Name: Mesures de type potentiel d’action induite par laser de cardiomyocytes sur des réseaux de microélectrodes pour une prédictivité accrue de la pharmacologie de sécurité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Découvrez l'enregistrement de potentiels d'action intracellulaires sur réseaux de microélectrodes par porosation laser pour améliorer la classification des effets proarythmiques sur cardiomyocytes.

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Les auteurs tiennent à remercier Foresee Biosystems pour avoir prêté le système IntraCell au cours des études. Ils tiennent également à remercier Hae In Chang pour son assistance technique. Ce travail a reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 964518 (ToxFree), du programme du Conseil européen de l’innovation Horizon Europe, du projet SiMulTox (convention de subvention n° 101057769) et du ministère d’État du Bade-Wurtemberg pour les affaires économiques, le travail et le tourisme.

1. Préparation induite de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes
REMARQUE : Les cardiomyocytes2 iCell (appelés cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites [CSPi]) ont été préparés conformément au protocole fourni par le fournisseur. Le protocole sera brièvement résumé dans la section suivante.
<ol><li>Décongeler et maintenir le milieu à 4 °C pendant 24 h avant utilisation.</li>
	<li>Préparer l’enrobage de fibronectine en dissolvant la fibronectine stérile dans de l’eau stérile à une concentration de 1 mg/mL. Congeler stocker ce matériel dans des aliquotes (p. ex. 25 μL par aliquote). Diluer la solution mère aliquote 1:20 dans la solution saline équilibrée stérile de Dulbecco (dPBS).</li>
	<li>Enduisez les champs d’électrodes des AME précédemment autoclavés sous la hotte à flux laminaire, gouttelettes dans des conditions stériles, avec de la fibronectine à l’aide d’une pipette de 10 μL. Pour cela, déposez 5 μL de la solution d’enrobage de fibronectine sur les champs d’électrodes et observez la formation d’une gouttelette au-dessus de la zone de l’électrode. Assurez-vous de ne pas toucher les électrodes sensibles. REMARQUE: Pour maintenir des conditions stériles, transférez la puce MEA dans une boîte de Petri stérile avant de la retirer de la hotte à flux laminaire.</li>
	<li>Incuber les AME enrobés pendant 1 h à 37 °C dans un incubateur de préférence.</li>
	<li>Décongeler le cryovial contenant les cardiomyocytes dans un bain-marie à environ 37 °C pendant 2 min jusqu’à ce qu’il ne reste plus qu’un peu de cristal de glace. Transférer doucement la solution cellulaire dans un tube de 50 mL.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de milieu de placage au cryovide vide. Transférer la solution goutte à goutte sur une période de 90 s dans le tube de 50 ml pour réduire le choc osmotique. Ajouter doucement 8 ml supplémentaires de milieu de placage dans le tube.</li>
	<li>Mélanger soigneusement la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette de 10 mL. Calculer le nombre total de cellules viables à l’aide de la cytométrie de fluorescence automatisée. Le nombre doit être proche du nombre figurant dans la fiche technique fournie par le fabricant.</li>
	<li>Faire tourner la solution cellulaire vers le bas pendant 3 min à 200 x g à température ambiante. Retirer le surnageant par aspiration à l’aide d’une pipette en verre fixée à un système de pompage. Ajustez le nombre de cellules entre 6 000 et 15 000 cellules viables/μL. REMARQUE: Le nombre de cellules est généralement dans la plage indiquée ci-dessus, mais peut varier en fonction du fournisseur respectif.</li>
	<li>Retirer la solution de revêtement qui a été appliquée à l’étape 1.3 de la zone de l’électrode MEA à l’aide d’une pipette de 10 μL directement avant l’ensemencement cellulaire. Ensemencer les cellules immédiatement après le retrait pour éviter le dessèchement de l’enrobage. Pour cela, ensemencez les cellules goutte à goutte à 4 μL pour les MEA à 6 puits et les MEA à 1 puits sur les champs d’électrodes de la même manière qu’avec le revêtement.</li>
	<li>Laisser les cellules adhérer pendant 1 h dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 avant de remplir les puits avec le milieu de placage stérile chauffé à environ 37 °C à 200 μL pour le MEA à 6 puits et 1 mL pour le MEA à puits unique sous la hotte à flux laminaire.</li>
	<li>Effectuer un changement complet de milieu 48 h après le placage sous la hotte à flux laminaire. Pour cela, retirez le fluide de placage par aspiration à l’aide d’une pipette en verre fixée à un système de pompage. Ensuite, ajouter 200 μL de milieu d’entretien stérile chauffé à 37 °C dans les puits.</li>
	<li>Effectuez des changements de milieu complets tous les deux jours.</li>
	<li>Commencez à mesurer les cellules 5 à 8 jours après la décongélation. Effectuer un changement de milieu complet 2 h avant de commencer les expériences.</li>
</ol>2. Enregistrements MEA
REMARQUE: Le dispositif utilisé pour transformer le signal FP en liAP se compose d’un microscope vertical et d’un laser de 1064 nm.
<ol><li>Placez le système MEA sur le dessus de l’appareil avec le support de puce MEA centré sur le trou de l’objectif. Positionnez la configuration MEA de manière à ce que l’objectif soit directement sous le trou du système MEA pour permettre au laser de se concentrer sur les électrodes.</li>
	<li>Transférer la puce MEA avec les cellules cultivées de l’incubateur à la configuration MEA 15 min avant l’enregistrement, permettant aux cellules de récupérer de la perturbation mécanique.</li>
	<li>Nettoyez soigneusement les coussinets de contact et les épingles à l’aide d’isopropanol et d’un coton-tige pour réduire les niveaux de bruit. Placez soigneusement le MEA dans la configuration MEA. Positionnez la puce MEA avec le logo en bas en haut à gauche (MEA à 6 puits) ou avec l’électrode de référence à gauche (MEA à puits unique).</li>
	<li>Réglez le chauffage intégré au système MEA à 38 °C. Placez une petite chambre au-dessus de la puce MEA pour perfuser constamment les cellules avec du carbogène humidifié (5% CO 2 et 95% O2) pour recréer les conditions de l’incubateur et empêcher l’évaporation.</li>
	<li>Fermez le couvercle de l’appareil. L’interrupteur de sécurité intégré ne permet d’activer le laser que si le couvercle est fermé sur la puce MEA. Définissez le filtre système MEA à l’aide du programme de configuration MEA sur 0,1 Hz ou moins passe-haut et 3 500 Hz passe-bas.</li>
	<li>Utilisez le logiciel MC_Rack (logiciel d’enregistrement) ou tout autre logiciel d’enregistrement. Ajustez la plage d’entrée en fonction de vos besoins en vous assurant que le signal ne sature pas l’amplificateur et la fréquence d’échantillonnage (par exemple, 20 kHz). Utilisez la fonction d’affichage à long terme du logiciel pour vérifier l’enregistrement.</li>
</ol>3. Poration cellulaire induite par laser
<ol><li>Après avoir inséré la puce MEA dans la configuration MEA et configuré le logiciel, initialisez la mécanique laser à l’aide du logiciel FB Alps (logiciel d’initialisation).</li>
	<li>Tout d’abord, cliquez sur le bouton Initialisation . À la fin de l’initialisation, le point laser virtuel sera dans le puits D pour un MEA à 6 puits et en bas à gauche pour un MEA à un seul puits, respectivement.</li>
	<li>Déplacez le point laser virtuel avec Ctrl + clic de souris au milieu de l’électrode D5 et ajustez la mise au point. Ajustez la mise au point par Ctrl + défilement avec la molette de la souris.</li>
	<li>Appuyez sur le bouton Set P1. Le point laser virtuel se déplacera automatiquement dans le puits F. Répétez le processus avec l’électrode F5 et sélectionnez Set P2.</li>
	<li>Après cette procédure, le point laser se déplacera dans le puits B. Répétez le même processus avec l’électrode B5 et appuyez sur Set P3 dans le logiciel. Le système est maintenant aligné.</li>
	<li>Ajustez la puissance laser et le temps de traitement en fonction des besoins de vos cellules. Ici, 40% de puissance et 25% de temps de traitement ont été utilisés.</li>
	<li>Pour activer le laser, cliquez sur le bouton Laser Off , qui apparaîtra alors comme laser activé. Passez au logiciel d’enregistrement, choisissez un nom de fichier et cliquez sur le bouton Enregistrement rouge suivi du bouton Lecture en haut de la fenêtre pour enregistrer la mesure.</li>
	<li>Enregistrez une ligne de base de 60 s avant d’ouvrir les cellules avec le laser. Revenez au logiciel d’initialisation.</li>
	<li>Désactivez les électrodes à exclure par le laser sur la carte virtuelle sur le côté droit en utilisant Ctrl + clic de souris. Sélectionnez les électrodes d’intérêt en les activant sur la représentation du tableau sur le côté droit de la fenêtre du logiciel.</li>
	<li>Pour démarrer le laser, utilisez Alt + clic de souris et sélectionnez l’électrode centrale de ce puits. Cela initie le laser pour ouvrir automatiquement les cellules sur chaque électrode de ce puits. Répétez pour chaque puits. Le laser ouvrira alors automatiquement toutes les électrodes précédemment activées du puits sélectionné.</li>
</ol>4. Manipulation et application des médicaments
<ol><li>Préparez toutes les substances à utiliser pour les tests de drogue fraîchement le jour des mesures. S’assurer que la concentration finale d’application est 10 fois plus élevée dans le milieu pour obtenir une dilution de 1:10 dans les puits.</li>
	<li>Dissoudre la nifédipine, E4031 et le dofétilide d’abord dans le DMSO à la concentration mM, puis dans le milieu jusqu’à 10x de la concentration désirée. Ne jamais dépasser une concentration finale de DMSO de 0,1 % dans le puits.</li>
	<li>Enregistrer l’activité de base pendant 60 s. Démarrez la poration induite par laser comme décrit à l’étape 3 du protocole, ce qui entraîne une transformation du FP en forme liAP.</li>
	<li>Appliquez tous les médicaments à concentration unique par puits. Retirer 20 μL de milieu par puits pour les MEA à 6 puits et 100 μL pour les MEA à puits unique, respectivement. Ajouter 20 μL ou 100 μL, selon le type de MEA, de la solution mère du médicament à mesurer au puits et pipeter soigneusement de haut en bas 2-3 fois. Effectuer au moins trois réplications de chaque médicament et concentration pour obtenir une pertinence statistique.</li>
	<li>Laisser les composés se laver pendant 300 s. Pendant ce temps, la forme liAP peut se transformer en forme FP. Encore une fois, induisez une poration induite par laser et enregistrez les effets possibles induits par le composé sur le liAP pendant 60 s supplémentaires.</li>
</ol>5. Exportation des données
<ol><li>Sélectionnez les électrodes appropriées en relisant l’enregistrement dans le logiciel d’enregistrement. Utilisez MC_DataTool pour convertir des fichiers MC_Rack en fichiers ASCII .txt.</li>
	<li>Cliquez sur Fichier > Ouvrir MCD > Sélectionnez un fichier MC_Rack. Cliquez sur le bouton txt (texte bleu).</li>
	<li>Sélectionnez une électrode. L’électrode sélectionnée sera affichée dans la liste sur le côté droit.</li>
	<li>Cliquez sur Parcourir pour sélectionner le dossier et modifier le nom du nouveau fichier .txt. Cliquez sur Enregistrer.</li>
	<li>Désélectionnez l’électrode exportée et sélectionnez l’électrode suivante à exporter. Répétez la procédure pour toutes les électrodes d’intérêt.</li>
</ol>6. Traitement des données et analyse statistique
<ol><li>Importez les traces binaires converties dans R19. Visualisez/analysez les données à l’aide de scripts personnalisés contenant les packages suivants : dplyr, tidyr et ggplot220,21,22.</li>
</ol>

<ol><li>Shah, M., Akar, F. G., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of arrhythmias.</a> Circulation. 112 (16), 2517-2529 (2005).</li>
<li>Bowlby, M. R., Peri, R., Zhang, H., Dunlop, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hERG+%28KCNH2+or+Kv11.1%29+K%2B+channels%3A+screening+for+cardiac+arrhythmia+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">hERG (KCNH2 or Kv11.1) K+ channels: screening for cardiac arrhythmia risk.</a> Current Drug Metabolism. 9 (9), 965-970 (2008).</li>
<li>Priest, B. T., Bell, I. M., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+hERG+potassium+channel+assays+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Role of hERG potassium channel assays in drug development.</a> Channels (Austin). 2 (2), 87-93 (2008).</li>
<li>Fenton, F., Cherry, E., Glass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Scholarpedia%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmia.</a> Scholarpedia. 3 (7), 1665(2008).</li>
<li>Tisdale, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+arrhythmias%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drug-induced arrhythmias: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 142 (15), 214-233 (2020).</li>
<li>Kramer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MICE+models%3A+superior+to+the+HERG+model+in+predicting+Torsade+de+Pointes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MICE models: superior to the HERG model in predicting Torsade de Pointes.</a> Scientific Reports. 3, 2100(2013).</li>
<li>Rampe, D., Roy, M. -L., Dennis, A., Brown, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+the+proarrhythmic+effects+of+cisapride+%28Propulsid%29%3A+high+affinity+blockade+of+the+human+cardiac+potassium+channel+HERG%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A mechanism for the proarrhythmic effects of cisapride (Propulsid): high affinity blockade of the human cardiac potassium channel HERG.</a> FEBS Letters. 417 (1), 28-32 (1997).</li>
<li>Girouard, S. D., Laurita, K. R., Rosenbaum, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+properties+of+cardiac+action+potentials+recorded+with+voltage-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Unique properties of cardiac action potentials recorded with voltage-sensitive dyes.</a> Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 7 (11), 1024-1038 (1996).</li>
<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+%26+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues.</a> Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).</li>
<li>Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+mapping+of+membrane+voltage+and+calcium+in+zebrafish+heart+in+vivo+reveals+chamber-specific+developmental+transitions+in+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents.</a> Frontiers in Physiology. 5, 344(2014).</li>
<li>Ronzhina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Di-4-ANEPPS+modulates+electrical+activity+and+progress+of+myocardial+ischemia+in+rabbit+isolated+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Di-4-ANEPPS modulates electrical activity and progress of myocardial ischemia in rabbit isolated heart.</a> Frontiers in Physiology. 12, 1-15 (2021).</li>
<li>Beck, C., Gong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-speed%2C+bright%2C+red+fluorescent+voltage+sensor+to+detect+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A high-speed, bright, red fluorescent voltage sensor to detect neural activity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 15878(2019).</li>
<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cette méthode innovante démontre une nouvelle façon d’étudier in vitro la modulation pharmacologique du potentiel d’action cardiaque lors de l’application de composés outils pharmacologiques cardioactifs.
Les enregistrements MEA classiques permettent des enregistrements FP, qui sont les dérivés de l’AP14 cardiaque. Cet enregistrement indirect implique le cours temporel de la dépolarisation et de la repolarisation et élimine ainsi les caractéristiques essentielles de l’AP. En outre, bien que le changement de tension transcellulaire d’un point d’accès atteigne généralement des valeurs d’environ 100 mV, l’amplitude FP globale reste comparativement faible, avec des amplitudes de crête comprises entre plusieurs valeurs de 100 μV et de faibles valeurs mV à un chiffre. En raison du principe d’enregistrement, la phase de repolarisation est petite; dans de nombreux cas, il est simplement détectable et souvent de forme peu claire, ce qui rend difficile la définition de la fin de la PF. L’ouverture de la membrane cellulaire nous permet d’accéder à la tension intracellulaire, découvrant ainsi l’évolution temporelle de l’AP cardiaque. Il existe de multiples avantages de cette méthode d’enregistrement par rapport aux enregistrements FP. Tout d’abord, l’amplitude du signal est plus importante, offrant un rapport signal sur bruit supérieur. Deuxièmement, la forme d’onde permet une meilleure détection de la repolarisation. Troisièmement, la forme de la phase de repolarisation donne un aperçu du mode d’action du composé d’essai, fourni par la pente de la relaxation du signal. Enfin, cette méthode offre une sensibilité améliorée pour détecter les effets indésirables critiques des médicaments, démontrée par l’exemple d’enregistrement illustré à la figure 6 pour l’apparition d’EAD dans le liAP mais pas dans le PF.
Jusqu’à présent, il existe deux façons d’accéder au point d’accès intracellulaire. Le premier est réalisé par électroporation26,27. Ici, des impulsions de tension courtes et fortes appliquées via les électrodes d’enregistrement peuvent ouvrir la membrane cellulaire28. La deuxième possibilité est l’ouverture de la membrane via une impulsion laser, en utilisant un phénomène physique appelé résonance plasmonique de surface, comme démontré ici. L’un des avantages par rapport à l’électroporation est la probabilité accrue d’ouvertures consécutives. En raison du spot laser hautement focalisé (1-3 μm), cet effet est très localement limité à l’électrode d’intérêt. Fait intéressant, l’initiation du liAP n’a pas modifié la propagation du signal du syncytium cultivé. Cela indique que, bien que l’intégrité cellulaire soit endommagée, les cardiomyocytes ne semblent pas se dépolariser via le trou dans la membrane.
Il y a des limites à cette méthode. Comme pour l’électroporation, l’ouverture de la membrane ne dure pas, dans la plupart des cas, pendant toute la durée expérimentale. Les réglages minimaux de puissance et de durée de l’impulsion laser requis pour une ouverture stable du type de cellule spécifique d’intérêt doivent être définis indépendamment avant les expériences. Nous avons constaté (non montré) que les paramètres varient considérablement entre les différents types de cellules (dans notre cas, plusieurs cardiomyocytes primaires et dérivés de l’hiPS). Cela évite un stress inutile sur les cellules pendant l’expérience de test composé et permet d’obtenir des données plus fiables et reproductibles. Il est d’une importance cruciale d’ajuster l’axe z pour fournir une mise au point claire sur les cellules et les électrodes. Une image de caméra non focalisée donne dans un point laser situé à un niveau sous-optimal, ce qui peut entraîner l’incapacité d’ouvrir la membrane cellulaire. Même avec les meilleurs paramètres ajustés, l’effet liAP est transitoire et l’amplitude diminue avec le temps. De plus, l’accès à l’espace intracellulaire des cellules varie entre les inductions liAP, à la fois dans des ouvertures consécutives à la même électrode et entre les électrodes. Il en résulte une grande variabilité de l’amplitude liAP. La raison n’est pas encore entièrement comprise. Les explications possibles incluent des problèmes mécaniques tels qu’une dérive du foyer laser ou une localisation subcellulaire différente de l’ouverture de la membrane. Cela rend l’analyse des effets d’amplitude des composés d’essai compliquée à ce stade. En outre, l’enregistrement de l’activité électrique par un système MEA nécessite un filtrage passe-haut pour compenser la dérive inévitable de la ligne de base. Bien que dans le système utilisé ici, ce filtrage ait été réglé à 0,1 Hz (le réglage de filtre le plus bas disponible pour ce système), les effets de filtrage pendant la phase de plateau étaient toujours visibles, ce qui a entraîné une tendance lente de la déviation de la tension vers la ligne de base pendant la phase de plateau du PA cardiaque. Ceci est particulièrement problématique avec les PA sous-jacents très longs comme les cardiomyocytes iCell2 dérivés de l’iPSC utilisés ici, qui génèrent déjà des PA > 700 ms dans des conditions de contrôle. L’utilisation de systèmes avec un filtrage plus faible peut mieux conserver la forme du point d’accès et permettre un accès encore meilleur au déroulement temporel de la phase de repolarisation.

La contribution électrique d’un battement cardiaque résulte d’une interaction complexe et chronométrée avec précision de nombreux canaux et transporteurs cardiaques, ainsi que de la propagation réglée avec précision des signaux électriques à travers le myocarde1. L’altération de ces mécanismes étroitement coordonnés (p. ex. l’utilisation de drogues) peut avoir de graves conséquences sur la fonction cardiaque (c.-à-d. arythmie potentiellement mortelle)2,3. Les arythmies sont définies comme des battements cardiaques irréguliers qui modifient le rythme normal du cœur, ce qui peut avoir des conséquences potentiellement mortelles. Elles peuvent être causées soit par une altération de l’initiation d’une vague d’excitation cardiaque, soit par une propagation anormale de l’excitation cardiaque4, qui entraîne à son tour un dysfonctionnement du mécanisme de pompage du cœur.
De nombreux candidats médicaments très puissants doivent être exclus d’autres investigations au cours de la phase de développement précoce du médicament en raison de leur potentiel (pro-)arythmique 2,3. Ils modulent les canaux cardiaques clés (par exemple, le canal génétique humain lié à l’éther [hERG]) qui sont responsables de la formation et de la fin normales du potentiel d’action cardiaque ainsi que de la propagation ultérieuredu signal 5.
Les sociétés pharmaceutiques utilisent régulièrement des mesures patch-clamp ou des réseaux de microélectrodes (MEA) pour étudier les effets cardiotoxiques potentiels hors cible induits par les candidats médicaments. Les enregistrements patch-clamp permettent de déchiffrer l’impact des substances sur les canaux ioniques cardiaques et d’analyser le potentiel d’action cardiaque transcellulaire avec une haute résolution spatio-temporelle 6,7. Cependant, les inconvénients de cette technique incluent un faible débit avec une pince manuelle et une applicabilité limitée de l’automatisation en raison de la dépendance de cette méthode sur les cellules en suspension. De plus, les effets chroniques ne peuvent pas être étudiés en raison du caractère invasif de la méthode. Enfin, en règle générale, seules les cellules individuelles sont étudiées simultanément plutôt que l’ensemble du syncytium cardiaque, ce qui rend impossible le traitement des informations sur la propagation du signal.
Les colorants sensibles à la tension sont précieux pour étudier de manière non invasive les potentiels d’action cardiaque et les arythmies induites par les médicaments8. Ils permettent d’étudier à la fois l’activité unicellulaire et syncytium. Les inconvénients de cette méthode sont les effets cytotoxiques des colorants en soi ou du produit de réaction pendant l’éclairage. Ils sont utilisés pour des expériences aiguës et ne sont guère applicables pour des études à long terme 9,10,11. Les protéines sensibles à la tension en tant qu’alternatives ont fait des progrès significatifs au cours des deux dernières années en termes de facilité d’utilisation et de sensibilité, mais nécessitent une modification génétique des cellules d’intérêt et manquent de résolution temporelle élevée par rapport aux techniques électrophysiologiques12.
L’information tirée de la plus récente initiative CiPA13 indique que les AME sont largement utilisés dans les dépistages de sécurité cardiaque comme approche électrophysiologique alternative, car ils représentent un outil puissant et bien établi pour étudier la pharmacologie de la fonction et de la sécurité cardiaques. Les cardiomyocytes sont cultivés sous forme de syncytium directement au-dessus des puces, et les potentiels de champ extracellulaire (FP) sont enregistrés de manière non invasive via des microélectrodes intégrées au substrat. Ce principe d’enregistrement permet d’effectuer des criblages à débit accru sur plusieurs jours, ce qui les rend adaptés à la recherche pharmaceutique sur les effets chroniques. La forme d’onde FP résultante est un dérivé de l’AP14 intracellulaire. Des paramètres tels que la fréquence de battement, l’amplitude de la partie initiale du FP et la durée du FP sont facilement accessibles15. D’autres critères essentiels tels que la différenciation entre prolongation et triangulation de la PF (un marqueur important de la proarythmie16,17) sont inaccessibles en raison de l’effet de filtrage AC de la technique. De plus, la détection d’autres petits événements proarythmiques tels que les post-dépolarisations précoces et retardées (EAD et DAD, respectivement) est souvent facilement négligée en raison de leur faible amplitude.
Nous décrivons ici une méthode pour accéder au potentiel membranaire intracellulaire en ouvrant la membrane des cardiomyocytes. Le dispositif IntraCell (ci-après dénommé dispositif d’enregistrement intracellulaire) permet des ouvertures membranaires répétées de cardiomyocytes cultivés au-dessus des électrodes MEA à l’aide d’un faisceau laser nanoseconde hautement focalisé via un phénomène physique spécifique (résonance plasmonique de surface)18. En conséquence, l’enregistrement passe d’un PF régulier à un AP intracellulaire (AP induit par laser, liAP). Le protocole montre comment cela permet d’accéder aux aspects cinétiques de la forme d’onde qui ne peuvent pas être facilement capturés en analysant les FP. Cette méthode représente un pont entre les patch-clamp intracellulaires traditionnels et les enregistrements MEA. La technologie est donc une extension puissante des méthodes actuelles d’évaluation de la sécurité cardiaque.

<table><tbody><tr><td>Puce MEA 1 puits</td><td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td><td>890301</td><td></td></tr><tr><td>Puce MEA 6 puits</td><td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td><td>7600069</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck KGaA</td><td>20-139 Solvant Sigma-Aldrich</td><td>pour médicaments</td></tr><tr><td>Dofetilide</td><td>ALOMONE LABS ISRAEL SIÈGE</td><td>D-100</td><td>Mesure de médicaments</td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>12037539</td><td>Coating</td></tr><tr><td>E4031</td><td>ALOMONE LABS ISRAEL SIÈGE SOCIAL</td><td>E-500</td><td>Mesure des médicaments</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>FB Alps version 0.5.005</td><td>Foresee Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Merck KGaA</td><td>11051407001</td><td>Revêtement</td></tr><tr><td>iCell cardiomyocytes</td><td>FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>IntraCell</td><td>Foresee Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>CN09.1</td><td>Pour le nettoyage des coussinets de contact MEA</td></tr><tr><td>Support d’entretien</td><td>FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)</td><td>#M1003</td><td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>MC_Data outil</td><td>Systèmes multicanaux MCS GmbH</td><td></td><td>Exportation de données</td></tr><tr><td>MC_Rack</td><td>Systèmes multicanaux MCS GmbH</td><td></td><td>Enregistrement MEA MEA</td></tr><tr><td>2100 - 2x60 - système</td><td>Systèmes multicanaux MCS GmbH</td><td>890485</td><td>Pour les enregistrements MEA</td></tr><tr><td>Nifédipine</td><td>Merck KGaA</td><td>N7634 Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Mesure de médicament Placage Medium</td><td>FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)</td><td>M1001</td><td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>VWR International, LLC</td><td>1304-1</td><td>nettoyage des AEM</td></tr></tbody></table>

mesures de type potentiel d’action induite par laser de cardiomyocytes sur des réseaux de microélectrodes pour une prédictivité accrue de la pharmacologie de sécurité

Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology

L’arythmie cardiaque potentiellement mortelle induite par un médicament est souvent précédée de potentiels d’action cardiaque (PA) prolongés, généralement accompagnés de petites fluctuations du potentiel de membrane proarythmique. La forme et l’évolution temporelle de la fraction repolarisante de l’AP peuvent être essentielles pour la présence ou l’absence d’arythmie.
Les réseaux de microélectrodes (MEA) permettent un accès facile aux effets des composés cardiotoxiques via les potentiels de champ extracellulaires (FP). Bien qu’il s’agisse d’un outil puissant et bien établi dans la recherche et la pharmacologie de la sécurité cardiaque, la forme d’onde FP ne permet pas de déduire la forme originale de l’AP en raison du principe d’enregistrement extracellulaire et du filtrage intrinsèque du courant alternatif (AC) qui en résulte.
Un nouveau dispositif, décrit ici, peut ouvrir de manière répétitive la membrane des cardiomyocytes cultivés au-dessus des électrodes MEA à plusieurs points de temps de culture, en utilisant un faisceau laser nanoseconde hautement focalisé. La poration laser permet de transformer le signal électrophysiologique de FP en AP intracellulaires (AP induite par laser, liAP) et permet l’enregistrement des déviations de tension transcellulaires. Cet accès intracellulaire permet une meilleure description de la forme de l’AP et une classification meilleure et plus sensible des potentiels proarythmiques que les enregistrements MEA réguliers. Ce système est une extension révolutionnaire des méthodes électrophysiologiques existantes, permettant une évaluation précise de l’effet cardiotoxique avec tous les avantages des enregistrements basés sur MEA (expériences faciles, aiguës et chroniques, analyse de propagation du signal, etc.).

Le système d’enregistrement utilisé pour enregistrer l’activité électrique des cardiomyocytes cultivés consistait en un système MEA standard équipé d’un appareil de chauffage et d’une chambre pour carbogen fixée à un ordinateur. Le système était placé sur le dessus du dispositif d’enregistrement intracellulaire, qui à son tour était monté sur une petite unité antivibratoire (figure 1A-B).
Les cardiomyocytesdérivés de l’iPSC 2 ont commencé à battre spontanément dans les 2-3 jours suivant la décongélation (jours in vitro, DIV) et étaient visibles au microscope. À partir de DIV 4, la fréquence de battement est devenue régulière et des potentiels de champ extracellulaire (FP) avec des amplitudes de crête à crête du composant dépolarisant comprises entre 1 et 5 mV ont pu être détectés sur la plupart des électrodes dans les puits respectifs des puces MEA. L’activité électrique a pu être détectée dans plus de 95 % des puits étudiés. À partir de la DIV 7, la probabilité de détachement cellulaire a augmenté, rendant impossible l’utilisation ultérieure de ces puits.
Le logiciel de contrôle de l’ouverture de la membrane induite par laser permet d’ajuster à la fois la puissance et le temps de traitement du laser qui médie l’ouverture de la membrane cellulaire uniquement sur l’électrode étudiée (Figure 1C), alors que les autres électrodes du puits respectif ne sont pas affectées. Bien que des réglages trop conservateurs n’aient pas modifié la forme d’onde de la PF, des réglages trop élevés ont entraîné une lésion putative des cardiomyocytes, indiquée par un battement vigoureux mais transitoire ou une perte du signal. Lorsqu’il est réglé à un réglage de 40 % de puissance et de 25 % de temps de traitement bien toléré par les cellules, le déclenchement de l’impulsion laser a entraîné de multiples changements dans la forme d’onde enregistrée (voir la figure 1D pour un exemple d’enregistrement). Dans ces conditions, aucune altération du matériau de l’électrode n’a été observée macroscopiquement. L’amplitude du signal enregistré a considérablement augmenté de 4,1 ± 0,41 fois (n = 20, plage de 1,34 à 8,83), analysée à partir d’un sous-ensemble d’enregistrements choisis au hasard, ce qui a donné des amplitudes comprises entre 7 et 22 mV. De plus, la forme d’onde s’est transformée d’une forme FP standard avec une déviation de tension rapide, biphasique et transitoire au début, suivie d’une phase de plateau de retour à la ligne de base et d’une petite déviation indiquant la fin du FP à une forme plus proche d’un AP enregistré intracellulaire avec une montée rapide, une phase de plateau dépolarisée étendue et une phase de repolarisation avec un sous-tir inférieur à la ligne de base (Figure 1E ). Nous avons défini ces déviations de tension comme AP induites par laser (liAP). Dans la plupart des cas, la transition était transitoire et au moins partiellement inversée en 5 minutes. La propagation du signal dans le syncytium cardiaque est restée inchangée après l’induction de la liAP (Figure 2), ce qui indique que le syncytium restant n’a pas été affecté par les dommages potentiels causés par l’impulsion laser.
Les similitudes avec les PA enregistrés intracellulairement ont permis d’extraire des paramètres de la LIAP qui ne sont pas accessibles aux PF (pour des exemples de paramètres, voir par exemple, la figure 3A), en particulier la mesure de la durée du LiAP à des points temporels spécifiques (par exemple, à 20%, 50% et 90%) (Figure 3B), analogue à APD20/50/90 couramment utilisé pour la description des PA.
Nous avons ensuite testé la réponse des cardiomyocytes ouverts au laser aux composés d’outils pharmacologiques cardioactifs couramment utilisés. Un exemple de conception de protocole peut être trouvé à la figure 3C. Étant donné que la transformation de la liAP n’a pas toujours persisté tout au long de l’expérience, l’application du composé a été réalisée à une concentration unique par puits plutôt que de manière cumulative pour réduire le temps d’enregistrement total. Néanmoins, il était nécessaire de rouvrir les cellules ou d’ouvrir une autre zone d’électrode avant d’appliquer le composé d’essai.
L’ajout du bloqueur spécifique du canal Ca 2+ de type L, la nifédipine23,24, a réduit la phase de plateau du liAP d’une manière dépendante de la concentration et a ainsi raccourci l’ensemble du liAP (Figure 4A,B). Ce raccourcissement était comparable à l’analyse obtenue à partir de PF de cardiomyocytes à partir d’électrodes non manipulées (Figure 4C), indiquant que cette méthode d’enregistrement n’a pas eu d’effets indésirables par rapport aux enregistrements PF classiques.
E4031 inhibe la repolarisation du canal potassique25 Kv1.11 (hERG) pertinent et conduit à un comportement arythmique des cardiomyocytes à des concentrations accrues. À l’instar de l’analyse obtenue à partir d’enregistrements FP, E4031 a augmenté la durée de la liAP d’une manière dépendante de la concentration (Figure 5). De plus, à des concentrations de 0,01 μM et plus, de petites déviations de tension positives à l’extrémité du liAP étaient visibles. Ces flèches sont devenues plus importantes avec des concentrations plus élevées, indiquant une nouvelle dépolarisation transitoire, contrairement aux FP, où ces flèches étaient pratiquement invisibles (voir Figure 5B-C, traces supérieures (FP) vs inférieures (liAP)). Ce comportement est connu sous le nom de post-dépolarisation précoce (EAD). À la concentration la plus élevée de 0,1 μM, ces EAD ont augmenté au fil du temps en battements ectopiques, qui sont des potentiels d’action prématurée (Figure 5C). L’EAD et les battements ectopiques sont des indicateurs clés de l’activité proarythmique. À la fin de l’exemple illustré à la figure 5D, l’activité électrique a entraîné des battements arythmiques. De plus, les relations concentration-réponse affichées entre les enregistrements FP et liAP correspondaient (Figure 5E). Cependant, il y a une variabilité plus considérable dans les données de PF résultant de la faible composante de repolarisation des PF à des concentrations plus élevées de la substance d’essai. Il semble que la nature caractéristique des cardiomyocytes dérivés de l’iPSC2 ait tendance à générer des PA non physiologiquement longs dans des conditions de contrôle également (durées d’AP &gt; 700 ms). Le système MEA appliquait un filtrage intrinsèque de 0,1 Hz AC, ce qui a entraîné une forme partiellement filtrée du liAP, sans toutefois occulter les informations qualitatives sur le début et la fin du PA sous-jacent.
Il s’est avéré que l’apparition initiale de déviations de tension proarythmiques pouvait être détectée à des concentrations plus faibles dans les liAP par rapport aux enregistrements FP. La figure 6 montre l’enregistrement de l’activité électrique pendant l’application de dofétilide à une concentration de 3 μM. L’enregistrement a été obtenu dans le même puits. Bien que FP et liAP aient affiché des durées d’environ 2 s, la forme d’onde FP était discrète, présentant des déviations repolarisantes régulières. Dans le même temps, à la fin des liAP, des EAD de différentes magnitudes sont devenus visibles. Cette augmentation de la sensibilité pharmacologique de sécurité pertinente confirme la conclusion selon laquelle les liAP induits par la résonance plasmonique de surface permettent une meilleure qualification de la phase de repolarisation et aident ainsi à en apprendre davantage sur le mode d’action des composés d’essai à l’étude.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2.jpg"> Figure 1 : Configuration de l’enregistrement intracellulaire et enregistrements exemplaires. (A) Vue d’ensemble de la configuration. (B) Vue de dessus du système d’enregistrement avec amplificateur d’enregistrement MEA ouvert. (C) Logiciel d’initialisation avec la carte virtuelle MEA sur le côté droit. 1: table anti-vibration, 2: système d’enregistrement intracellulaire, 3: couvercle de protection laser, 4: chambre de carbogen humidifiée, 5: système de chauffage MEA, 6: carte d’interface MEA, 7: puce MEA 1 puits à l’intérieur de l’amplificateur d’enregistrement. (D) Enregistrement d’exemples à partir d’une électrode avant et après l’induction des liAP. En haut : enregistrement d’environ 6 min. Des lignes pointillées marquent les zones étendues indiquées en bas. (E) FP agrandi (en haut) et liAP (en bas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig02.jpg"> Figure 2 : Le schéma de propagation du signal reste conservé après l’induction de la LiAP. Codage en fausses couleurs de la propagation du signal de l’onde d’excitation dans le syncytium. Le bleu indique tôt (à partir de -4 ms); Le rouge indique les points de temps tardifs (+3 ms) du signal obtenu à l’électrode de référence E54 comme indiqué par la barre de couleur. Le signal se déplace de haut à droite en bas à gauche du réseau d’électrodes. (A) Avant induction liAP, (B) 1 min après induction liAP. (C) 4 min après induction liAP. Le symbole Flash indique le point d’induction laser à l’électrode 64. Notez qu’aucune différence dans la direction globale de propagation n’est visible. Les rectangles noirs indiquent des données non valides. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2.jpg"> Figure 3 : Définition des paramètres FP/liAP et protocole d’enregistrement. (A) Paramètres qui peuvent être extraits du PC classique. (B) Paramètres supplémentaires pouvant être obtenus à partir des PAli. (C) Chronologie de la mesure des médicaments. De gauche à droite : enregistrement de contrôle pendant 60 s, induction de liAP, enregistrement de liAP pendant 60 s, application de médicament, temps de lavage 300 s, réinduction de liAP, enregistrement de liAP pendant 60 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2.jpg"> Figure 4 : La nifédipine raccourcit la liAP cardiaque d’une manière dépendante de la concentration. (A) En haut : traces de PF au contrôle (bleu) et en présence de 0,3 μM de nifédipine (rouge). Les traces sont affichées avec un décalage de l’axe y pour une meilleure visualisation. En bas : traces liAP du même enregistrement MEA, entraînant un raccourcissement du liAP combiné à une augmentation du taux de battement. (B) Superposition de liAP simples pendant le contrôle (bleu) et application de différentes concentrations de nifédipine (rouge). a : 0,01 μM, b : 0,1 μM et c : 0,3 μM. Notez le raccourcissement de la durée du liAP avec l’augmentation des concentrations. (C) La relation concentration-réponse de la largeur du signal obtenue à partir d’enregistrements FP (noir) et liAP (rouge). Les données proviennent de n = 3 expériences et sont normalisées pour contrôler. Les barres d’erreur indiquent l’erreur type de la moyenne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2.jpg"> Figure 5 : E4031 induit un comportement (pro-) arythmique. (A) FP (en haut) et liAP (en bas) dans des conditions de contrôle. (B-C) Les PF et les liAP ont été enregistrés à différents moments après l’application de E4031 (0,1 μM). Après 80 s, les premiers EADs sont visibles à la fin du liAP (B ; marqué d’une flèche rouge). Les EAD se transforment en battements ectopiques après 320 s en présence de la substance d’essai (C). (D) Après 530 s, le syncytium cardiaque entre dans un état tachycardique. Trace représentée à partir de l’enregistrement liAP. (E) Relation concentration-réponse de la largeur FP (noir) et liAP (rouge). Données de n = 4 expériences, normalisées au contrôle. Les barres d’erreur indiquent l’erreur type de la moyenne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig06.jpg"> Figure 6 : La détection des événements proarythmiques est plus sensible dans les PAl que dans les PF. (A) enregistrement FP et (B) enregistrement liAP dans le même puits lors de l’application de 3 μM de dofétilide. Alors qu’à la fin de certains liAP, les EAD sont détectables, ils restent introuvables dans les enregistrements FP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

La combinaison de poration laser et de réseaux de microélectrodes (MEA) permet des enregistrements de type potentiel d’action de cardiomyocytes cultivés primaires et dérivés de cellules souches. La forme d’onde fournit un meilleur aperçu du mode d’action des composés de test que les enregistrements standard. Il relie patch-clamp et lecture MEA pour optimiser davantage la recherche sur la sécurité cardio à l’avenir.

Mesures de type potentiel d’action induite par laser de cardiomyocytes sur des réseaux de microélectrodes pour une prédictivité accrue de la pharmacologie de sécurité

Life-threatening drug-induced cardiac arrhythmia is often preceded by prolonged cardiac action potentials (AP), commonly accompanied by small ...

Cette méthode permet d’enregistrer les potentiels d’action intracellulaires sur les AME traditionnels, permettant ainsi une meilleure description de la forme de l’AP et une classification plus sensible des potentiels pro-arythmiques. Par rapport aux enregistrements de potentiel de champ typiques, la forme potentielle réelle intracellulaire fournit plus d’informations sur l’autorisation précise des canaux ioniques sous-jacents. Lorsqu’elle est appliquée aux cardiomyocytes dérivés de patients cliniques grâce à la technologie des cellules souches, la méthode peut contribuer au diagnostic causal et à la personnalisation de C R P et de maladies cardiaques comme les arythmies Notre technicienne, Karin Gebhardt, fera la démonstration de la culture des cardiomyocytes.Pour commencer à enduire les champs d’électrodes des MEA précédemment autoclavés, Dropwise avec de la fibronectine en utilisant une pipette de 10 microlitres sous la hotte à flux laminaire. Pour réduire le choc osmotique, transférer la solution de placage goutte à goutte pendant 90 secondes dans le tube de 50 millilitres contenant les cardiomyocytes décongelés. Ajouter doucement huit millilitres de fluide de placage dans le tube et mélanger soigneusement la suspension cellulaire.À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, retirez le surnageant, en veillant à ne pas jeter la pastille et ajustez le numéro de cellule à la concentration finale. Avant l’assise de la cellule, retirez la solution de revêtement appliquée de la zone de l’électrode MEA à l’aide d’une pipette de 10 microlitres. Pour éviter le séchage de l’ensemencement de revêtement, les cellules immédiatement en ajoutant quatre microlitres des cellules goutte à goutte sur les champs d’électrodes pour les deux, six puits MEA et un puits M E A.Maintenant, laissez les cellules adhérer aux puits pendant une heure à 37 degrés Celsius, et 5% de dioxyde de carbone.Sous la hotte à flux laminaire, ajouter 200 microlitres et un millilitre de milieu de placage stérile chauffé à 37 degrés Celsius pour six MEA puits et MEA à puits unique respectivement. Pour les enregistrements MEA, placez le système MEA sur le dessus de l’appareil avec le support de puce MEA centré sur le trou de l’objectif. Ensuite, laissez le laser se concentrer sur les électrodes en positionnant la configuration MEA, de sorte que l’objectif soit directement sous le trou du système MEA.Pour permettre aux cellules de récupérer de la perturbation mécanique, transférez la puce MEA avec les cellules cultivées de l’incubateur à la configuration MEA 15 minutes avant l’enregistrement. Ensuite, nettoyez soigneusement les coussinets de contact et les broches, en utilisant un écouvillon d’isopropanol pour diminuer les niveaux de bruit. Placez soigneusement le MEA dans la configuration MEA et positionnez la puce MEA à six puits avec le numéro de série visible sur le côté droit ou une puce MEA à un seul puits avec l’électrode de référence à gauche.Maintenant, réglez le chauffage intégré du système MEA à 38 degrés Celsius. Fermez le couvercle de l’appareil car l’interrupteur de sécurité intégré ne permet d’activer le laser que si le couvercle est fermé sur la puce MEA. À l’aide du programme de configuration MEA, réglez le filtre du système MEA passe-haut et passe-bas sur 0,1 hertz ou moins et 3 500 hertz respectivement.Utilisez le logiciel MC rack ou tout autre logiciel pour l’enregistrement. Ajustez la plage d’entrée en fonction de l’expérience. S’assurer que le signal ne sature pas l’amplificateur et la fréquence d’échantillonnage.Utilisez la fonction d’affichage à long terme du logiciel pour vérifier l’enregistrement. Après avoir inséré la puce MEA dans la configuration MEA et configuré le logiciel, initialisez la mécanique laser à l’aide du logiciel FB ALP. Maintenant, cliquez sur le bouton d’initialisation.À la fin de l’initialisation, le point laser virtuel sera dans le puits D pour un MEA à six puits et en bas à gauche pour un MEA à un seul puits respectivement. Ensuite, à l’aide de la touche de contrôle avec un clic de souris, déplacez le point laser virtuel au milieu de l’électrode D five et ajustez la mise au point en maintenant la touche de contrôle enfoncée et en faisant défiler avec la molette de la souris. Vous pouvez également utiliser la fonction de mise au point automatique.Appuyez sur le jeu de boutons P un, et le point laser virtuel se déplacera automatiquement dans le puits F.Le système est maintenant aligné. Ajustez la puissance du laser et le temps de traitement en fonction des exigences expérimentales. Pour activer le laser, cliquez sur le bouton d’arrêt laser qui apparaîtra comme laser activé, Basculez vers le logiciel d’enregistrement.Choisissez un nom de fichier et cliquez sur le bouton d’enregistrement rouge suivi du bouton de lecture en haut de la fenêtre pour enregistrer la mesure. Avant d’ouvrir les cellules avec le laser, enregistrez une ligne de base pendant 60 secondes. Revenez au logiciel d’initialisation et désactivez les électrodes à exclure par le laser sur la carte virtuelle sur le côté droit de la fenêtre du logiciel.Pour démarrer le laser, utilisez Alt clic de souris et sélectionnez l’électrode centrale de ce puits. Cela initie le laser pour ouvrir automatiquement les cellules sur chaque électrode de ce puits, répéter pour chaque puits pour ouvrir toutes les électrodes précédemment activées de ce puits sélectionné. Dissoudre d’abord la concentration millimolaire de Nifedipine E-40 31 et de Dofetilide dans le DMSO, puis dans un milieu complet jusqu’à 10 fois la concentration souhaitée.Ne jamais dépasser une concentration finale de DMSO de 0,1 % dans le puits. Enregistrez l’activité de base pendant 60 secondes. Démarrez la peration induite par laser comme démontré précédemment, entraînant une transformation du FPS en liAP.Appliquez tous les médicaments en concentration unique par puits. Retirer 20 microlitres et 100 microlitres de milieu par puits de six MEA puits et puits unique respectivement. Ajouter 20 microlitres ou 100 microlitres de la solution mère de médicament à mesurer au puits.Selon le type de MEA, et pipeter soigneusement de haut en bas deux à trois fois. Laissez les composés se laver pendant 300 secondes. Pendant ce temps, la forme liAP peut se transformer en forme FP.Encore une fois, peration induite par laser et enregistrer les défauts induits par les composés possibles sur le liAP pendant 60 secondes supplémentaires. L’ajout de nifédipine a réduit la phase de plateau des LIAP d’une manière dépendante de la concentration, et a ainsi raccourci l’ensemble du LiAP. Ce raccourcissement était comparable aux potentiels de champ des cardiomyocytes à partir d’électrodes non manipulées.E-40 31 a inhibé la repolarisation des canaux potassiques KV un point 11 pertinents et a conduit au comportement arythmique des cardiomyocytes à des concentrations accrues. En outre, E-40 31 a augmenté la durée de la liAP d’une manière dépendante de la concentration. À la fin du liAP, de petites déviations de tension positives ont été observées à 0,1 micromolaire qui sont devenues plus importantes avec des concentrations plus élevées, indiquant une nouvelle dépolarisation transitoire appelée EAD.À la concentration la plus élevée de 0,1 micromolaire, ces EAD ont augmenté au fil du temps en battements ectopiques. Qui sont des potentiels d’action prématurée. L’EAD et les battements ectopiques sont des indicateurs clés de l’activité proarythmique.Et à la fin, l’activité électrique entraîne des battements arythmiques. Les relations concentration-réponse étaient corrélées avec les enregistrements FP et liAP. De plus, en présence de dofétilide, le FP et le liAP affichaient des durées d’environ deux secondes dans le même puits, la forme d’onde FP présentait des déviations de repolarisation régulières.Alors que dans le liAP EAD sont détectables. Il est important d’ajuster la mise au point avant chaque melomen car une image de microscope floue pourrait affecter l’ouverture des cellules. En outre, le potentiel d’action est pris peu de temps après que l’opterperation doit être utilisée pour l’analyse.Cette technique est plus sensible dans la détection des effets arythmiques antérieurs par rapport à l’AME standard, ce qui permet de détecter plus précisément les effets indésirables des composés.

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