’électrode MEA à l’aide d’une pipette de 10 microlitres. Pour éviter le séchage de l’ensemencement de revêtement, les cellules immédiatement en ajoutant quatre microlitres des cellules goutte à goutte sur les champs d’électrodes pour les deux, six puits MEA et un puits M E A.Maintenant, laissez les cellules adhérer aux puits pendant une heure à 37 degrés Celsius, et 5% de dioxyde de carbone.

Sous la hotte à flux laminaire, ajouter 200 microlitres et un millilitre de milieu de placage stérile chauffé à 37 degrés Celsius pour six MEA puits et MEA à puits unique respectivement. Pour les enregistrements MEA, placez le système MEA sur le dessus de l’appareil avec le support de puce MEA centré sur le trou de l’objectif. Ensuite, laissez le laser se concentrer sur les électrodes en positionnant la configuration MEA, de sorte que l’objectif soit directement sous le trou du système MEA.

Pour permettre aux cellules de récupérer de la perturbation mécanique, transférez la puce MEA avec les cellules cultivées de l’incubateur à la configuration MEA 15 minutes avant l’enregistrement. Ensuite, nettoyez soigneusement les coussinets de contact et les broches, en utilisant un écouvillon d’isopropanol pour diminuer les niveaux de bruit. Placez soigneusement le MEA dans la configuration MEA et positionnez la puce MEA à six puits avec le numéro de série visible sur le côté droit ou une puce MEA à un seul puits avec l’électrode de référence à gauche.

Maintenant, réglez le chauffage intégré du système MEA à 38 degrés Celsius. Fermez le couvercle de l’appareil car l’interrupteur de sécurité intégré ne permet d’activer le laser que si le couvercle est fermé sur la puce MEA. À l’aide du programme de configuration MEA, réglez le filtre du système MEA passe-haut et passe-bas sur 0,1 hertz ou moins et 3 500 hertz respectivement.

Utilisez le logiciel MC rack ou tout autre logiciel pour l’enregistrement. Ajustez la plage d’entrée en fonction de l’expérience. S’assurer que le signal ne sature pas l’amplificateur et la fréquence d’échantillonnage.

Utilisez la fonction d’affichage à long terme du logiciel pour vérifier l’enregistrement. Après avoir inséré la puce MEA dans la configuration MEA et configuré le logiciel, initialisez la mécanique laser à l’aide du logiciel FB ALP. Maintenant, cliquez sur le bouton d’initialisation.

À la fin de l’initialisation, le point laser virtuel sera dans le puits D pour un MEA à six puits et en bas à gauche pour un MEA à un seul puits respectivement. Ensuite, à l’aide de la touche de contrôle avec un clic de souris, déplacez le point laser virtuel au milieu de l’électrode D five et ajustez la mise au point en maintenant la touche de contrôle enfoncée et en faisant défiler avec la molette de la souris. Vous pouvez également utiliser la fonction de mise au point automatique.

Appuyez sur le jeu de boutons P un, et le point laser virtuel se déplacera automatiquement dans le puits F.Le système est maintenant aligné. Ajustez la puissance du laser et le temps de traitement en fonction des exigences expérimentales. Pour activer le laser, cliquez sur le bouton d’arrêt laser qui apparaîtra comme laser activé, Basculez vers le logiciel d’enregistrement.

Choisissez un nom de fichier et cliquez sur le bouton d’enregistrement rouge suivi du bouton de lecture en haut de la fenêtre pour enregistrer la mesure. Avant d’ouvrir les cellules avec le laser, enregistrez une ligne de base pendant 60 secondes. Revenez au logiciel d’initialisation et désactivez les électrodes à exclure par le laser sur la carte virtuelle sur le côté droit de la fenêtre du logiciel.

Pour démarrer le laser, utilisez Alt clic de souris et sélectionnez l’électrode centrale de ce puits. Cela initie le laser pour ouvrir automatiquement les cellules sur chaque électrode de ce puits, répéter pour chaque puits pour ouvrir toutes les électrodes précédemment activées de ce puits sélectionné. Dissoudre d’abord la concentration millimolaire de Nifedipine E-40 31 et de Dofetilide dans le DMSO, puis dans un milieu complet jusqu’à 10 fois la concentration souhaitée.

Ne jamais dépasser une concentration finale de DMSO de 0,1 % dans le puits. Enregistrez l’activité de base pendant 60 secondes. Démarrez la peration induite par laser comme démontré précédemment, entraînant une transformation du FPS en liAP.

Appliquez tous les médicaments en concentration unique par puits. Retirer 20 microlitres et 100 microlitres de milieu par puits de six MEA puits et puits unique respectivement. Ajouter 20 microlitres ou 100 microlitres de la solution mère de médicament à mesurer au puits.

Selon le type de MEA, et pipeter soigneusement de haut en bas deux à trois fois. Laissez les composés se laver pendant 300 secondes. Pendant ce temps, la forme liAP peut se transformer en forme FP.

Encore une fois, peration induite par laser et enregistrer les défauts induits par les composés possibles sur le liAP pendant 60 secondes supplémentaires. L’ajout de nifédipine a réduit la phase de plateau des LIAP d’une manière dépendante de la concentration, et a ainsi raccourci l’ensemble du LiAP. Ce raccourcissement était comparable aux potentiels de champ des cardiomyocytes à partir d’électrodes non manipulées.

E-40 31 a inhibé la repolarisation des canaux potassiques KV un point 11 pertinents et a conduit au comportement arythmique des cardiomyocytes à des concentrations accrues. En outre, E-40 31 a augmenté la durée de la liAP d’une manière dépendante de la concentration. À la fin du liAP, de petites déviations de tension positives ont été observées à 0,1 micromolaire qui sont devenues plus importantes avec des concentrations plus élevées, indiquant une nouvelle dépolarisation transitoire appelée EAD.

À la concentration la plus élevée de 0,1 micromolaire, ces EAD ont augmenté au fil du temps en battements ectopiques. Qui sont des potentiels d’action prématurée. L’EAD et les battements ectopiques sont des indicateurs clés de l’activité proarythmique.

Et à la fin, l’activité électrique entraîne des battements arythmiques. Les relations concentration-réponse étaient corrélées avec les enregistrements FP et liAP. De plus, en présence de dofétilide, le FP et le liAP affichaient des durées d’environ deux secondes dans le même puits, la forme d’onde FP présentait des déviations de repolarisation régulières.

Alors que dans le liAP EAD sont détectables. Il est important d’ajuster la mise au point avant chaque melomen car une image de microscope floue pourrait affecter l’ouverture des cellules. En outre, le potentiel d’action est pris peu de temps après que l’opterperation doit être utilisée pour l’analyse.

Cette technique est plus sensible dans la détection des effets arythmiques antérieurs par rapport à l’AME standard, ce qui permet de détecter plus précisément les effets indésirables des composés.