Optimisation des paramètres de tri cytométrique en flux pour l’isolation et la purification à haut débit de petites vésicules extracellulaires

Ce protocole fournit une méthode de solution rapide et spécifique à la taille pour les petites vésicules extracellulaires en optimisant les paramètres de tri par cytométrie en flux. Ces optimisations fournissent un panel de paramètres de tri critiques qui permet d’obtenir des populations représentatives de petites vésicules extracellulaires en utilisant uniquement la diffusion vers l’avant par rapport à la dispersion de taille. Commencez par exécuter la procédure de démarrage standard du trieur de cellules de flux.

Allumez la machine en appuyant sur le bouton de démarrage, puis cliquez sur le bouton d’alimentation laser sur le panneau de commande laser. Appuyez sur le bouton des réservoirs de changement dans le sous-menu Smart Sampler pour pressuriser le fluidique. Utilisez une buse à jet et à air de 50 micromètres nettoyée par ultrasons et installez-la jusqu’à l’ensemble buse.

Ajustez la pression à 80 SI pour le fluide de gaine et à 80,3 SI pour le débit d’échantillon sur la console de pression. Appuyez sur le bouton de démarrage du flux de gaine pour démarrer le flux de gaine. Cliquez sur le bouton à bulle dans le sous-menu Smart Sampler pour débuler automatiquement pendant 10 minutes, puis désactivez-le.

Pour aligner le flux et déterminer le point laser, allumez la lumière de la chambre d’éclairage pour voir le flux au-dessus des trous d’épingle. Ajustez les micromètres haut et bas, gauche et droite et avant et arrière pour centrer le flux sur le trou d’épingle et concentrer le flux. Ouvrez tous les obturateurs laser, sélectionnez l’onglet d’interception laser et de flux, puis appuyez continuellement sur le bouton flèche verte lorsque vous y êtes invité pour terminer le processus d’interception laser et d’alignement de la buse.

Accédez à l’écran d’alignement laser fin. Sélectionnez le canal passe-bande laser 640 nanomètres et 772 bar 44 comme paramètre de l’axe x et le canal passe-bande 405 nanomètres et le canal passe-bande 448 bar 59 comme paramètre de l’axe y. Appuyez sur le sélecteur de paramètres de déclenchement et choisissez le paramètre de diffusion directe du laser de 488 nanomètres.

Ensuite, diluez les particules fluorescentes arc-en-ciel en ajoutant une goutte dans un millilitre d’eau distillée double à une concentration finale d’une fois 10 à la sixième perle par millilitre. Ouvrez la porte de la chambre d’échantillonnage et chargez un tube de particules fluorescentes arc-en-ciel préparées. Appuyez sur le bouton de démarrage de l’échantillon et ajustez les micromètres haut et bas pour optimiser l’intensité de fluorescence, rendant chaque signal aussi intense que possible.

Appuyez sur le bouton de démarrage du contrôle qualité ou du contrôle qualité du panneau de commande de l’écran tactile pour effectuer automatiquement le contrôle qualité. Appuyez ensuite sur le bouton d’initialisation IntelliSort. L’instrument ajuste automatiquement la fréquence et l’amplitude de l’oscillation des gouttelettes pour obtenir le délai de chute d’environ 25 et pouvoir visualiser clairement le point de rupture de la goutte.

Ensuite, appuyez sur le bouton de délai de chute et le bouton de maintenance. Sélectionnez tube comme type de sortie de tri. Placez un support de tube de 15 millilitres dans la chambre de tri.

Allumez la tension de la plaque et réglez la tension de la plaque à environ 4 000 volts. Ensuite, activez le modèle de test en sélectionnant le bouton de configuration du flux. Ajustez le curseur de phase de charge et le curseur de déviation pour vous assurer que l’image du flux est alignée avec le tube de collecte.

Sélectionnez ensuite le bouton de coche. Connectez-vous au poste de travail Summit sur l’ordinateur. Créez un nouveau protocole à partir du menu principal du fichier.

Créez ensuite un graphique à points en sélectionnant l’onglet histogramme dans le panneau de configuration de Summit Software. Choisissez la diffusion vers l’avant comme paramètre de l’axe x et la dispersion latérale comme paramètre de l’axe y. Cliquez ensuite avec le bouton droit de la souris sur l’axe du nouveau diagramme à points dans l’espace de travail et présentez la dispersion vers l’avant et la dispersion latérale sous la forme logarithmique.

Sélectionnez l’onglet acquisition et localisez le panneau Paramètres d’acquisition. Activez tous les signaux dans le sous-menu des paramètres d’activation. Choisissez la diffusion vers l’avant comme paramètre de déclenchement et définissez le seuil de 0,01.

Ajustez la tension et le gain de la diffusion vers l’avant et de la diffusion latérale à 250 et 0,6 pour vous assurer que les événements dans le diagramme de diffusion vers l’avant par rapport au diagramme de diffusion latérale et les populations sont séparés. Diluer les microsphères de polystyrène fluorescent en suspensions de 100, 200 et 300 nanomètres en ajoutant un microlitre de microsphères à un millilitre d’eau distillée double. Chargez ensuite la suspension de microsphère successivement.

Sélectionnez Démarrer dans le menu d’acquisition de Summit Software pour enregistrer 20 000 événements, puis cliquez sur Arrêter après avoir enregistré les événements. Cliquez avec le bouton droit sur le diagramme de points de dispersion avant ou latérale pour créer des rectangles et faire glisser pour redimensionner. Repositionnez les régions de bruit électronique et la population de microsphères de 100 nanomètres en cliquant avec le bouton droit de la souris sur les régions pour les renommer respectivement R7 et R4.

Répétez les étapes pour encadrer les microsphères de 200 et 300 nanomètres avec des rectangles successivement, et renommez-les respectivement R5 et R6. Enfin, déterminez la région de tri de 50 à 200 nanomètres en fonction du bruit électronique et de la position des particules de 200 nanomètres pour la définir comme R8. Modifiez les décisions de tri dans le panneau Logique de tri et statistiques en double-cliquant sur le champ vide du flux gauche ou L1 et en sélectionnant la région nommée R8 pour créer la logique de tri. Choisissez le mode de pureté d’abandon et sélectionnez une enveloppe de gouttelettes au-dessus d’une goutte pour le flux L1.

Chargez un échantillon de 500 microlitres de vésicules extracellulaires ou de mélange de VE préalablement préparé. Appuyez sur le bouton Démarrer dans le menu d’acquisition de Summit pour acquérir les données, puis cliquez sur Arrêter. Ensuite, appuyez sur Démarrer dans le menu de tri pour collecter de petites vésicules extracellulaires de taille 50 à 200 nanomètres ou sEV dans un tube à centrifuger de 15 millilitres.

L’analyse par cytométrie en flux de microsphères de polystyrène de taille standard pour localiser la gamme de taille de 50 à 200 nanomètres dans le diagramme de diffusion avant par rapport au diagramme de dispersion latérale a révélé des signaux de particules distincts. R4, R5 et R6 se réfèrent aux positions des particules de 100, 200 et 300 nanomètres respectivement. R7 est le bruit électronique comme limite de détection pour les particules de 50 nanomètres et R8 représente la plage de position des particules de 50 à 200 nanomètres.

La distribution granulométrique du mélange de VE dérivé de cellules pancréatiques par analyse de suivi des nanoparticules, ou NTA, était dans la large gamme de 40 à 400 nanomètres après ultracentrifugation. Un tri cytométrique en flux a été effectué pour isoler et purifier le sEV de 50 à 200 nanomètres dans la région R8. La qualité de l’isolement a été vérifiée par la NTA et il a été constaté que la plage de taille des particules de sEV après tri était comprise entre 50 et 200 nanomètres.

La présence de sEV a également été observée par TEM et les sEV isolées ont été confirmées comme contenant des marqueurs de CD6, CD63 et CD81 par Western Blot. Cette méthode permet la séparation de petites vésicules extracellulaires et la classification ou l’analyse pro tem de l’expression génique de petites vésicules extracellulaires, ouvrant la voie à de nombreuses applications de recherche en aval.